二甲双弧对AMPK、PPARγ的影响与胰岛素抵抗的研究

分类号：Ｒ５８７．１学校代码：１００６２密级：内部２年学号：２００８４０１０学位类别：科学学位口专业学位团学科门类：医学又坪篑科鼻垮博士学位论文ＤＯＣＴＯＲＡＬＤＩＳＳＥＲＴＡＴＩＯＮ论文题目：二甲双胍对ＡＭＰＫ、Ｐ脚的影响与胰岛素抵抗的研究ＴＩＴＬＥＴｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｍｅｆｆｏｒｍｉｎｏｎＡＭＰＫ，ＰＰＡＲ？ａｎｄｉｎｓｕｌｉｎｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ一级学科：临床医学二级学科：内科学内分泌与代谢病论文作者：吴乃君指导教师：冯凭天津医科大学研究生院二０一一年五月学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是我个人在导师指导下独立进行研究工作取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容和致谢的地方外，论文中不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名：凸幺日期：）州年６月６日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解天津医科大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文，并编入有关数据库。保密本论文属于圈，在．兰．年解密后适用本授权书。不保密口。Ｉ’，Ｊ学位论文作者签名：导师签名厶！生日期：川年６月‘日同期：加，７年６月，同天津医科大学博士学位论文中又于两要目的：１、通过观察２型糖尿病模型大鼠脂肪组织中腺苷酸活化蛋白激酶（ＡＭＰＫ）、过氧化物酶体增殖物激活受体Ｙ（ＰＰＡＲ？）的表达，及二甲双胍对其影响，探讨二甲双胍改善糖、脂代谢、胰岛素敏感性机制，为二甲双胍的临床应用提供更多的理论依据。２、通过体外建立３Ｔ３．Ｌ１细胞胰岛素抵抗模型，应用二甲双胍进行干预治疗，观察胰岛素抵抗状态下ＡＭＰＫ、ＰＰＡＲ丫、葡萄糖转运子４（ＧＬＵＴ４）的表达情况，并观察二甲双胍对ＡＭＰＫ、ＰＰＡＲ？的作用，分析其对．胰岛素抵抗的干预作用是否与上调ＡＭＰＫ、ＰＰＡＲ？有关。方法：１、正常ｗｉｓｔａｒ雄性大鼠３０只普通饲料适应性喂养１周后，随机分为正常组（ＮＣ组）和糖尿病组（ＤＭ组）。ＮＣ组给予普通饲料至实验结束。ＤＭ组给予高脂饮食联合腹腔注射ｄ，Ｎ量链脲佐菌素（Ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ，ＳＴＺ）４０ｍｇ／ｋｇ的方法制备２型糖尿病模型，造模成功后随机分为模型组（ＤＭ．Ｃ）和治疗组（ＤＭ．Ｔ）。ＤＭ．Ｔ组给予盐酸二甲双胍（Ｍｅｔｆｏｒｍｉｎ，ｍｅｔ）灌胃治疗４周。测定大鼠治疗前后的体重，实验末测定各组大鼠肾周及睾周脂肪重量，计算大鼠脂体比；检测各组大鼠空腹血糖（ｆａｓｔｉｎｇｐｌａｓｍａｇｌｕｃｏｓｅ，ＦＰＧ）、胰岛素（ｉｎｓｕｌｉｎ，ＩＮＳ）、血清总胆固醇（ｔｏｔａｌｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ，ＴＣ）、甘油三酯（ｔｏｔａｌｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ，ＴＧ）、高密度脂蛋白（ｈｉｇｈｄｅｎｓｉｔｙｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ，ＨＤＬ。Ｃ）、低密度脂蛋白的水乎（Ｌｏｗｓｅｎｓｉｔｉｖｅｄｅｎｓｉｔｙｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ，ＬＤＬ．Ｃ），并计算胰岛素敏感指数（Ｆａｓｔｉｎｇ时荧光定量（ｒｅａｌｔｉｍｅ．ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｉｎｄｅｘ，ＩＳＩ）；实ｒｅａｃｔｉｏｎ，ＲＴ－ＰＣＲ）检测各组大鼠脂肪组Ｃｕｌｔｕｒｅ织ＡＭＰＫ及ＰＰＡＲＴｍＲＮＡ的水平。２、以美国国立细胞库（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，ＡＴＣＣ）３Ｔ３．Ｌ１细胞作为实验对象进行培养和诱导分化。参考ＡｎｉｌＫｕｍａｒＫＬ分化前脂肪细胞的方法，对细胞进行分化：将３Ｔ３。Ｌ１前脂肪细胞置于含１５％小牛血清的ＤＭＥＭ高糖培养基中，３７℃，５％Ｃ０２饱和湿度下培养。细胞状态良好时接种于培养皿，加入含０．５ｍｍｏｌ／Ｌ３．异丁基．１．甲基黄嘌呤（ＩＢＭＸ）、ｌＯｕｇ／ｍＬ胰岛素、ｌｕｍｏｌ／Ｉ地塞米松１５％小牛血清的ＤＭＥＭ高糖培养基培养４８ｈ，之后换以含１ｕｇ／ｍＬ胰岛素的培养基再培养４８ｈ，随后以１５％小牛血清的ＤＭＥＭ高糖培养基继续培养，２ｄ换培养液１次，诱导分化８～１２ｄ的３Ｔ３．Ｌ１细胞，８０％～９０％以上呈脂肪细胞表型可用于试验。运用油红Ｏ染色证明前脂肪细胞诱导成为成熟脂肪细胞：移去诱导分化结束细胞的培养基，用ＰＢＳ清洗，用１０％多聚甲醛固定３０ｍｉｎ，加入油红Ｏ溶液染色３０ｍｉｎ，用异丙醇脱色，天津医科大学博士学位论文然后用苏木精复染细胞核，倒置显微下观察、照相。３Ｔ３．Ｌ１脂肪细胞胰岛素抵抗细胞模型的建立及药物处理。对分化好的细胞分组进行处理：加ｌｕｍｏｌ／Ｌ地塞米松诱导胰岛素抵抗，每２ｄ换１次液，取上清液，以培养基中的葡萄糖的消耗量差值反映胰岛素抵抗的程度。葡萄糖含量用葡萄糖检测试剂盒测定。在胰岛素抵抗模型成立以后，设空白对照组、地塞米松模型组、药物干预组（不同浓度二甲双胍）在药物处理４８ｈ后检测培养基中葡萄糖含量，及ＡＭＰＫ、ＰＰＡＲ７、ＧＬＵＴ４ｍＲＮＡ水平。结果：高脂饮食配合小剂量链脲佐菌素制备糖尿病大鼠模型中，１、体重。二甲双胍治疗前ＤＭ大鼠体重比ＮＣ组大鼠体重显著升高（Ｐ＜０．０５）；二甲双胍治疗４周后，ＤＭ．Ｔ组大鼠与ＤＭ—Ｃ组之间比较，ＤＭ．Ｔ组大鼠体重下降明显减轻（Ｐ＜Ｏ．０５）。２、肾周、睾周脂肪组织重量及脂体比。与ＮＣ组比较，ＤＭ．Ｃ组肾周睾周脂肪组织重量和脂体比均显著下降（Ｐ＜０．０５）；与ＤＭ．Ｃ组比较，ＤＭ．Ｔ组肾周睾周脂肪组织重量显著增高（Ｐ＜Ｏ．０５），脂体比无显著性差异（Ｐ＞０．０５）。３、血糖、胰岛素水平及胰岛素敏感指数。与ＮＣ组比较，ＤＭ。Ｃ组和ＤＭ。Ｔ组大鼠血清ＦＰＧ水平显著升高（Ｐ＜Ｏ．０５），ＦＩＮＳ、ＩＳＩ显著下降（Ｐ＜０．０５）；与ＤＭ。Ｃ组比较，ＤＭ．Ｔ组血清ＦＰＧ显著下降（Ｐ＜０．０５），ＦＩＮＳ，ＩＳＩ水平显著升高（Ｐ＜Ｏ．０５）。４、血脂。与ＮＣ比较，ＤＭ—Ｃ组大鼠血清ＴＣ、ＴＯ、ＬＤＬ水平显著升高（Ｐ＜０．０５），ＨＤＬ水平显著Ｆ降（Ｐ＜Ｏ．０５）；与ＤＭ．Ｃ组比较，ＤＭ．Ｔ组血清ＴＣ、ＴＯ、ＬＤＬ水平显著下降（Ｐ＜０．０５），ＨＤＬ水平显著升高（Ｐ＜０．０５）。５、脂肪组织ＡＭＰＫ和ＰＰＡＲ７ｍＲＮＡ的水平。与ＮＣ组比较，ＤＭ—Ｃ、ＤＭ．Ｔ组ＡＭＰＫ与ＰＰＡＲ＂／ｒｍＲＮＡ表达水平均显著降低（Ｐ＜Ｏ．０５）；与ＤＭ．Ｃ组比较，ＤＭ—Ｙ组ＡＭＰＫ与ＰＰＡＲ＇ｔｒｍＲＮＡ表达水平均显著升高（Ｐ＜０．０５）。在３Ｔ３．Ｌ１脂肪细胞中１、３Ｔ３．Ｌ１前脂肪细胞经诱导、分化１０天，油红Ｏ染色，镜下可见细胞质内脂肪滴被染成红色，细胞核呈蓝色，证实为成熟脂肪细胞。２、在地塞米松模型组细胞上清培养液的葡萄糖吸光度ＯＤ值显著高于空白组（Ｐ＜Ｏ．０５），地塞米松作用后９６ｈ细胞上清培养液的葡萄糖差值最大（Ｐ＜０．０５），胰岛素抵抗达最佳状态。３、二甲双胍干预组培养液的葡萄糖吸光度ＯＤ值较模型组低（Ｐ＜Ｏ．０５）。４、地塞米松模型组的ＡＭＰＫ、ＰＰＡＲＶ、ＧＬＵＴ４ｍＲＮＡ水平显著低于空白组伊＜Ｏ．０５）。５、二甲双胍干预组ＡＭＰＫ、ＰＰＡＲｙ、ＧＬＵＴ４ｍＲＮＡ水平明显著高于模型组（Ｐ＜０．０５）。天津医科大学博士学位论文结论：高脂饮食配合小剂量链脲佐菌素制备糖尿病大鼠模型中，１、糖尿病大鼠脂肪组织ＡＭＰＫ及ＰＰＡＲ３，ｍＲＮＡ的水平下降。２、二甲双胍上调２型糖尿病大鼠脂肪组织ＡＭＰＫ及ＰＰＡＲ７ｍＲＮＡ的水平。３、二甲双胍改善糖尿病大鼠的糖、脂代谢及胰岛素抵抗。４、二甲双胍可能通过上调２型糖尿病大鼠脂肪组织ＡＭＰＫ及ＰＰＡＲ７ｍＲＮＡ，调节机体糖、脂代谢，增加胰岛素敏感性。在３Ｔ３．ＬＩ）Ｊ旨肪细胞中，１、地塞米松诱导的３Ｔ３．Ｌ１脂肪细胞葡萄糖摄取率下降。２、二甲双胍干预后３Ｔ３．Ｌ１脂肪细胞胰岛素抵抗模型中葡萄糖摄取率增加。３、地塞米松诱导的３Ｔ３。Ｌ１脂肪细胞胰岛素抵抗模型中ＡＭＰＫ、ＰＰＡＲ７、ＧＬＵＴ４ｍＲＮＡ水平下降；４、二甲双胍可以剂量依赖性上调胰岛素抵抗状态下３Ｔ３．Ｌ１细胞ＡＭＰＫ、ＰＰＡＲｌ，、ＧＬＵＴ４ｍＲＮＡ。５、二甲双胍可能通过上调３Ｔ３．ＬＩＪ］旨肪细胞中ＡＭＰＫ、ＰＰＡＲ７及ＧＬＵＴ４ｍＲＮＡ增加胰岛素敏感性。关键词：腺苷酸活化蛋白激酶过氧化物酶体增殖物激活受体丫糖尿病大鼠３Ｔ３．Ｌ１细胞胰岛素抵抗脂毒性二甲双胍天津医科大学博士学位论文Ａｂｓｔｒａｃｔｏｂｊｅｅｔｉｖｅ：１．Ｔｏ（ＡＭＰＫ）ａｎｄｏｂｓｅｒｖｅｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｓｏｆＡＭＰ—ａｃｔｉｖａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅａｄｉｐｏｓｅｔｉｓｓｕｅｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ－ａｃｔｉｖａｔｅｄｒｅｃｅｐｔｏｒ丫（ＰＰＡＲ７）ｉｎｏｎｏｆｔｙｐｅ２ｄｉａｂｅｔｅｓｗｉｔｈｍｅｔｆｏｒｍｉｎｔｒｅａｔｍｅｎｔ，ａｎｄｔｈｅｅｆｆｅｃｔｇｌｕｃｏｓｅａｎｄｌｉｐｉｄｍｅｔａｂｏｌｉｓｍｔｏｉｍｐｒｏｖｅｉｎｓｕｌｉｎｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ２．Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄｔｈｅｉｎｓｕｌｉｎｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｍｏｄｅｌｉｎｔｅｒｆｅｒｅｉｎｔｈｅａｄｉｐｏｃｙｔｅ，ｏｂｓｅｒｖｅｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｔｈｅｓａｍｅｔｉｍｅｉｎｖｉｔｒｏ，ｕｔｉｌｉｚｅｄｍｅｔｆｏｒｒｎｉｎｔｏＡＭＰＫ、ＰＰＡＲｒ、ＧＬＵＴ４，ａｔｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｔｏｏｂｓｅｒｖｅｄｔｈｅｅｆｆｅｃｔｔｈａｔｍｅｔｆｏｒｍｉｎＡＭＰＫ、ＰＰＡＲｙ，ａｎａｌｙｓｉｓｉｆｔｈｅｅｆｆｅｃｔｔｈａｔｍｅｔｆｏｒｍｉｎｉｍｐｒｏｖｅｉｎｓｕｌｉｎｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｈａｓｓｏｍｅｔｈｉｎｇｔｏｄｏｗｉｔｈｔｈｅｅｆｆｅｃｔｔｈａｔｉｔｉｎｃｒｅａｓｅｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＡＭＰＫ、ＰＰＡＲ７．Ｍｅｔｈｏｄｓ：１．Ｈｉ曲ｆａｔｄｉｅｔｗｉｔｈｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌｉｎｊｅｃｔｉｏｎｏｆＳＴＺ（４０ｍｇ／ｋｇ）ｗａｓｐｒｅｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｙｐｅ２ｄｉａｂｅｔｅｓｍｏｄｅｌ，ａｆｔｅｒｔｈｅｗｅｒｅｓｕｃｃｅｓｓｏｆｍｏｄｅｌｉｎｇ，ｄｉａｂｅｔｉｃｒａｔｍｏｄｅｌｇｒｏｕｐｒａｎｄｏｍｌｙｄｉｖｉｄｅｄｉｎｔｏｔｗｏｇｒｏｕｐ：ｄｉａｂｅｔｉｃｇｒｏｕｐ（ＤＭ—Ｃ）ａｎｄｔｒｅａｔｍｅｎｔ（ＤＭ—Ｄ．ＤＭ—Ｔｇｒｏｕｐｗａｓｇｉｖｅｎｍｅｔｆｏｒｍｉｎｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅｏｒａｌｌｙｆｏｒ４ｗｅｅｋｓ．Ｗｅｉｇｈｔｏｆｒａｔｓｗａｓｍｅａｓｕｒｅｄｂｅｆｏｒｅａｎｄａｆｔｅｒｔｒｅａｔｍｅｎｔ，ａｔｔｈｅｅｎｄｏｆｔｈｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｔｈｅｒａｔｓｗｅｒｅｍｅａｓｕｒｅｄｉｎａｄｉｐｏｓｅｐｅｒｉｒｅｎａｌａｎｄｔｅｓｔｉｓｗｅｉｇｈｔ．ＴｈｅｎｔｏＣａｌｃｕｌａｔｅｏｆｔｏｔａｌｂｏｄｙｗｅｉｇｈｔｒａｔｉｏｏｆｆａｔ．ＴｈｅｉｒｓｅｒｕｍｗｅｒｅｕｓｅｄＦａｓｔｉｎｇｔｏｄｅｔｅｃｔｏｆＦａｓｔｉｎｇｐｌａｓｍａｇｌｕｃｏｓｅ（ＦＰＧ），Ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ．ｓｅｒｕｍｉｎｓｕｌｉｎ（ＦＩＮＳ），ａｎｄＦａｓｔｉｎｇｓｅｎｓｉｔｉｖｅｉｎｄｅｘ（ＩＳＩ）ｗｅｒｅｔｏｔａｌｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ（ＴＣ），ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅｓ（ＴＧ），ｈｉｇｈｄｅｎｓｉｔｙｄｅｎｓｉｔｙｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ＨＤＬ），Ｌｏｗｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ＬＤＬ）ｌｅｖｅｌｓｄｅｔｅｃｔｔｈｅａｌｓｏｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔ；ｒｅａｌｔｉｍｅ－ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎａｎｄＰＰＡＲ７ｍＲＮＡａｄｉｐｏｓｅｔｉｓｓｕｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．２．ａｓｏｕｒ（ＲＴ．ＰＣＲ）ｔｏＡＭＰＫＣｈｏｓｅｔｈｅＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，３Ｔ３一Ｌ１ａｄｉｐｏｃｙｔｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｏｂｊｃｃｔｔｈａｎｃｕｌｔｕｒｅａｎｄｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ．ＲｅｆｅｒｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄｍｅｔｈｏｄｏｆＡｎｔｉＫｕｍａｒＫＬｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄｔｈｅａｄｉｐｏｃｙｔｅ．Ｃｕｌｔｕｒｅｄ３Ｔ３一Ｌ１ａｄｉｐｏｃｙｔｅｉｎｔｈｅＤＭＥＭｈｉｇｈｇｌｕｃｏｓｅｍｅｄｉｕｍｔｈａｔｃｏｎｔａｉｎｌ５％ｃａｌｆｓｅｒｕｍ，ａｎｄｔｈｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｏｆｔｈｅｅｖｉｄｅｎｃｅｉＳ３７’Ｃ，５％Ｃ０２ｗｈｅｎｔｈｅｃｅｌｌＷａｓｉｎｇｏｏｄｃｏｎｄｉｔｉｏｎ，ｐｕｔｉｔｔｏｃｕｌｔｉｖａｔｅｄｐｌａｔｅｓ，ｗｈｅｎｔｈｅｃｅｌｌｔｈｅｃｅｌｌｓｆｏｒ４８ｈｏｕｒｓｉｎｓｕｌｉｎ１ｕｍｏ／Ｌｕｓｅｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎａｆｔｅｒｔｗｏｄａｙｓ，ｃｕｌｔｕｒｅｃｏｎｔａｉｎ０．５ｔｈｅＤＭＥＭｍｅｄｉｕｍｔｈａｔｍｍｏｌ／ＬＩＢＭＸ１Ｏｍｇ／ＬＤｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ１５％ｃａｌｆＳｅｌＴｌｍ．ａｎｄｔｈａｎｃｈａｎｇｅｔｈｅＤＭＥＭｍｅｄｉｕｍｔｈａｔｃｏｎｔａｉｎ１Ｏｍｇ／Ｌｉｎｓｕｌｉｎ１／Ｍｍｏｌ／ＬＤＭＥＭｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ１５％ｃａｌｆｓｅｒｕｍ，ｃｕｌｔｉｖａｔｅｆｏｒ４８ｈｏｕｒｓ，ａｆｔｅｒｔｈａｔｃｕｌｔｕｒｅｗｉｔｈＩＶ天津医科大学博士学位论文ｆｏｒ８－１２ｄａｙｓ．Ｗｈｅｎｔｈｅｒｅａｒｅ９０％３Ｔ３一Ｌ１ｃｅｌｌｓｉｎｓｔｕｄｙ．ＵｓｅｏｉｌｒｅｄＯｔｏｉｍｐｒｏｖｅ３Ｔ３ｃｅｌｌｓｈａｄｍｅｄｉｕｍｃａｎｔｉｎａ１５％ｃａｌｆＳｅｌＭｌＴＩｂｅｃｏｍｅｍａｔｕｒｅａｄｉｐｏｃｙｔｅ，ｉｔＣａｎｕｓｅｔｈｅｃｅｌｌｓｂｙＰＢＳ，ｕｓｅｙｅｔｉｎｄｕｃｅｄｔｏｍａｔｕｒｅａｄｉｐｏｃｙｔｅ：Ｒｅｍｏｖｅ廿１ｅｏｌｄｍｅｄｉｕｍ；ｗａｓｈＣａ．ｆｏｒｍａｌｉｎｆｉｘａｔｉｏｎｆｏｒ３０ｍｉｎ；ａｎｄｍｏｖｅｏｉｌｒｅｄＯ‘ｄｙｅｉｎｇｆｏｒ３０ｒａｉｎ，ｒｅｍｏｖｅｏｉｌｒｅｄＯ．ａｖａｎｔｉｎｔｈｅｃｅｌｌｃｌｅａｎｔｈｅｒｅｓｔｏｉｌｒｅｄＯ，ｔｈａｎｃａｍｐｅａｃｈｙｄｙｅｉｎｇｔｈｅｃｅｌｌｎｕｃｌｅｕｓ，ｏｂｓｅｒｖｅａｐｐｅａｒａｎｃｅａｎｄｇｅｔｔｈｅｐｈｏｔｏｓ．３Ｔ３一Ｌ１ａｄｉｐｏｃｙｔｅｉｎｓｕｌｉｎｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｃｏｎｔａｉｎｍｏｄｅｌｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ．Ａｆｔｅｒｔｈｅｃｅｌｌｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．ｕｓｅＤＭＥＭｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅｔｏｍｅｄｉｕｍｔｈａｔｌｕｍｏＩ／Ｌｏｎｉｎｄｕｃｅｉｎｓｕｌｉｎｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｍｏｄｅｌ，ｃｈａｎｇｅｔｈｅｍｅｄｉｕｍｅｖｅｒｙｔｗｏｔｈｅ０１ｄｍｅｄｉｕｍｔｏｅｘａｌＴｌｔｈｅｄａｙｓ．ａｎｄｔｈａｎｕｓｅｃｏｎｓｕｍｐｔｉｏｎｏｆｇｌｕｃｏｓｅ，ｄｅｐｅｎｄｕｓｅｔｈｅｃｏｎｓｕｍｐｔｉｏｎｗｅｃａｎｊｕｄｇｅｔｈｅｌｅｖｅｌｏｆｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．ＷｅｔｈｅＧＯＤ＿ＰＯＤｋｉｔｔｏｅｘａｌＴｌｔｈｅｌｅｖｅｌｏｆｇｌｕｃｏｓｅｉｎｔｈｅｏｌｄｕｐｔｈｅａｄｉｐｏｃｙｔｅａｓｍｅｄｉｕｍ．Ｗｈｅｎｔｈｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｍｏｄｅｌｈａｓｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ，ｓｅｔｂｌａｎｋｇｒｏｕｐ，ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅｍｏｄｅｌｇｒｏｕｐ，ｍｅｔｆｏｒｍｉｎｔｒｅａｔｍｅｎｔｆｏｒ４８ｈｏｕｒｓ，ｅｘａｍｔｈｅｌｅｖｅｌｏｆｇｌｕｃｏｓｅｉｎｔｈｅｇｒｏｕｐ．Ａｆｔｅｒｍｅｔｆｏｒｍｉｎｈａｓｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎｍｅｄｉｕｍ，ｔｈａｎｅｘａｎ＇ｌｔｈｅｍＲＮＡｌｅｖｅｌｏｆＡＭＰＫ，ＰＰＡＲ－ｔａｎｄＧＬＵＴ４．Ｒｅｓｕｌｔｓ：ＩｎｄｉａｂｅｔｉｃｒａｔｓｆｅｄｗｉｔｈｈｉｇｈｆａｔｄｉｅｔａｎｄｉｎｊｅｃｔｅｄｗｉｔｈａｓｍａｌｌｄｏｓｅｏｆＳＴＺ：Ｔｈｅｌｅｖｅｌｏｆｈｅｉｇｈｔ，Ｆａｓｔｉｎｇｐｌａｓｍａｇｌｕｃｏｓｅ，ｂｌｏｏｄｌｉｐｉｄｏｆｔｈｅｄｉａｂｅｔｉｃｍａｒｋｅｌｙｉｎｃｒｅａｓｅｄｒｅｄｕｃｅｄａｓａｓｒａｔｓｗｅｒｅｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅＮＣｇｒｏｕｐ．ＩＳＩｏｆｔｈｅＤＭ—ＣｇｒｏｕｐｗａｓｗｉｔｈＤＭ－ＣｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅＮＣｇｒｏｕｐ．ＡｎｄｔｈｅＤＭ－ＴｇｒｏｕｐｃｏｍｐａｒｅａｎｄＰＰＡＲ７ｍＲＮＡｉｎａｄｉｐｏｓｅｔｉｓｓｕｅｗａｓｇｒｏｕｐ，ＡＭＰＫ＜ｏ．０５），ｓｅｒｕｍｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｉｎｃｒｅａｓｅｄ（ＰｈｉｇｈｄｅｎｓｉｔｙｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｌｅｖｅｌｗａｓＬＤＬｄｅｃｒｅａｓｅｄｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｈｉｇｈｅｒ（Ｐ＜０．０５）；ｓｅｒｕｍｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ（Ｐ＜０．０５）．Ｉｎ３Ｔ３－Ｌ１ｔｏｔａｌｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ，ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅｓｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅｍｏｄｅｌｇｒｏｕｐｉｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔａｄｉｐｏｃｙｔｅ：１．ｔｈｅａｂｓｏｒｂａｎｃｅｌｅｖｅｌＯＤｏｆｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｉｓｌｏｗｅｒｔｈｅｂｌａｎｋｇｒｏｕｐ（Ｐ＜０．０５）．２．ｔｈｅａｂｓｏｒｂａｎｃｅｍｏｄｅｌｌｅｖｅｌＯＤｏｆｍｅｔｆｏｒｍｉｎｇｒｏｕｐｔｈａｎｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅｇｒｏｕｐ（Ｐ＜０．０５）．３．ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｌｏｗｅｒＡＭＰＫ，ＰＰＡＲ－ｒ，ＧＬＵＴ４ｍＲＮＡｉｎｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅｍｏｄｅｌｇｒｏｕｐｉｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｔｈａｎｉｎｉｎｔｈｅｂｌａｎｋｍｅｔｆｏｒｍｉｎｇｒｏｕｐ（Ｐ＜０．０５）．４．ＴｈｅｇｒｏｕｐｉｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＡＭＰＫ，ＰＰＡＲ，ｙ，，ＧＬＵＴ４ｍＲＮＡｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈｅｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅｍｏｄｅｌｇｒｏｕｐ（Ｐ＜０．０５）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：ＩｎｄｉａｂｅｔｉｃｒａｔｓｆｅｄｗｉｔｈｈｉｇｈｆａｔｄｉｅｔａｎｄｉｎｊｅｃｔｅｄｗｉｔｈａｓｍａｌｌｄｏｓｅｏｆＳＴＺ：（１）ＡＭＰＫａｎｄＰＰＡＲ）＇ｍＲＮＡｗｅｒｅｌｏｗｉｎｄｉａｂｅｔｉｃｒａｔｓａｄｉｐｏｓｅｔｉｓｓｕｅ（２）Ｖ————————————————————————————————————————————————————————————一ＭｅｔｆｏｒｍｉｎｉｎｃｒｅａｓｅｄａｄｉｐｏｓｅｔｉｓｓｕｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＡＭＰＫａｎｄ天津医科大学博士学位论文Ｐ汹ｍＲＮＡ．（２）（３）Ｍｅｔｆｏｒｍｉｎｒｅｇｕｌａｔｅｄｇｌｕｃｏｓｅ，ｌｉｐｉｄｍｅｔａｂｏｌｉｓｍａｎｄｉｎｓｕｌｉｎｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．（４）Ｍｅｔｆｏｒｍｉｎｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｉｎｔｙｐｅ２ｄｉａｂｅｔｉｃｒａｔｓｍａｙｒｅｇｕｌａｔｅｇｌｕｃｏｓｅ，ｌｉｐｉｄｍｅｔａｂｏｌｉｓｍｂｙｉｎｃｒｅａｓｅｄａｄｉｐｏｓｅｔｉｓｓｕｅａｎｄｉｎｓｕｌｉｎ３Ｔ３－Ｌ１ＡＭＰＫａｎｄＰＰＡＲＹｍＲＮＡ．Ｉｎａｄｉｐｏｃｙｔｅ：（１）Ｔｈｅｔｈａｔｕｓｅｄｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅｇｌｕｃｏｓｅｉｎｔａｋｅｉｎ３Ｔ３一Ｌ１ａｄｉｐｏｃｙｔｅｉｎｄｕｃｅｄｉｎｔｏｉｎｓｕｌｉｎｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｍｏｄｅｌｉｓｌｏｗ．（２）ＭｅｔｆｏｒｍｉｎＣａｎｉｎｃｒｅａｓｅｔｈｅｇｌｕｃｏｓｅｉｎｔａｋｅｉｎ３Ｔ３．Ｌ１ａｄｉｐｏｃｙｔｅ．（３）ＴｈｅｍＲＮＡｏｆＡＭＰＫ，ＰＰＡ心，ＧＬＵＴ４ｉｎ３Ｔ３－Ｌ１ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｍｏｄｅｌｇｒｏｗｔｈａｄｉｐｏｃｙｔｅｔｈａｔｕｓｅｄｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅｉｎｄｕｃｅｄｉｎｔｏｉｎｓｕｌｉｎｌｏｗｅｒ．（４）ＭｅｔｆｏｒｍｉｎＣａｎａｄｉｐｏｃｙｔｅｔｈａｔｕｓｅｄｉｎｃｒｅａｓｅｔｈｅＡＭＰＫ，ＰＰ√峨，ＧＬＵＴ４ｍＲＮＡｉｎ３Ｔ３－Ｌ１ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅｉｎｄｕｃｅｄｉｎｔｏｉｎｓｕｌｉｎｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｍｏｄｅｌ・（５）ＭｅｔｆｏｍｉｎｍａｙｒｅｇｕｌａｔｅｉｎｓｕｌｉｎｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｂｙｉｎｃｒｅａｓｅｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＡＭＰＫ，ＰＰＡ脚ａｎｄＧｌｌＪＪＴ４ｍＲＮＡ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ＡＭＰＫｌｉｐｉｄｔｏｘｉｃｉｔｙＰＰＡＲ７ｍｅｔｆｏｒｍｉｎｄｉａｂｅｔｉｃｒａｔｓ３Ｔ３－Ｌ１ａｄｉｐｏｃｙｔｅｉｎｓｕｌｉｎｒｅｓｉｓｔａｎｃｅＶｌ天津医科大学博士学位论文目录中文摘要……………………………………………………………………………ＩＡｂｓｔｒａｃｔ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．Ⅳ缩略语说明…………………………………………………………………………Ⅸ前言…………………………………………………………………………………１。刖舌…………………………………………………………………………………研究现状、成果…………………………………………………………………１研究目的、方法…………………………………………………………………２一、二甲双胍对糖尿病大鼠脂肪组织ＡＭＰＫ、ＰＰＡＲ丫及糖脂代谢、胰岛素抵抗的影响……………………………………………………………………………．３１．１对象和方法…………………………………………………………………３１．１．１实验对象及材料………………………………………………………３１．１．２药品及试剂………………………………………………………………３１．１．３实验仪器设备……………………………………………………………４１．１．４实验步骤…………………………………………………………………４１．１．５统计学处理………………………………………………………………１０１．２结果…………………………………………………………………………１０１．２．１动物一般状态比较………………………………………………………】０１．２．２各组大鼠治疗前后体重比较……………………………………………１１１．２．３各组大鼠肾周、睾周脂肪重量及脂体比较……………………………１１１．２．４各组大鼠血糖、胰岛素、胰岛素敏感指数比较………………………１２１．２．５各组大鼠血脂比较………………………………………………………１２１．２．６大鼠脂肪组织ＡＭＰＫ、ＰＰＡＲｌｒｍＲＮＡ的水平………………………．．１２１．３讨论…………………………………………………………………………．１３１．４小结…………………………………………………………………………．１６二、二甲双胍对地塞米松诱导的３Ｔ３．Ｌ１细胞ＡＭＰＫ、ＰＰＡＲ７的影响…………………………………………………………………………………．１７２．１对象和方法…………………………………………………………………．１７２．１．１实验材料………………………………………………………………１７２．１．２主要试剂配制……………………………………………………………１８２．１．３实验方法………………………………………………………………１９ＶＩＩ天津医科大学博士学位论文２．１．４统计学处理……………………………………………………………２２２．２结果…………………………………………………………………………２３２．２．１３Ｔ３．Ｌ１前脂肪细胞的诱导分化及鉴定…………………………………２３２．２．２３Ｔ３．Ｌ１脂肪细胞胰岛素抵抗模型的建立……………………………２５２．２．３二甲双胍作用于胰岛素抵抗细胞后葡萄糖浓度测定………………２６２．２．４ＲｅａｌｔｉｍｅＩｍＰＣＲ结果…………………………………………………２７２．３讨论…………………………………………………………………………．３３２．４小结…………………………………………………………………………．３８ＡＭＰＫ、ＰＰＡＲ，、／与糖、脂代谢及胰岛素敏感性………………………………４７综述参考文献……………………………………………………………………．５３全文结论……………………………………………………………………………．３９论文创新点…………………………………………………………………………．４ｌ参考文献……………………………………………………………………………．４２发表论文和参加科研情况说明……………………………………………………．４６综ｊ苤…………………………………………………………………………………．４７致谢…………………………………………………………………………………．５８缩略词ＤＭ叁＠ＡＭＰＡⅣ咿ＫＰＰＡＲ７ＳＴＺＭｅｔＧＬＵＴ４ｍ砌、ＩＡＦＰＧＦＩＮＳＩＳｌＴＣＴＧＬＤＬＨＤＬ３Ｔ３．Ｌ１ＤＭＥＭＧＡＰＤＨＤＥＰＣＰＢＳＩＲＩＢＭＸＴｒｉｚｏｌＤＡＢＳＡＢＣＲＴ．ＰＣＲ天津医科大学博士学位论文缩略语说明英文全称中文全称ｄｉａｂｅｔｅｓｍｅｌｌｉｔｕｓ糖尿病ａｄｅｎｏｓｉｎｅｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ三磷酸腺苷ａｄｅｎｏｓｉｎｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ一磷酸腺苷ＡＭＰ—ａｃｔｉｖａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅ腺苷酸活化蛋白激酶ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ—ａｃｔｉｖａｔｅｄｒｅｃｅｐｔｏｒＹ过氧化物酶体增殖物激活受体Ｙｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ链脲佐菌素ｍｅｔｒｏｒｍｉｎ盐酸二甲双胍ｇｌｕｃｏｓｅｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ－４葡萄糖转运因子４ｍｅｓｅｎｇｅｒＲＮＡ信使ＲＮＡｆａｓｔｉｎｇｐｌａｓｍａｇｌｕｃｏｓｅ空腹血浆葡萄糖ｆａｓｔｉｎｇｉｎｓｕｌｉｎ空腹胰岛素ｆａｓｔｉｎｇｓｅｎｓｉｔｉｖｅｉｎｄｅｘ胰岛素敏感指数ｔｏｔａｌｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ总胆固醇ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ甘油ｊ酯Ｌｏｗｄｅｎｓｉｔｙｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ低密度脂蛋白ｈｉｇｈｄｅｎｓｉｔｙｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ高密度脂蛋白Ｆｏｒｍｅｒｆａｔｃｅｌｌｓ前脂肪细胞ｄｕｌｂｅｃｃｏ’Ｓｍｏｄｉｆｉｅｄｅａｇｌｅｍｅｄｉｕｍ高糖培养基Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃａｃｉｄｇｌｙｃｅｒｉｎａｌｄｅｈｙｄｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ磷酸甘油醛脱氢酶Ｃｏｋｅｅｔｈｙｌｃａｒｂｏｎａｔｅ水焦碳酸二乙酯Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ。ｂｕｆｆｅｒｅｄｓａｌｉｎｅ磷酸缓冲盐溶液Ｉｎｓｕｌｉｎｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ胰岛素抵抗Ｌ３一ｉｓｏｂｕｔｙｌ－１－ｍｅｔｈｙｌｙｅｌｌｏｗｐｕｒｉｎｅＬ３．异丁基－１一甲基黄嘌呤Ｐｒｏｔｅｉｎｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｇｕｉｄｅ蛋白抽提指南ＴｗｏａｍｉｎｏＬｉａｎＢｅｎＡｎ二氨基联苯胺Ｓｒｅｐｔａｖｉｄｉｎｂｉｏｔｉｎｃｏｍｐｌｅｘ生物素酶复合物ｒｅａｌｔｉｍｅ．ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ实时荧光定量ｌＸ天津医科大学博士学位论文．▲上－・Ｊ一刖吾研究现状、成果糖尿病已经成为严重危害人类健康的慢性非传染性疾病。糖尿病中９０％以上为２型糖尿病。２型糖尿病的发病机制尚未完全阐明。目前认为胰岛素抵抗是２型糖尿病发病的重要环节之一，这一点已为长期大量的研究所证实‘１捌。胰岛素抵抗（ＩｎｓｕｌｉｎＲｅｓｉｓｔａｎｃｅ，ＩＲ）是指胰岛素作用的靶器官对胰岛素作用的敏感性下降（表现为肝脏、肌肉、脂肪等外周组织对葡萄糖的代谢障碍），即正常剂量的胰岛素产生低于正常生物学效应的一种状态。ＩＲ不仅是２型糖尿病的发病基础，更是贯穿多种代谢相关疾病的主线，是连结它们的纽带，为这些疾病的共同病理生理基础。以往的胰岛素抵抗研究集中在靶器官及胰岛素受体方面，随着分子生物学研究方法和技术日新月异，人们发现脂肪组织不仅是能量储存单位，也是内分泌器官，其分泌的细胞因子在胰岛素抵抗发生、发展中扮演了重要角色［３１。二甲双胍作为双胍类１：３服药已有５０年历史，其可以降糖、降脂、改善胰岛素抵抗１４１。但其确切作用的分子机制尚不明确。腺苷酸活化蛋白激酶（ＡＭＰＫ）在调节体能量代谢的平衡方面起总开关作用。在保持细胞内能量平衡方面扮演了重要角色。ＡＭＰ／ＡＴＰ比值增加可使ＡＭＰＫ激活（需要ＡＭＰＫ１７２位Ｔｈｒ的磷酸化），ＡＭＰＫ的活化可促进ＡＴＰ合成代谢，抑制ＡＴＰ分解代谢，如脂肪酸氧化ｂ１。目前对ＡＭＰＫ在肝脏和骨骼肌中的作用已有较多研究。骨骼肌与肝脏ＡＭＰＫ激活后，通过抑制乙酰辅酶Ａ羧化酶（ＡＣＣ）的活性降低丙二酰辅酶的浓度来抑制脂肪酸合成，促进脂肪酸氧化［６，７１０脂肪组织中ＡＭＰＫ对脂肪代谢的作用很可能与其在肝脏和骨骼肌中扮演同样的角色。新近研究发现，二甲双胍是ＡＭＰＫ的靶分子，由于二甲双胍可以时间剂量依赖地增加ＡＭＰＫＴｎ１７２残基的磷酸化哺１，是否二甲双胍在脂肪组织中也可能有相似的通过增加ＡＭＰＫ的表达而改善胰岛素抵抗作用？关于此方面的研究目前仍然较少。有研究提示，ＡＭＰＫ可能通过远离磷脂酰肌醇３．激酶作用位点的胰岛素信号通路，或者是一条非胰岛素激活的信号通路，激活脂肪细胞ＧＬＵＴ４的转位，从而增加葡萄糖的转运，脂肪组织的葡萄糖代谢发生胰岛素抵抗最主要表现为葡萄糖转运子４（ＧＬＵＴ４）表达下降，最终引起葡萄糖摄取率下降吟１。ＧＬＵＴ４是胰岛素作用下主要的葡萄糖运载体，主要存在于脂肪组织和骨骼肌中。在胰岛素抵抗状态下，ＧＬＵＴ４的表达表现出明天津医科大学博士学位论文显的组织特异性调节，即在脂肪细胞中，出现基因转录障碍表达下降。ＰＰＡＲ），是一种核受体转录因子，人体很多组织都能分泌ＰＰＡＲ３，，但以脂肪组织最多。动物实验表明，脂肪细胞中ＰＰＡＲＴ被激活后，可诱导内脏和皮下大脂肪细胞的凋亡，皮下脂肪内的前脂肪细胞分化为成熟的脂肪细胞，小脂肪细胞数目增加，对胰岛素更敏感，促使依赖胰岛素的糖摄取增加而脂肪水解减少，胰岛素敏感性增高¨∞。一些对血糖平衡起作用的组织如肝脏、肌肉组织和脂肪组织都会对活性ＰＰＡ脚敏感。另外，ＰＰＡＲ），作为决定脂肪细胞分化的主要调节者，衰老后脂肪组织ＰＰＡ脚表达降低可能通过降低脂肪细胞分化能力，使得对胰岛素敏感的脂肪细胞数目减少而参与胰岛素抵抗的形成。国外有研究认为ＡＭＰＫ活化可通过激活ＰＰＡＲａ和ＰＰＡＲ），的复合激活子．Ｉ（ＰＧＣ一１）增加小鼠骨骼肌细胞的脂肪酸氧化ｉ１１］。国内有学者报导在肝脏组织中二甲双胍增强ＡＭＰＫ和ＰＰＡ脚的表达和活性¨扣，尚未见到在脂肪组织中胰岛素抵抗状态下ＡＭＰＫ、ＰＰＡＲ・／表达及二甲双胍影响的研究。研究目的、方法基于以上的研究背景，为了更好的观察胰岛素抵抗状态下ＡＭＰＫ、ＰＰＡＲ，、／水平变化的情况以及二甲双胍药物干预对抵抗状态下ＡＭＰＫ、ＰＰＡ脚表达的影响，我门进行了体内外实验。体内实验选用了高糖、高脂辅与小剂碹ＳＴＺ建立２型ＤＭ模型；体外试验采用的是前脂肪细胞株３Ｔ３一Ｌｌ细胞，并进一步诱导成为成熟脂肪细胞，建立体外胰岛素抵抗模型。从体内、体外两方面探讨二甲双胍对ＡＭＰＫ、ＰＰＡ脚的影响及在胰岛素抵抗中的可能机制，为临床上治疗胰岛素抵抗提供新的思路。天津医科大学博士学位论文一、二甲双胍对糖尿病大鼠脂肪组织ＡＭＰＫ、ＰＰＡＲｌ＇及糖脂代谢、胰岛素敏感性的影响一、二甲双胍对糖尿病大鼠脂肪组织ＡＭＰＫ、ＰＰＡ研及糖脂代谢、胰岛素敏感性的影响二甲双胍能够改善糖、脂代谢及胰岛素敏感性，但其确切分子机制尚不明确。以往的研究多集中在肝脏、骨骼肌方面，在脂肪组织中的研究不多，结论亦不一致。本文拟从动物实验方面观察二甲双胍对糖尿病大鼠脂肪组织ＡＭＰＫ（腺苷酸活化蛋白激酶）、ＰＰＡＲｌ，（过氧化物酶体增值物激活受体Ｔ）水平的变化，及其对胰岛素抵抗的影响。１．１对象和方法１．１．１实验动物及饲料ＳＰＦ级健康雄性Ｗｉｓｔａｒ大鼠３０只（由华北煤炭医学院动物中心提供），４．－－一６周龄，动物合格证号ＳＣＸＫ（京）２００９。０００４，体重为１２０＋２０９。饲养环境所有大鼠均为分笼饲养，每５只为一笼，饲养室温波动在１８—２２。Ｃ之间，相对湿度保持在４０％．７０％之问，每日１２ｈ光照周期，通风良好。自由摄食，饮水。普通大鼠饲料（配方：玉米、面粉、豆粕、麸皮、豆粉、鱼粉、苜蓿草粉、大、小鼠专用维生素、矿物质预混料）；高脂饲料（配方：脂肪１７１８．６４ｋｃａｌ／Ｋｇ，蛋白６９５．２８ｋｃａｌ／Ｋｇ，碳水化合物１７５７．８ｋｃａｌ／Ｋｇ），以上均由华北煤炭医学院实验动物中心提供。北京博爱港商贸中心。北京博爱港商贸中心。北京北实纵横科技发展有限公司。中美上海施贵宝制药有限公司。北京北方生物技术研究所。波音特生物科技（南京）有限公司。波音特生物科技（南京）有限公司波音特生物科技（南京）有限公司波音特生物科技（南京）有限公司波音特生物科技（南京）有限公司。１．１．２药品及试剂１、ＳＴＺ（链脲佐菌素）２、柠檬酸盐缓冲液３、Ｏ．３％戊巴比妥钠４、盐酸二甲双胍片５、胰岛素放射免疫分析试剂盒６、血清总胆固醇检测试剂盒７、甘油三酯检测试剂盒８、高密度脂蛋白检测试剂盒９、低密度脂蛋白检测试剂盒１０、血糖检测试剂盒天津医科大学博士学位论文一、二甲双胍对糖尿病大鼠脂肪组织ＡＭＰＫ、ＰＰＡＲ？及糖脂代谢、胰岛素敏感性的影响１１、ＳＹＢＲＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＲＴ．ＰＣＲｋｉｔＩＩ（ｐｅｒｆｅｃｔｒｅａｌｔｉｍｅ）１２、ｔｒｉｚｏｌ总ＲＮＡ提取剂１３、引物１４、ＤＥＰＣ水１５、异丙醇１６、无水乙醇１７、氯仿１８、生理盐水１．１．３实验仪器及设备唐博士ＡＧＭ．２３００型血糖仪唐博士血糖试纸ＪＭ系列电子计数天平日立７１８０全自动生化分析仪ＢＦＸ４．３２０型低速自动平衡离心机ＨＨ一６数显恒温水浴锅ＦＴ．６３０Ｇ微机多探头放免仪超净工作台高速低温离心机ＲＴ６０００电子天平ＪＡ２００３液氮灌一次性研磨棒枪头Ｅｐ管试管架反转录仪ＰＣＲ仪超低温冰箱注射器，各种手术器械１．１．４实验步骤大连宝生物工程有限公司。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ公司上海生物工程有限公司天津润泰科技发展有限公司。北京百泰克生物技术有限公司北京百泰克生物技术有限公司华北煤炭医学院试验中心提供华北煤炭医学院试验中心提供北京唐博士医学科技有限公司ＡｌｌＭｅｄｉｃｕｓ有限公司浙江余姚纪铭称重校验设备有限公司日本日立公司白洋离心机厂国华电器有限公司北京核仪器厂Ｆｏｒｍａｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃｃｏｍｐａｎｙｓｏｒｖａｌｌ上海精科天平仪器厂四川亚西机械厂天津浩连科技发展有限公司天津润泰科技发展有限公司天津润泰科技发展有限公司天津润泰科技发展有限公司Ｒｏｔｏｒ．Ｇｅｎｅ３０００ＡＴｅｃｈｎｅＴＣ．５１２ｔｈｅｒｍｏＦｏｒｍ华北煤炭医学院内分泌科室提供天津医科大学博士学位论文一、二甲双胍对糖尿病大鼠脂肪组织ＡＭＰＫ、ＰＰＡＲｌ，及糖脂代谢、胰岛素敏感性的影响１．１．４．１实验药品准备０．１ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ４．２．４．５）的柠檬酸．柠檬酸钠缓冲液的配制：称取柠檬酸（Ｃ６Ｈ８０７．Ｈ２０－分子量２１０．１４）２．１９加入双蒸水１００ｍｌ中配成０．１ｍｍｏｌ／Ｌ柠檬酸Ａ溶液，柠檬酸钠（Ｎａ３Ｃ６Ｈ５０７．２Ｈ２０－分子量２９４．１２）２．９４９加入双蒸水１００ｍｌ中配成Ｏ．１ｍｍｏｌ／Ｌ柠檬酸钠Ｂ溶液，将Ａ、Ｂ液按比例混合，调ｐＨ值为４．２．４．５，混合后过滤，取滤液高温高压灭菌后，４。Ｃ冷藏备用。ＳＴＺ，使用时用Ｏ．１ｍｍｏｌ／Ｌ的柠檬酸一柠檬酸钠缓冲液将其稀释为１％的浓度，根据用药量和大鼠体重计算出每只大鼠需要注射的ＳＴＺ药量。盐酸二甲双胍配制：将盐酸二甲双胍片研磨，按临床常用剂量换算后ＤＭ．Ｔ组按每日５００ｍｇ／ｋｇ体重剂量给药，用２ｍｌ蒸馏水配制成悬浊液，用时摇匀给大鼠灌胃治疗。１．１．４．２动物分组及模型的建立正常ｗｉｓｔａｒ雄性大鼠３０只普通饲料适应性喂养１周后，随机分为正常组（ＮＣ，ｎ＝１０）和高脂组（ＤＭ，ｎ＝１０）。ＮＣ组给予普通饲料至实验结束。ＤＭ组给予高脂饲料喂养４周后，此组大鼠禁食不禁水１２ｈ，左侧腹腔一次性注射小剂量ＳＴＺ４０ｍｇ／ｋｇ以制备２型糖尿病大鼠模型（ＮＣ组仅给予柠檬酸钠．柠檬酸缓冲液等体积腹腔注射），ＤＭ组注射ＳＴＺ后继续给予高脂饲料喂养，５天之后，使用血糖仪测定尾尖血糖，血糖＞１６．７ｍｍｏｌ／Ｌ即可视为造模成功。将造模成功大鼠随机分为糖尿病模型组（ＤＭ—Ｃ，ｎ＿９）和糖尿病治疗组（ＤＭ．Ｔ，ｎ＝９），ＤＭ．Ｔ组给予二甲双胍片５００ｍｇ／ｋｇ每日灌胃治疗１次，共４周，（ＮＣ组及ＤＭ．Ｃ组给予相应等体积Ｏ．９％生理盐水）。此后所有大鼠均以普通饲料喂养，ＮＣ组大鼠每三天清理鼠笼一次，ＤＭ．Ｃ组与ＤＭ．Ｔ组每日清理鼠笼一次，所有大鼠每日灌胃１次，每周测量血糖１次，每周称重１次，根据体重情况调整用药量。治疗过程中ＤＭ。Ｃ组因血糖过高死亡１只，，ＤＭ—Ｔ组在灌胃过程中死亡１只，最后纳入分析的大鼠：ＮＣ组１０只、ＤＭ—Ｃ组８只、ＤＭ．Ｔ组８只。１．１．４．３取材及处理灌胃４周后停药，各组大鼠禁食１２小时后，称取大鼠体重，使用０．３％戊巴比妥钠，以ｌｍｌ：１００９比例对大鼠进行腹腔麻醉。麻醉成功后，将大鼠仰卧固定于手术台上，四肢及头部固定，取腹部正中线切口，自腹部剪开皮肤，充分暴露内脏，迅速行腹主动脉采血６－８ｍｌ，先后收集黄色抗凝管和绿色抗凝管各３ｍｌ天津医科大学博士学位论文糖脂代谢、胰岛素敏感性的影响～、二甲双胍对糖尿病大鼠脂肪组织ＡＭＰＫ、ＰＰＡＲＴ及静置，将血液标本送华北煤炭医学院附属医院检验科，在低温下３０００转／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，分离血清进行空腹血糖、总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、血清胰岛素的检测。采血结束后，快速取大鼠肾周及睾周脂肪组织称重并记录数值，并于预冷的生理盐水中冲洗干净，用无菌无酶的镊子放于冻存管中，做好标记，立即将冻存管置于液氮中速冻保存。待标本全部采集完毕后，将组织标本转移至．８０。Ｃ超低温冰箱中保存，以备进行ＲＴ．ＰＣＲ使用。断椎处死动物。１．１．４．４实验室指标的测定血糖的测定：采用唐博士血糖仪及唐博士血糖试纸采用葡萄糖氧化酶法测定总胆固醇测定：由华北煤炭医学院附属医院检验科采用日立７１８０全自动生化分析仪进行检测。甘油三酯测定：由华北煤炭医学院附属医院检验科采用日立７１８０全自动生化分析仪进行检测。低密度脂蛋白测定：由华北煤炭医学院附属医院检验科采用日立７１８０全自动生化分析仪进行检测。高密度脂蛋白测定：由华北煤炭医学院附属医院检验科采用日立７１８０全自动生化分析仪进行检测。胰岛素水平测定：采用北京北方生物技术研究所生产的Ｉｎｓ放射免疫分析药盒使用放射免疫分析法（ＲＩＡ）进行测定。胰岛素敏感指数ＩＳＩ＝Ｌｎ［１／（空腹血糖Ｘ空腹胰岛素）］脂体比＝（肾周脂肪组织重量＋睾周脂肪组织重量）／大鼠体重脂肪组织ＡＭＰＫ及ＰＰＡＲＴｍＲＮＡ水平测定：采用ＲＴ．ＰＣＲ方法检测。脂肪组织总ＲＮＡ提取步骤１）取１５０．２００ｍｇＪ］旨肪组织，放入无酶ＥＰ管中，使用一次性研磨棒研磨组织，同时少量多次加入液氮，研磨至粉末状。２）加入ｌｍｌｔｒｉｚｏｌ试剂，混匀，冰上放置５分钟。３）４。Ｃ１２０００转离心１５分钟，吸取下层液体转移至另－－ＥＰ管４）氯仿０．２ｍｌ，震荡１５秒，冰上放置５分钟５）４。Ｃ１２０００转离心１５分钟，吸取上层水相转移至ｌｍｌＥＰ（勿吸取中间层６）加入等体积异丙醇，轻混匀，冰上放置１０分钟天津医科大学博士学位论文一、二甲双胍对糖尿病大鼠脂肪组织ＡＭＰＫ、ＰＰＡＲ７及糖脂代谢、胰岛素敏感性的影响７）４＂０１２０００转离，５，１０分钟，可见管壁或管底附有白色沉淀物８１弃上清，加入ｌｍｌＤＥＰＣ处理水配制的７５％乙醇９）４＂Ｃ７５００转离心５分钟，１０）吸去上清，在空气中干燥５．１０分钟，加入２０ｕｌＤＥＰＣ处理水，于．８０＂０冰箱保存备用逆转录反应①按ＳＹＢＲＰｒｅｍｉｘＥｘＴａｑＩＩ（ＰｅｒｆｅｃｔＲｅａｌＴｉｍｅ）（ＴａＫａＲａＣｏｄｅ：ＤＲＲ０８１）试剂盒的操作说明书配制ＲＴ反应液（反应液配制请在冰上进行）。总反应体系１０ｕｌ，含５×ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ５０Ｂｕｆｆｅｒ２ｕｌ，ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＲＴＥｎｚｙｍｅＭｉｘ０．５ｕｌ，ｌｘＭＯｌｉｇｏｄＴＰｒｉｍｅｒＯ．５ｕｌ，１００“ＭＲａｎｄｏｍ６ｍｅｒｓ０．５ｕｌ，ＲＮａｓｅＦｒｅｅｄＨ２０２．５ｕｌ，加入总ＲＮＡ４②反应条件．２０℃保存Ｒｅａｌｔｉｍｅｕｌ１５ｍｉｎ８５。ＣＲＴ热循环程序３７。Ｃ５ｓｅｃ，反应结束ｅＤＮＡ产物置ＰＣＲ反应ＯＰＣＲ弓Ｉ物设计与合成检索ＮＣＢＩＧｅｎｅＢａｃｋ数据库，以ＧＡＤＰＨ作为内参对照的校准基因，并对设计引物评分，所有引物均具有种属特异性，片段非特异性扩增少，所有引物按照ＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ引物设计原则由上海生物工程技术服务有限公司设计并合成引物。引物序列如下：ＡＭＰＫ上游引物ｇｇｔｇｔｔａｔｃｃｔｇｔａｔｇｃｃｃｔｔｃｔ，ＡＭＰＫ下游引物ｔｇｔｃｔｔｔｇａｔａｇｔｔｇｃｔｃｇｃｔｔｃ，ＰＰＡＲ７上游弓Ｉｃｔｔｔａｃｃａｃｇｇｔｔｇａｔｔｔｃｔｃ，ＰＰＡＲ７下游引物ｃａｇｇｃｔｃｔａｃｔｔｔｇａｔｃｇｃａ，ＧＡＤＰＨ上游引物ａｔｇａｃｇａｃａｔｃａａａａｇｇｔｇｇ，ＧＡＤＰＨ下游引物ｇｇｇａｔｇｇａａａｃｔｇｔｇａａｇａｇｇ，②按ＳＹＢＲＰｒｅｍｉｘＥｘＴａｑＩＩ（ＰｅｒｆｅｃｔＲｅａｌＴｉｍｅ）（ＴａＫａＲａＣｏｄｅ：ＤＲＲ０８１）试剂盒的操作说明书配置ＰＣＲ反应液。２×ＳＹＢＲＰｒｅｍｉｘＥｘＴａｑＩＩ（反应液配制请在冰上进行）１２．５斗ｌ，上游引物１ｕｌ，下游引物ｌｕｌ，ｄＨ２０８．５ｕｌ，模ＰＣＲ，扩增条件如表１，板ｃＤＮＡ２ｕｌ③反应条件使用Ｒｏｔｏｒ．Ｇｅｎｅ３０００型ＰＣＲ仪进，行ｒｅａｌ扩增图像如图２ｔｉｍｅｂ天津医科大学博士学位论文糖脂代谢、胰岛素敏感性的影响——一、二甲双胍对糖尿病大鼠脂肪组织ＡＭＰＫ、ＰＰＡＲ？及图１大鼠饲养及取材流程图一、二甲双胍对糖尿病大鼠脂肪组织ＡＭＰＫ、ＰＰＡＲ］＇及天津医科大学博士学位论文糖脂代谢、胰岛素敏感性的影响表１ｒｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ反应体系图２ＡＭＰＫ，ＰＰＡＲｌ，及ＧＡＤＰＨ的扩增曲线此图由左至右的９条Ｓ状抛物线依次是ＤＭ．Ｔ组ＧＡＤＰＨ，ＤＭ—Ｃ组ＧＡＤＰＨ，ＮＣ组ＧＡＤＰＨ的扩增曲线，ＤＭ．Ｔ组ＰＰＡＲ＂ｔ，ＤＭ．Ｃ组ＰＰＡＲＶ，ＤＭ．Ｔ组ＡＭＰＫ的扩增曲线，ＮＣ组ＡＭＰＫ，ＤＭ．Ｃ组ＡＭＰＫ，ＮＣ组ＰＰＡ聊的扩增曲线，ＣＴ值均９０，均阳性，抛物线平滑，基线平坦，并经指数扩增期依次达平台期。由于反应体系中ｅＤＮＡ原始浓度不一致，ＤＭ．Ｔ组与ＮＣ组起始浓度大致相似，ＤＭ．Ｔ组与ＮＣ组ＣＴ值也相差不大，ＤＭ．Ｃ组起跳循环数（ＣＴ值）相对小，与起始浓度相对高有关。④绘制标准曲线取正常组ｃＤＮＡ，用ＤＥＰＣ处理水，按１０倍梯度１００１０１１０３１０４１０５稀释５个浓度，９天津医科大学博士学位论文一、二甲双胍对糖尿病大鼠脂肪组织ＡＭＰＫ、ＰＰＡＲ），及糖脂代谢、胰岛素敏感性的影响放于５个不同的ＥＰ管中。每对引物及内参均按照ＰＣＲ反应体系包括：２ｘＳＹＢＲＰｒｅｍｉｘＥｘＴａｑＩＩ１２．５ｍ，上游引物１ｕ１，下游引物１ｕ１，ｄＨ２０８．５ｕｌ，模板ｃＤＮＡ２ｕｌ，在５个不同浓度的ｃＤＮＡ中扩增，共１５管，并按照上述反应条件扩增，得到扩增曲线，使用Ｒｏｔｏｒ－Ｇｅｎｅ３０００６．０．１４版软件绘制标准曲线如下图３，４ｌ，／：ｌ“ｏｏ——ｒｌｏ＾ｏｌＬ／■…ｌｏ＾位’／：／：１００３Ｃ０ｔｌ∞ｔｌｌｔ｜ｌｌＯｎ／Ｃｙｃｈｇ九ＦＡＨ播婶ｒ怖＂１）Ｒ－乱９９１７１……！……．Ⅳ２－０９３３４９Ｕ－３０１９Ｂ０７“ｌＥｆｆｃａｅｎ甜ｈ‘３图３ＡＭＰＫ与内参的杯准曲线内参Ｍ值＝３．０９０，Ｍ值差值＜０．１注：ＡＭＰＫＭ值＝３．０１９一二／卜００＿／／１旷０２／：厂／：：绷：Ｉ：ｌ：ｌＣｙｃｋｌ９ＡＦＡ／，＂Ｓｙｂｆ（Ｐａｇｅ２ＸＲ－Ｇ９ｅ＂ＯＲ＾２－００Ｇｇ＇Ｊ９Ｕ－３０９０１０＂０３ＣｏｎｃｅｎｔｒａＵｏｎＢ＿７舟４９ＥＩｆｌＣＭＭＩＣｙ－－．５３１０‘０１图４ＰＰＡＲ？与内参的标准曲线内参Ｍ值＝３．０９０，Ｍ值差值＜Ｏ．１注：ＰＰＡＲＴＭ值＝３．１１４结果分析由标准曲线可知，内参与ＡＭＰＫ的标准曲线的Ｍ值差值＜０．１，同样内参与ＰＰＡＲ？的标准曲线的Ｍ值差值＜０．１，适宜使用２以＾ｃ’。方法利用进行相对定量的比较，以分析目的基因的上下调情况。使用Ｒｏｔｏｒ．Ｇｅｎｅ出比较结果。△ＣＴ（域循环数）＝ＣＴ（目的基因）．ＣＴ（内参基因），△△ＣＴ＝△ＣＴ（模型组或治疗组）一ＡＣＴ（正常组），差别倍数＝２氓＾ａ’，汇常组为１。１．１．５统计学处理采用ＳＰＳＳｌ０．０软件进行数据分析，所有数据以ｘ±Ｓ表示，组间差异比较采用ｔ检验和方差分析。Ｐ＜０．０５差异有统计学意义３０００６．０．１４版软件自动得１．２结果１．２．１动物一般状态比较正常组大鼠一般状态良好，实验过程中体重逐渐增加，饮食、饮水、尿量ｌＯ天津医科大学博士学位论文糖脂代谢、胰岛素敏感性的影响一、二甲双胍对糖尿病大鼠脂肪组织ＡＭＰＫ、ＰＰＡＲｌ，及无明显变化。造模后，糖尿病模型大鼠消瘦，毛色杂乱无光泽，精神萎靡，行动迟缓，反应迟钝，出现不同程度的多饮、多食、多尿症状。用药治疗期间，模型组大鼠仍然出现多饮、多尿等，且持续消瘦。二甲双胍治疗组与模型组相比较，大鼠多饮、多食、多尿、消瘦症状均有所减轻。１．２．２各组大鼠不同时间体重比较６周时（治疗前），ＤＭ．Ｃ组和ＤＭ．Ｔ组体重均明显高于ＮＣ组（Ｐ＜Ｏ．０５），而ＤＭ．Ｃ组与ＤＭ．Ｔ组两组间体重无差异（Ｐ＞０．０５）。１０周时（治疗后），与ＮＣ组比较，ＤＭ。Ｃ组与ＤＭ．Ｔ组体重均显著下降（Ｐ＜Ｏ．０５）；与ＮＣ组比较，ＤＭ．Ｃ组体重下降幅度较ＤＭ．Ｔ组下降幅度大，ＤＭ．Ｔ组体重偏高（Ｐ＜０．０５）。（见．表２）表２各组大鼠不同时间体重的比较（ｉ±Ｓ）注：与ＮＣ组比较，半Ｐ＜０．０５；与ＤＭ．Ｃ组比较ｕＰ＜０．０５；与造模后比较，存Ｐ＜０．０５１．２．３各组大鼠肾周、睾周脂肪组织重量及脂体｝匕比较与ＮＣ组比较，ＤＭ—Ｃ组肾周睾周脂肪组织重量和脂体比均显著下降（Ｐ＜０．０５）：与ＤＭ．Ｃ组比较，ＤＭ．Ｔ组肾周睾周脂肪组织重量增高（Ｐ＜０．０５），脂体比无显著差异（Ｐ＞Ｏ．０５）。（见表３）表３ｌＯ周时各组大鼠肾周睾周脂肪组织重量及脂体比较注：与ＮＣ组比较，水尸＜０．０５；与ＤＭ．Ｃ组比较，ｏＰ＜０．０５天津医科大学博士学位论文一、二甲双胍对糖尿病大鼠脂肪组织ＡＭＰＫ、ＰＰＡＲ３，及糖脂代谢、胰岛素敏感性的影响１．２．４各组大鼠血糖，胰岛素水平及胰岛素敏感性比较与ＮＣ比较，ＤＭ．Ｃ组大鼠血糖水平明显升高（Ｐ＜０．０５），胰岛素水平，ＩＳＩ明显下降（Ｐ＜０．０５）；与ＤＭ．Ｃ组比较，ＤＭ．Ｔ组血糖水平明显下降（Ｐ＜Ｏ．０５），胰岛素水平，ＩＳＩ明显升高（Ｐ＜ｏ．０５）。（见表４）表４１０周时各组大鼠血糖，胰岛素水平及胰岛素敏感性比较注：与ＮＣ组比较，’Ｐ＜０．０５；与ＤＭ—Ｃ组比较，“Ｐ＜０．０５１．２．５各组大鼠血脂的比较与ＮＣ比较，ＤＭ．Ｃ组、ＤＭ．Ｔ大鼠血清ＴＣ、ＴＧ、ＬＤＬ水平明显升高（Ｐ＜０．０５），ＨＤＬ水平明显下降（Ｐ＜Ｏ．０５）；与ＤＭ。Ｃ组比较，ＤＭ．Ｔ组血清ＴＣ、ＴＧ、ＬＤＬ水平明显下降（Ｐ＜０．０５），ＨＤＬ水平明显升高（Ｐ＜Ｏ．０５）。表５１０周时各组大鼠血脂的比较（Ｘ±Ｓ）（见表５）注：与ＮＣ组比较，＋Ｐ＜０．０５；与ＤＭ—Ｃ组比较，。Ｐ＜０．０５１．２．６大鼠脂肪组织ＡＭＰＫ和ＰＰＡＲＹｍＲＮＡ的表达与ＤＭ—Ｃ组比较，ＤＭ．Ｔ组ＡＭＰＫ与ＰＰＡＲｌ，ｍＲＮＡ表达水平均显著升高（Ｐ＜Ｏ．０５）（见表６）１２一、二甲双胍对糖尿病大鼠脂肪组织ＡＭＰＫ、天津医科大学博士学位论文糖脂代谢、胰岛素敏感性的影响ＰＰＡＲ丫及表６１０周时大鼠脂肪组织ＡＭＰＫ和ＰＰＡＲＩ，ｍＲＮＡ的２也△ｃＴ值（ｉ±ｓ）注：与ＮＣ组比较，’Ｐ＜０．０１：与ＤＭ．Ｃ组比较，・Ｐ＜０．０１—．。．。．．。．。．。．。．．，．，．．。．．．．．。．。。．。．．。．，。．。．！；：！：！：ｊ！ｉ：。。．．．．．．。．．．。．。．。．。．．．．．．．．。一—．．ｊ图４ＡＭＰＫ、ＰＰＡＲＴ及ＧＡＤＰＨ的扩增曲线此图由左至右的９条Ｓ状抛物线依次是ＤＭ．Ｔ组ＧＡＤＰＨ，ＤＭ．Ｃ组ＧＡＤＰＨ，ＮＣ组ＧＡＤＰＨ的扩增曲线，ＤＭ．Ｔ组ＰＰＡＩⅥ，ＤＭ。Ｃ组ＰＰＡＲＴ，ＤＭ．Ｔ组ＡＭＰＫ的扩增曲线，ＮＣ组ＡＭＰＫ，ＤＭ．Ｃ组ＡＭＰＫ，ＮＣ组ＰＰＡＲ＇／的扩增曲线，ＣＴ值均＜３０，均阳性，抛物线平滑，基线平坦，并经指数扩增期依次达平台期。由于反应体系中ｅＤＮＡ原始浓度不一致，ＤＭ．Ｔ组与ＮＣ组起始浓度大致相似，ＤＭ．Ｔ组与ＮＣ组ＣＴ值也相差不大，ＤＭ．Ｃ组起跳循环数（ＣＴ值）相对小，与起始浓度相对高有关。１．３讨论～、二甲双胍对糖尿病大鼠脂肪组织ＡＭＰＫ、ＰＰＡＲ７及天津医科大学博士学位论文糖脂代谢、胰岛素敏感性的影响本次实验通过小剂量ＳＴＺ联合高脂饮食制备２型糖尿病大鼠模型，有一定的理论基础，ＳＴＺ小剂量注射可选择性的致使胰岛ｐ细胞损伤，同时对大鼠其他组织器官副作用小，大鼠存活率较高。联合配以高脂饮食可诱导胰岛素抵抗四１。二者结合诱导胰岛Ｂ细胞受损，同时大鼠出现胰岛素抵抗，是目前国内外常用而且肯定的制备糖尿病大鼠模型的方法。本实验采用高脂饮食联合腹腔注射小剂量ＳＴＺ的方法制备２型糖尿病模型，高脂饮食４周大鼠体重明显高于普通饲料喂养组，说明大鼠肥胖，胰岛素抵抗明显。２型糖尿病模型大鼠血清ＴＣ、ＴＧ、ＬＤＬ水平明显升高，ＨＤＬ水平明显下降，出现了脂代谢紊乱，与２型糖尿病典型的血脂谱表现为高ＴＧ血症，接近正常的ＬＤＬ—Ｃ水平，ＨＤＬ．Ｃ水平降低，小而密的ＬＤＬ．Ｃ水平升高【ｌ３】相符。胰岛素水平下降显示胰岛１３细胞受损。现已证实脂代谢紊乱可引起或加重胰岛素抵抗和胰岛１３细胞功能障碍，启动或促进２型糖尿病的发病，也就是“脂毒性”学说¨∞。２型糖尿病脂代谢异常常伴胰岛素抵抗，其发生可能在糖代谢紊乱之前…１，有人认为血ＴＧ升高是胰岛素抵抗存在的早期表现，最后形成糖脂代谢恶性循环。因此，降糖治疗的同时需要调脂治疗。近年来医学界各领域对脂肪组织的理解已经由单纯的能量储存器官，延伸成为一个及其重要的内分泌及代谢系统，具有多种分泌功能，脂肪组织是人体内最大的内分泌器官，可分泌多种影响脂肪细胞胰岛素信号转导的细胞因子¨２’Ｂ’¨１。许多我们熟知或陌生的脂肪细胞凶子（Ａｄｉｐｏｃｙｔｏｋｉｎｅｓ）及蛋白质凶子等多种生物活性物质，参与多种病理生理过程，影响多组织器官功能，如肿瘤坏死因子（ＴＮＦ．ｕ），脂联素（ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ）等。另外，某些因子如：ＰＰＡＲ．Ｓ，ＡＭＰＫ等也在脂肪组织表达，所以机体一定量的脂肪组织缺之不可。本实验旨在研究二甲双胍对脂肪组织产生的ＡＭＰＫ及ＰＰＡＲｙ的影响，及其对糖脂代谢，胰岛素敏感性的调节，进而指导２型糖尿病及其并发症的防治。二甲双胍自上世纪５０年代正式上市以来，已有５０多年的临床应用历史，它的有效地降血糖作用已得到肯定，同时其潜在的调节血脂，改善胰岛素敏感性及预防糖尿病进展降低大血管并发症的作用也备受关注。本实验证明二甲双胍降糖降脂及增加胰岛素敏感性的机制之一是通过对脂肪组织ＡＭＰＫ及ＰＰＡＲ７ｍＲＮＡ的表达的上调。二甲双胍对２型糖尿病肥胖患者的有明显的降低体重的作用，已被推荐为糖尿病肥胖患者降糖治疗的一线用药。多年前国外就已将二甲双胍口服联合饮食天津医科大学博士学位论文糖脂代谢、胰岛素敏感性的影响～、二甲双胍对糖尿病大鼠脂肪组织ＡＭＰＫ、ＰＰＡ聊及控制作为一种减肥方法。主要与其降低食欲，抑制葡萄糖吸收有关，而本次实验结果显示ＤＭ．Ｔ组大鼠较ＤＭ．Ｃ组大鼠体重下降幅度降低，分析其可能的机制有①与二甲双胍降低糖尿病大鼠血糖，增加糖原供能，减少脂肪，蛋白质消耗有关。②激活ＡＭＰＫ有关，尤其是ＡＭＰＫａ２，有文献记载脂肪组织的合成和代谢主要是通过ＡＭＰＫａ２起作用的¨卯。＠ＰＰＡＲ７的激活有利于能量的正平衡，产生ＡＴＰ和脂肪以储存，诱导机体脂肪合成¨扒１７１。本实验显示经二甲双胍治疗组２型糖尿病大鼠体重及肾周睾周脂肪重量均较２型糖尿病大鼠有所增加，表明二甲双胍在促进非脂肪组织脂质氧化，降低非脂肪组织ＴＧ的堆积的同时，有抑制血糖过高引起的脂肪细胞的脂解的作用。这一作用与二甲双胍增加脂肪组织ＡＭＰＫ的表达水平，抗脂肪分解作用增强，减少脂毒性的作用有关。也与二甲双胍增加脂肪组织ＰＰＡＲ７的表达水平，ＰＰＡ脚的激活促进白色脂肪组织的分化，可减少肥大脂肪细胞数量，增加小脂肪细胞的数量有关‘１８１。二甲双胍的降血糖机制主要是增加外周组织肌肉，脂肪等对葡萄糖的摄取，通过抑制糖原异生和糖原分解，降低过高的肝葡萄糖输出。已有研究显示ＡＭＰＫ及ＰＰＡＲ７在降低过高的血糖水平，调节机体能量平衡方面具有异曲同工之处。ＡＭＰＫ激活的降糖机制，可通过促进骨骼肌葡萄糖转运子（ＧＬＵＴ）４的表达及转位使葡萄糖摄取增加，并可抑制肝糖原的输出。已有研究发现■甲双胍激活ＡＭＰＫ的分子机制与ＡＭＰＫａ２的１７２位点苏氨酸磷酸化增加有关，而且不影响ＡＭＰＫａｌ和ＡＭＰＫａ２的活性，不影响ＡＭＰ／ＡＴＰ的比例，由此可见二甲双胍是一类新型的ＡＭＰＫ激活剂，有望得到更广阔的应用。ＰＰＡＲ７主要表达于脂肪组织，是一类以配体激活的方式发挥生物学效应的因子，ＰＰＡＲ７的激活可促进葡萄糖转运子ＧＬＵｌ，ＧＬＵ２，ＧＬＵ４的表达，从而增强组织对葡萄糖的摄取，利用与肝糖原的合成从而改善糖代谢。本实验发现二甲双胍上调脂肪组织ＰＰＡＲｌｒｍＲＮＡ的表达，双胍类与ＰＰＡＲ７的激活之间的具体机制尚不明确，有文献记载ＡＭＰＫ可以激活多种转录因子，尤其需要指出的是可以激活过氧化物酶体增殖物激活受体ＰＰＡＲａ，而且是通过ＰＰＡ脚共激活子ｌａ（ＰＧＣｌａ）介导完成的，提示二甲双胍对ＰＰＡＲ７的活化是通过先激活ＡＭＰＫ间接激活的。二甲双胍是常用的降血糖药物，除具有独立于降糖作用之外的调脂益处。可以中等程度地降低Ｔ２ＤＭ患者ＴＧ‘１９１。本研究显示二甲双胍治疗４周，糖尿病大鼠血清ＨＤＬ．Ｃ水平显著增高；血清ＴＣ、ＴＧ、ＬＤＬ水平显著降低，糖尿病天津医科大学博士学位论文一、二甲双胍对糖尿病大鼠脂肪组织ＡＭＰＫ、ＰＰＡＲ丫及糖脂代谢、胰岛素敏感性的影响大鼠的脂代谢紊乱明显改善。二甲双胍改善脂代谢的机制尚未清楚。此次实验发现二甲双胍治疗组的糖尿病模型大鼠脂肪组织ＡＭＰＫ及ＰＰＡＲ一、／ｍＲＮＡ含量增加，提示脂肪组织活化的ＡＭＰＫ及ＰＰＡＲ，／抑制脂肪和胆固醇的合成，增加游离脂肪酸的氧化，降低游离脂肪酸浓度，减少脂质在外周组织的沉积，改善脂代谢紊乱方面有重要作用。ＰＰＡＲｌ，通过诱导脂肪细胞的凋亡及脂肪细胞的分化而调控脂肪组织的量，ＡＭＰＫ通过增加脂肪酸氧化、葡萄糖摄取以及促进ＧＬＵＴ４转运等来改善胰岛素抵抗。本实验显示经二甲双胍治疗的２型糖尿病大鼠脂肪组织ＡＭＰＫ及ＰＰＡＲｙｍＲＮＡ含量明显增加，表明二甲双胍可能通过增加脂肪组织ＡＭＰＫ及ＰＰＡＲｓｍＲＮＡ表达来调节脂质代谢平衡，改善胰岛素敏感性。胰岛素抵抗贯穿糖尿病的始终，改善胰岛素抵抗对２型糖尿病及其并发症的防治具有重要意义。二甲双胍可以通过提高脂肪组织及其他外周组织对葡萄糖的转运率，抑制糖异生，促进肝糖原的合成来增加胰岛素敏感性，其具体机制之一是通过上调脂肪组织活化的ＡＭＰＫ及ＰＰＡＲｌ，ｍＲＮＡ的含量，调节糖脂代谢，减少脂毒性以改善胰岛素抵抗的。ＡＭＰＫ、ＰＰＡＲ丫及其信号通路已成为治疗２型糖尿病胰岛素抵抗的新靶点，但是具体机制的探讨需要更深入的研究，同时该通路对心血管系统，神经系统，胰岛细胞的影响，细胞凋亡等方面的研究需要扩展，我们也需意识Ｎ－甲双胍用于临床的局限性，提高此靶点的组织选择性也是日趋解决的问题。１．４小结ｌ、糖尿病大鼠脂肪组织ＡＭＰＫ、ＰＰＡＲＹｍＲＮＡ水平下降。２、二甲双胍上调２型糖尿病大鼠脂肪组织ＡＭＰＫ、ＰＰＡＲｙｍＲＮＡ的水平。３、二甲双胍改善２型糖尿病大鼠糖、脂代谢异常，增加胰岛素敏感性。４、二甲双胍可能通过上调２型糖尿病大鼠脂肪组织ＡＭＰＫ及ＰＰＡＲ７’ｍＲＮＡ的水平，调节机体糖、脂代谢，增加胰岛素敏感性。天津医科大学博士学位论文二、二甲双胍对地塞米松诱导的３Ｔ３．Ｌ１细胞ＡＭＰＫ、ＰＰＡ脚的影响二、二甲双胍对地塞米松诱导的３Ｔ３一Ｌ１细胞础汩Ｋ、ＰＰＡＲｙ的影响本部分研究使用３Ｔ３．Ｌ１细胞由美国国立卫生院（ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓｏｆＨｅａｌｔｈ，ＮＩＨ）建立的体外肥胖细胞系，该细胞是来源于小鼠成纤维细胞的前脂肪细胞。近年在国际上常将３Ｔ３．Ｌ１前脂肪细胞用于体外胰岛素抵抗方面的研究。本部分实验拟以３Ｔ３．Ｌ１Ｊ］旨肪细胞为研究对象，探讨使用地塞米松建立体外胰岛素抵抗模型中，ＡＭＰＫ、ＰＰＡＲ７、ＧＵＬＴ４的表达的情况，并观察二甲双胍对其表达及改善胰岛素敏感性的作用。２．１对象和方法２．１．１实验材料２．１．１．１细胞小鼠前脂肪细胞（３Ｔ３．Ｌ１）：天津血液病研究所惠赠。２．１．１．２实验主要试剂与药品（１）ＤＭＥＭ高糖培养基：赛默飞世尔生物化学制品有限公司；批号：ＮＶＨ０３０３（２）国产胎牛血清：北京元亨金马生物技术开发有限公司：ＬｏｔＮｏ：１００７０２（３）胰蛋白酶（１：２５０）：美国ＧＩＢＣＯ公司（４）牛血清白蛋白（ＢＳＡ）：美国Ｓｉｇｍａ公司（５）地塞米松：美国Ｓｉｇｍａ公司（６）３．异丁基．１．甲基黄嘌呤（ＩＢＭＸ）：美国Ｓｉｇｍａ公司（７）盐酸二甲双胍：中美上海施贵宝制药有限公司（８）胰岛素（诺和灵Ｒ）：丹麦ＮｏｖｏＮｏｒｄｉｓｋ公司（９）二甲基亚砜：美国Ｓｉｇｍａ公司（１０）Ｔｒｉｚｏｌ：美国ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司（１１）ＤＥＰＣ：ＢｉｏＢａｓｉｃＩｎｃ（Ｃａｎａｄａ）公司（１２）无水乙醇：上海鑫达精细化工有限公司（１３）异丙醇：天津科密欧化学试剂开发中心（１４）氯仿：天津科密欧化学试剂开发中心（１５）油红Ｏ：美国Ｓｉｇｍａ公司（１６）荧光定量ＰＣＲ试剂盒：上海生工生物工程技术服务有限公司天津医科大学博士学位论文二、二甲双胍对地塞米松诱导的３Ｔ３－Ｌ１细胞ＡＭＰＫ、ＰＰＡＲｙ的影响（１７）葡萄糖测定试剂盒．氧化酶法：购自盛科博源公司（１８）其他常规试剂均由华北煤炭医学院中心实验室提供２。１．１．３实验主要仪器设备３３３６型二氧化碳培育箱倒置相差显微镜ＵＦＸ．ＩＬＡ超净工作台自动双重纯水蒸馏器ＳＺ一９３台式灭菌器ＴＭＤ．Ｊ．２５４０ＲＴ６０００型高速冷冻离心机低速平衡离心机ＢＸ．４１型光学显微镜２０２．２型电热干燥箱超低温冰箱电热恒温水浴箱空气浴振荡器ＨＺＱ．Ｃ电子天平ＪＡ２００３ＢＩＯ．ＲＡＤＦｏｒｍａｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃｃｏｍｐａｎｙＮＩＫＯＮＦｏｒｍａｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃｃｏｍｐａｎｙ上海亚荣生化仪器厂山东新华医疗器械股份有限公司Ｓｏｒｖａｌｌ北京医学离心机厂日本ＯＬＹＭＰＵＳ上海市第二五金厂Ｓｙｂｒｏｎ北京长安科学仪器厂哈尔滨东联电子技术开发有限公司上海精密天平美国Ｂｉｏ．ＲａｄＣｏｒｂｅｔｔＲｅｓｅａｒｃｈ公司Ｍｏｄｅｌ５５０酶标仪Ｒｏｔｏｒ－Ｇｅｎｅ荧光定量ＰＣＲ仪２．１．２主要试剂的配置：（１）双抗溶液：取青霉素钠盐１００万Ｕ、链霉素１９溶于１００ｍｌ超纯水中，终浓度为每毫升溶液含青霉素１万Ｕ、链霉素１万斗ｇ，０．２２“ｍ滤器过滤分装，．２０＂Ｃ保存。（２）ＤＭＥＭ完全培养基：每１００ｍｌＤＭＥＭ高糖培养基中加双抗ｌｍｌ，４＂Ｃ保存，临用时加１５％胎牛血清，一周内用完。（３）ＩＢＭＸ（３．异丁基．１．甲基黄嘌呤）溶液：ＩＢＭＸ分子量为２２２．２４。称取１１．１ｍｇＩＢＭＸ，加入ｌｍｌ无水乙醇，混匀为储存液，一２０℃保存。诱导时每１００ｍｌ培养液加ｌｍｌ储存液。（４）胰岛素溶液：诺和灵Ｒ为瓶装注射液（４００ＩＵ／１０ｍｌ，１ＩＵｊｆＨ当于０．０３５ｍｇ胰岛素），分子量为５８０８。分装后４０Ｃ保存。诱导时每１００ｍｌ培养液）＇ＪＩＪ７１４ｕｌ储存液。（５）地塞米松溶液：地塞米松分子量为３９２．４６。称取ｌｍｇ地塞米松，加入１２７４“１天津医科大学博士学位论文塞米松诱导的３Ｔ３．Ｌ１细胞ＡＭＰＫ、ＰＰＡＲＹ的影响二、二甲双胍对地无水乙醇，混匀为储存液，过滤后一２０℃保存，诱导时每１００ｍｌ培养液力ｎ５０ｕｌ储存液。（６）盐酸二甲双胍溶液：盐酸二甲双胍分子量为１６５．６３。称取盐酸二甲双胍粉２．５９，溶于１５ｍｌ－二基亚砜，加入超纯水定容至总体积１５０ｍｌ，混匀为储存液，过滤分装后４＂Ｃ保存。终浓度为１００ｍＭ。（７）油红Ｏ染液：０．２５９油红Ｏ］Ｈ／Ｘ．１００ｍｌ异丙醇，５６。Ｃ助溶１ｈ，冷却后，过滤作为储存液，使用时，取６份上述储存液，加４份ｄｄＨ２０混匀，静置１０ｍｉｎ，即为使用液。（８）Ｉ型胶原酶：取１００ｍｇＩ型胶原酶充分溶解于１００ｍｌＰＢＳ缓冲液中，再称取１９牛血清白蛋白溶于上述缓冲液中，最终配成０．１％的Ｉ型胶原酶。（９）１０％多聚甲醛固定液：４０％１尹醛１０ｍｌＪＪＨ入９０ｍｌｄｄＨ２０，再加入氯化钙１９，调ＰＨ为７．０。（１０）ＰＢＳ见下表７。表７ＮａＣｌＰＢＳ：ＰＨ７．２．７．４８９０．２９１．４４９０．２９１０００ｍ１ＫＣｌＮａＥＨＰ０４ＫＨ２Ｐ０４加双蒸水定容至（１１）４％多聚甲醛：称取８０９多聚甲醛，充分溶解溶于２０００ｍｌＰＢＳ缓冲液中。２．１．３实验方法２．１．３．１３Ｔ３－Ｌ１细胞的体外扩增及鉴定２．１．３．１．１体外扩增、培养将小鼠前脂肪细胞（３Ｔ３．Ｌ１），放于培养基中，培养基采用含１５％胎牛血清、１％的双抗的ＤＭＥＭ培养液，于３７。Ｃ，５％Ｃ０２的孵育箱内贴壁法培养，细胞接近８０％．９０％融合时，进行传代培养，弃去原有培养基，ＰＢＳ轻柔冲洗两次，用０．２５％胰酶消化，镜下观察细胞如流沙样飘落，即用ＤＭＥＭ完全培养液终止消化，反复吹打，按１：３传代，以后每２天换液一次，待细胞长满瓶底后，如上法传代培养。天津医科大学博士学位论文塞米松诱导的３Ｔ３－Ｌ１细胞ＡＭＰＫ、ＰＰＡＲｖ的影响二、二甲双胍对地２．３．１．１．２诱导为成熟脂肪细胞传至第三代细胞状态良好时加入含Ｏ．５ｍｍｏｌ／Ｌ３一异丁基．１．甲基黄嘌呤（ＩＢＭＸ）、１０｝Ｌｇ／ｍＬ胰岛素、１／ａｍｏｌ／Ｌ地塞米松１５％ｄ、牛血清的ＤＭＥＭ高糖培养基培养４８ｈ，之后换以含１０｝ｔｇ／ｍＬ胰岛素的培养基再培养４８ｈ，随后以１５％ｄ、牛血清的ＤＭＥＭ高糖培养基继续培养，２天换培养液１次，诱导分化８～１２天的３Ｔ３。Ｌ１细胞，８０％一－－９０％以上呈脂肪细胞表型可用于试验。分别取第０天，第５天，第１０天于显微镜下观察照相。２．３．１．１．３３Ｔ３－Ｌ１脂肪细胞鉴定油红０染色步骤：运用油红Ｏ染色证明前脂肪细胞诱导成为成熟脂肪细胞。（１）轻缓的用加样器弃去培养基（２）ＰＢＳ漂洗１次（３）加１０％多聚甲醛固定３０分钟（４）；［１１１油红Ｏ染色３０分钟（６）用６０％异丙醇漂洗脱色，除去多余的染料（７）淡苏木素复染１分钟，ＰＢＳ漂洗，自来水浸泡３０分钟（８）甘油明胶封片（９）显微镜下观察２．１．３．２３Ｔ３－Ｌ１脂肪细胞胰岛素抵抗模型的建立及药物处理将分化成熟的３Ｔ３．Ｌ１脂肪细胞分为空白对照组、模型对照组、０．１ｍＭ二甲双胍组、０．５ｍＭ二甲双胍组、１．０ｍＭ二甲双胍组。空白对照组加入等体积细胞培养液。模型对照组与二甲双胍组每孔加１９ｍｏｌ／Ｌ地塞米松诱导胰岛素抵抗。当细胞胰岛素抵抗达最佳状态时，各加药组每孔再加入相应浓度二甲双胍处理４８ｈ。加１ｌｘｍｏｌ／Ｌ地塞米松诱导胰岛素抵抗（根据ＡｎｉｌＫｕｍａｒＫＬ等人）的方法成功的将３Ｔ３。Ｌ１诱导成为成熟脂肪细胞，每２ｄ换１次液，取上清液，以培养基中的葡萄糖的消耗量反映胰岛素抵抗的程度。在药物处理４８ｈ后检测培养基中葡萄糖含量（采用葡萄糖试剂盒检测培养基上清葡萄糖含量ＧＯＤ—ＰＯＤ法）及细胞中ＡＭＰＫ、ＰＰＡａｖ、ＧＬＵＴ４ｍＲＮＡ水平（采用ＲＴ－ＰＣＲ）法。２．１．３．３葡萄糖的测定：天津医科大学博士学位论文塞米松诱导的３Ｔ３一Ｌ１细胞ＡＭＰＫ、ＰＰＡＲ？的影响二、二甲双胍对地分别取每组的上清液ｌｍｌ置于Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管中，高速离心４＂Ｃ，１０分钟，并于．２０＂Ｃ冰箱中保存待测。按照葡萄糖测定试剂盒说明配置工作液及标准品，分别向空白管，标准管，测定管中加入１９５１ａｌ工作液，向空白管加入蒸馏水５¨１，标准管加入５“ｌ标准品，测定管加入５ｐ，１细胞上清液，入９６孔板内，用酶标仪进行血糖测定。绘制标准曲线，计算葡萄糖的浓度。收集各组细胞上清液，用葡萄糖氧化酶法测定上清液中的葡萄糖含量，以未接种细胞空白复孔葡萄糖含量均值相减，得出各孔细胞的葡萄糖消耗量。２．１．３．４提取ＲＮＡ的步骤：（１）移液器吸取ＰＢＳ液冲洗细胞３次，甩干；（２）每瓶细胞加入ｌｍｌＴｒｉｚｏｌ裂解液，冰上剧烈震荡摇匀１０分钟，吸入１．５ｍｌＥｐｐｅｎｄｏｒｆ管中；（３）每Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管中加入０．２ｍｌ氯仿，上下颠倒混匀１５秒，高速离心，４＂Ｃ，１２０００转／分，１５分钟；（４）吸取Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管中的上清液，加入到另一Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管中，再加入０．５ｍｌ异丙醇，上下混匀，放入．２０℃沉淀１小时：（５）配制７５％Ｌ醇，７５０１ｘｌ的无水乙醇加入２５０Ｉ．ｔｌ的ＤＥＰＣ水，放入１．５ｍｌＥｐｐｅｎｄｏｒｆ管中，置于冰上；（６）沉淀后的Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管高速离心（４℃，１２０００转／分，１０分钟），弃上清，可见白色沉淀，即为ＲＮＡ；（７）｝３１：１入７５％乙醇ｌｍｌ混匀，高速离心（４℃，８０００转／分，５分钟），弃上清，倒置用加样器将壁上的液体吸干净，在超净台内的冰袋上开口放一会，干燥ＲＮＡ。（８）加入ＤＥＰＣ水２０｝ｔｌ，混匀，．８０。Ｃ保存。２．１．３．５ＲｅａＩｔｉｍｅＰＯＲ荧光定量检测方法逆转录反应：在生物安全柜内，冰上操作，依次加入如下试剂盒内１．５标记的试剂，ＤＥＰＣ水稀释好的ＲＮＡ：４１ｘｌ；５×ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＭｉｘｌ：０．５ｌ，ｔｌ：ＯｌｉｇｏｄＴＢｕｆｆｅｒ：２ｐ，１：ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ６ＲＴＥｎｚｙｍｅＰｒｉｍｅｒ（５０ｐ，Ｍ）ｘ１：Ｏ．５ｌｘｌ；Ｒａｎｄｏｍｍｅｒｓ（１００ｐ，Ｍ）×１：０．５ｐ，１；ＲｎａｓｅＦｒｅｅｄＨ２０：２．５弘１至各ＰＣＲ小管中，放入ＰＣＲ仪，逆转录按照如下步骤进天津医科大学博士学位论文塞米松诱导的３Ｔ３．Ｌ１细胞ＡＭＰＫ、ＰＰＡＲ），的影响二、二甲双胍对地行：３０℃１０ｍｉｎ＿４２＂Ｃ３０ｍｉｎ＿９９＂Ｃ５ｍｉｎ＿５℃５ｍｉｎ。ＲｅａＩｔｉｍｅＰＯＲ荧光定量检测基因表达：ＡＭＰＫ引物：上游：５’—』ＣＣＴＴＴＡＣＣＡＣＧＧＴＴＧＡＴＴＴＣＴＣ一３’下游：５’—。ＣＡＧＧＣＴＣＴＡＣＴｒ】＿，ｒＧＡＴＣＧＣＡＣ卜３’ＰＰＡＲ］ｔ引物：上游：５’——Ｇ１－～ＣＴＧＴＣＧＧＴＴＴＣＡＧＡＡＧＴＧＣＣ一３’下游：５’——ＴＣＣＧＣＣＡＡＣＡＧＣＴＴＣＴＣＣＴ．一３’ＧＬＵＴ４引物：上游：５’—＿ＴＣＴＣＧＧＴＧＣＴＣＴＴＡＧＴＡＧ—．３’下游：５’——ＣＣＡＡＴＣＴＣＡＡＡＧＡＡＧＧＣＣＡＣＡＡＡ一３’ＧＡＰＤＨ引物：上游：５’—ＧＧＴＧＡＡＧＧＴＣＧＧＴＧＴＧＡＡＣ（｝一３’—Ｆ游：５’—ＧＣＴＣＣＴＧＧＡＡＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧ（｝一３’在生物安全柜内，冰上操作，取ＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ专用的小管，２５Ｉ＿ｔｌ的ＰＣＲ体系中加入各样黼ｃＤＮＡ２｝ｔｌ；上卜．游引物各ｌｌａｌ；ＤＥＰＣ水８．５川；ＳＹＢＲ用专用膜封ＶＩ后，使刚Ｒｏｔｏｒ－Ｇｅｎｅ３０００型ＰＣＲ仪进行ｒｅａｌ条件进行扩增：ＰｒｅｍｉｘＴａｑ１２．５ｐ．Ｉ。快速混匀，ｔｉｍｅＰＣＲ，按照表８所示的循环表８ｒｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ反应体系２．１．４统计学处理２２天津医科大学博士学位论文二、二甲双胍对地塞米松诱导的３Ｔ３－Ｌ１细胞ＡＭＰＫ、ＰＰＡ聊的影响Ｅｘｃｅｌ建库，将所有数据输入计算机，计量资料以均数士标准差（ｘ士ｓ）表示，所有数据采用ＳＰＳＳｌｌ．５统计软件包进行统计学分析，组间差异的统计学比较采用单因素方差分析（Ｏｎｅ．ＷａｙＡＮＯＶＡ），组间两两比较方差齐同用ＬＳＤ法，方差不齐用Ｔａｍｈａｎｅ法。Ｐ＜０．０５表示差异有统计学意义。２．２结果２．２．１３Ｔ３－Ｌ１前脂肪细胞的诱导分化及鉴定：未经诱导分化的３Ｔ３．Ｌ１前脂肪细胞系成纤维细胞，呈梭形，胞浆透明，胞核可见，胞内无脂滴（图５）。经１．甲基．３．异丁基．黄嘌呤、地塞米松、胰岛素诱导分化第５天，细胞形态变圆、体积增大，细胞内开始出现少量脂肪小滴（图６）。诱导分化第１０天细胞变圆变亮，细胞中大量圆形脂肪滴聚集在细胞核周围，呈典型的脂肪细胞形态，称为３＂Ｉ＂３－－Ｌ１脂肪细胞（图７）。经油红Ｏ染色，可见细胞质内脂肪滴被染成红色，细胞核呈蓝色（图８）。图５未诱导分化的３Ｔ３－Ｌ１前脂肪细胞（×１００）天津医科大学博士学位论文二、二甲双胍对地塞米松诱导的３１＂３．Ｌ１细胞ＡＭＰＫ、ＰＰＡ聊的影响图６３Ｔ３－Ｌ１脂肪细胞诱导分化第５天（Ｘ１００）图７３Ｔ３－Ｌ１脂肪细胞诱导分化第１０天（Ｘ１００）２４天津医科大学博士学位论文塞米松诱导的３Ｔ３一Ｌ１细胞ＡＭＰＫ、ＰＰＡＲ７的影响二、二甲双胍对地图８３Ｔ３－Ｌ１脂肪细胞诱导分化第１０天，油红Ｏ染色（×２００）２．２．２３Ｔ３＿Ｌ１胰岛素抵抗细胞模型的建立３Ｔ３。Ｌ１脂肪细胞诱导分化成熟后，给予地塞米松作用，分别测４８ｈ，９６ｈ，１４４ｈ空白组及模型组细胞培养上清葡萄糖浓度，各点模型组葡萄糖浓度高于空白组（Ｐ＜０．０５），用模型组葡萄糖浓度与空白组葡萄糖浓度的差值反映细胞胰岛素抵抗，可见９６ｈ差值显著高于４８ｈ及１４４ｈ（Ｐ＜０．０５），证实９６ｈ胰岛素抵抗达最佳。见表９和图９。表９地塞米松作用后不同时间细胞上清葡萄糖浓度（ＯＤ值）注：＃与模型组比较Ｐ＜０．０５；－ｋ与４８ｈ比较Ｐ＜０．０５；Ａ与１４４ｈ比较Ｐ＜０．０５天津医科大学博士学位论文二、二甲双胍对地塞米松诱导的３Ｔ３－Ｌ１细胞ＡＭＰＫ、ＰＰＡＲ＇／的影响图９地塞米松作用４８ｈ、９６ｈ、１４４ｈ后各组葡萄糖差值图１０模型组与空白组葡萄糖含量２．２．３二甲双胍作用于胰岛素抵抗细胞后葡萄糖浓度测定胰岛素抵抗模型诱导成功后，加入不同浓度的二甲双胍共同培养４８ｈ，同时设空白组，模型组，测得细胞培养上清葡萄糖含量如表１０和图１１。从表１０可知，二甲双胍呈剂量依赖性地抑制３Ｔ３．Ｌ１细胞培养上清葡萄糖的浓度（Ｐ＜Ｏ．０５），且Ｏ．５ｍＭ和１．０ｍＭ二甲双胍的抑制作用基本相似（Ｐ＞Ｏ．０５）。２６天津医科大学博士学位论文二、二甲双胍对地塞米松诱导的３Ｔ３．Ｌ１细胞ＡＭＰＫ、ＰＰＡ聊的影响表１０不同浓度二甲双胍对３Ｔ３．Ｌ１细胞培养上清葡萄糖浓度的影响（ＯＤ值）ｎ葡萄糖浓度Ｏ．８７７８士０．００３３空白组６模型组二甲双胍０．１ｍＭ二甲双胍０．５ｍＭ二甲双胍ｌｍＭ６６６６１．５３９０士０．００２４＃１．１７８５士０．００１９★０．９４１８士０．００２８★０．９４００士０．００２４★△注：★与模型组比较Ｐ＜０．０５；△与双胍０．５组比较Ｐ＞０．０５：＃与空白组比较Ｐ＜０．０５图１１不同浓度二甲双胍作用４８ｈ后各组上清葡萄糖ＯＤ值水平２．２．４ＲｅａｌｔｉｍｅＲＴ－ＰＣＲ结果２．２．４．１扩增曲线见图１２。此图由左至右的曲线依次是各组ＧＡＰＤＨ、ＡＭＰＫ、ＰＰＡＲＹ、ＧＬＵＴ４因子的Ｓ形扩增曲线。ＣＴ值均＜３０，均阳性，抛物线平滑，基线平坦，并经指数扩增期依次达平台期。由图可见ＡＭＰＫ、ＰＰＡＲｙ的相对各组起跳循环数相差不大。采用双标准曲线法定量并进行统计学比较。Ｆ值＝（待测组目的基因拷贝数．待测组管家基因拷贝数）／（正常组目的基因拷贝数．正常组管家基因拷贝数）天津医科大学博士学位论文二、二甲双胍对地塞米松诱导的３Ｔ３．Ｌ１细胞ＡＭＰＫ、ＰＰＡ脚的影响图１２所有样本均可见Ｓ形扩增曲２．２．４．２熔解曲线分析各检测基因扩增产物均可见明显单一波峰，无明显杂峰。２８天津医科大学博士学位论文二、二甲双胍对地塞米松诱导的３Ｔ３．Ｌ１细胞ＡＭＰＫ、ＰＰＡ聊的影响图１４ＡＭＰＫ溶解曲线图１５ＰＰＡＲｌ，溶解曲线天津医科大学博士学位论文二、二甲双胍对地塞米松诱导的３Ｔ３．Ｌ１细胞ＡＭＰＫ、ＰＰＡ聊的影响图１６ＧＡＰＤＨ溶解曲线２．２．４．３定量分析（１）ＡＭＰＫ各组基因转录水平比较体外培养的３Ｔ３．Ｌ１细胞胰岛素抵抗成功后，加入不同浓度的二甲双胍共同培养４８ｈ，同时设空白组，模型组，ＡＭＰＫ表达情况如表１１、图１７所示。由表１１可知，胰岛素抵抗模型组ＡＭＰＫ表达下降（Ｐ＜０．０５），二甲双胍可以剂量依赖性上调ＡＭＰＫ（Ｐ＜０．０５），其中Ｏ．５ｍＭ组与ｌｍＭ组差异无显著性（Ｐ＞０．０５），见表１１，图１７。表１１不同浓度二甲双胍作用４８ｈ对３Ｔ３．Ｌ１细胞ＡＭＰＫ表达的影响注：★与空白组及模型组比较Ｐ＜０．０５；▲与双胍１组比较Ｐ＞０．０５；ａ与空白组比较Ｐ＜０．０５天津医科大学博士学位论文二、二甲双胍对地塞米松诱导的３Ｔ３－Ｌ１细胞ＡＭＰＫ、ＰＰＡ脚的影响图１７不同浓度二甲双胍干预４８ｈ后各组ＡＭＰＫｍＲＮＡ水平（２）ＰＰＡ研各组基因转录水平比较体外培养的３Ｔ３。Ｌ１细胞胰岛素抵抗成功后，加入不同浓度的二甲双胍共同培养４８ｈ，同时设空白组，模型组，ＰＰＡＲ，／表达情况如表１２、图１８所示。由表２．５可知，胰岛素抵抗模型组ＰＰＡＲ＂／表达较空白组下降（Ｐ＜Ｏ．０５），二甲双胍可以剂量依赖性上调ＰＰＡＲ），（Ｐ＜０．０５），其中０．５ｍＭ组与ｌｍＭ组差异无显著性（Ｐ＞Ｏ．０５），见表１２图１８。表１２不同浓度二甲双胍作用４８ｈ对３Ｔ３一Ｌ１细胞ＰＰＡＲ７表达的影响注：★与模型组比较Ｐ＜０．０５；▲与双胍１组比较Ｐ＞０．０５；Ａ与空白组比较Ｐ＜０．０５天津医科大学博士学位论文二、二甲双胍对地塞米松诱导的３Ｔ３－Ｌ１细胞ＡＭＰＫ、ＰＰＡ脚的影响图１８不同浓度二甲双胍干预４８ｈ后各组ＰＰＡＲｌ＇ｍＲＮＡ水平（３）ＧＬＵＴ４各组基因转录水平比较体外培养的３Ｔ３一Ｌ１细胞胰岛素抵抗成功后，加入不同浓度的二甲双胍共同培养４８ｈ，同时设空白组，模型组，ＧＬＵＴ４表达情况如表１３、图１８所示。由表２．６可知，胰岛素抵抗模型组ＧＬＵＴ４表达较空白组下降（Ｐ＜Ｏ．０５），二甲双胍可以剂量依赖性上调ＧＬＵＴ４（Ｐ＜０．０５），其中０．５ｒａＭ组、ｌｍＭ组与模型组显著升高，其中Ｏ．１ｍＭ、０．５ｍＭ组与ｌｍＭ组差异无显著性（Ｐ＞０．０５），见表１３，图１９。表１３不同浓度二甲双胍作用４８ｈ对３Ｔ３一Ｌ１细胞ＧＬＵＴ４ｍＲＮＡ的影响注：★与模型组比较Ｐ＜０．０５；／Ｘ与空白组比较Ｐ＜０．０５３２天津医科大学博士学位论文二、二甲双胍对地塞米松诱导的３Ｔ３－Ｌ１细胞ＡＭＰＫ、ＰＰＡ聊的影响图１９不同浓度二甲双胍干预４８ｈ后各组ＧＬＵＴ４ｍＲＮＡ水平２．３讨论糖尿病发病率逐年增高，糖尿病并发症严重影响病人类生活质量。大量研究表明，糖尿病患者ｑｂ９０％以上是２型糖尿病。目前普遍认为胰岛素抵抗以及Ｂ细胞功能缺陷是２型糖尿病两个重要的发病环节。胰岛素抵抗（ＩｎｓｕｌｉｎＲｅｓｉｓｔａｎｃｅ，ｍ）是一种生理和病理状态，即指正常或高于正常浓度的胰岛素只能起到低于正常的生物效应，或者需要超量的胰岛素才能引起正常量反应的一种状态，常伴有高胰岛素血症。胰岛素的靶组织（脂肪、肌肉、肝脏、心血管等）对胰岛素的敏感性下降或丧失将产生一系列病理变化和临床症状１２０。。胰岛素抵抗有着复杂的遗传和环境因素。不同生理、病理状态下所产生的胰岛素抵抗，其机理不尽相同。但各种胰岛素抵抗均与胰岛素靶组织在细胞、受体、受体后和分子水平的结构与功能缺陷以及胰岛素作用调控激素异常等环节的障碍有关嘲【２１１。脂肪细胞缺陷产生胰岛素抵抗的机理是新近最活跃的研究领域之一。脂肪细胞的缺陷在大体上首先表现在脂肪分布部位的异常，特别是腹部内脏脂肪如网膜脂肪及其他脏器脂肪的堆积。目前认为，腹部内脏脂肪较皮下脂肪在引起胰岛素抵抗方面更为重要１２２，２３Ｊ。其次是脂肪细胞肥大，即脂肪细胞体积增大。脂肪细胞肥大在引起胰岛素抵抗方面较脂肪细胞数量的增多又更为重要。而腹部内脏脂肪及肥大的脂肪细胞诱导胰岛素抵抗的机制又和脂肪细胞分泌的脂肪因子关系密切１２４Ｊ。天津医科大学博士学位论文塞米松诱导的３Ｔ３．Ｌ１细胞ＡＭＰＫ、ＰＰＡＲ７的影响二、二甲双胍对地脂肪组织糖代谢紊乱是胰岛素抵抗的最显著特点之一。由于人体及动物实验的局限性，目前很多关于脂肪组织糖代谢的研究都是在体外脂肪细胞上进行，但在具体研究对象的选择上不尽相同：有来源于鼠的前脂肪细胞株如１３Ｔ３．Ｌ１【２５１、３Ｔ３一Ｆ４４２Ａ［２６１、ｏｂｌ７１２７】等，非糖尿病患者的脂肪细胞离体培养【２钔，正常大鼠、小鼠的原代脂肪细胞【２９】等。本实验采用３Ｔ３．Ｌ１前脂肪细胞，３Ｔ３．Ｌ１前脂肪细胞生存分化能力强，诱导成脂肪细胞的方法成熟，在分化过程中，细胞先达到接触生长抑制，处于生长周期的Ｇ０期，其后在诱导剂的作用下分化成为脂肪细胞。分化成熟的细胞具有脂肪细胞的形态和生理特征，表达胰岛素的受体等多种蛋白，其对胰岛素敏感性表现为胰岛素刺激状态下的葡萄糖转运能力的增加，广泛应用于糖脂代谢和脂肪细胞分化、分泌功能方面的研究。本实验参考ＢｒｅｎｔＣｌ３０］的方法，采用目前广泛应用的“鸡尾酒法”对３Ｔ３．Ｌ１前脂肪细胞株进行诱导分化，所应用的诱导剂为１一甲基．３．异丁基．黄嘌呤、地塞米松和胰岛素。体外制造脂肪细胞胰岛素抵抗的方法很多，除地塞米松孵育外，还有很多其他方法，如高糖培养、高胰岛素培养等。地塞米松诱导胰岛素抵抗所需的时间比较短，一般２－４天即可完成。本实验观察到，地塞米松作用于３Ｔ３。Ｌ１脂肪细胞，可明显抑制细胞对培养基中葡萄糖的摄取，同时降低葡萄糖转运子ＧＬＵＴ４的ｍＲＮＡ水平。此外，地塞米松还可使脂肪细胞胰岛素受体（ＩＮＳＲ）酪氨酸激酶活性降低，同时减低胰岛素受体底物与胰岛素受体结合能力，胰岛素受体底物．１（ＩｎｓｕｌｉｎＲｅｃｅｐｔｏｒＳｕｂｓｔｒａｔｅ．１，ＩＲＳ．１）合成减少，阻碍胰岛素受体及受体机制介导的信号转导，进而产生胰岛素抵抗。由上述可见，地塞米松诱导的３Ｔ３．Ｌ１脂肪细胞体外胰岛素抵抗模型较好的模拟了体内胰岛素抵抗的状态，并且较好的排除了脂毒性等代谢因素的影响，减低了众多脂肪因子的干扰，为本研究提供理想模型。本研究参考ＴｕｍｂｏｗＭＡ【２５】等人的方法成功的将３Ｔ３．Ｌ１诱导成为成熟脂肪细胞，并使用地塞米松建立体外细胞抵抗模型，结果脂肪细胞ＧＬＵＴ４ｍＲＮＡ水平降低，培养基中残余葡萄糖量增多，与国内外其他实验结果一致，并使用ＧＯＰ．ＤＯＰ方法通过检测葡萄糖摄取量的变化而鉴定模型由此说明，我们的体外抵抗模型的建立是成功的。在３Ｔ３．Ｌ１脂肪细胞完全分化成熟后对细胞进行实验分组，在加入干预药物前对细胞进行同步化处理，并在实验中设置对照组，从而避免了诱导剂中的地塞米松对实验结果的干扰。用地塞米松处理３Ｔ３．Ｌ１／］旨肪细胞，形成胰岛素抵抗，并采用临床糖检测试剂盒ＧＯＤ．ＰＯＤ法来诊断抵抗，此法更接近临床糖天津医科大学博士学位论文二、二甲双胍对地塞米松诱导的３Ｔ３．Ｌ１细胞ＡＭＰＫ、ＰＰＡ脚的影响尿病糖检测手段，优越性明显。在４８－－－１４４ｈ内检测脂肪细胞胰岛素抵抗的动态变化。随着地塞米松作用时间的延长，与空白组比较，模型组的细胞培养基上清葡萄糖含量逐渐增高，在地塞米松作用９６ｈ（第４ｄ），模型组与空白组的葡萄糖差值最高，表明此时为胰岛素抵抗的最佳状态。给予二甲双胍干预４８小时后，随二甲双胍浓度的增加，培养基中的葡萄糖含量逐渐减低，葡萄糖摄取率逐渐增加，其中以０．０５Ｍ及１Ｍ－甲双胍作用最强，表明二甲双胍呈剂量依赖性促进脂肪细胞摄取葡萄糖。腺苷酸活化蛋白激酶（ＡＭＰＫ）是一种重要的代谢应激蛋白激酶，ＡＭＰＫ被活化后可以增强葡萄糖摄取，脂肪酸氧化，减少葡萄糖，甘油三酯，胆固醇，调节机体能量平衡，素有细胞“能量感受器”之称。大量研究显示二甲双胍类降糖药可以激活骨骼肌，肝脏的ＡＭＰＫ，提示ＡＭＰＫ信号及其传导通路可在调节脂质代谢紊乱中发挥了巨大作用。ＡＭＰＫ的活化在机体的能量代谢平衡中发挥重要作用。在肝脏，ＡＭＰＫ的活化可抑制葡萄糖和脂质的合成，促进脂质氧化；在骨骼肌，ＡＭＰＫ的活化可增加葡萄糖摄取和脂肪酸氧化，促进线粒体生物合成；在脂肪组织，ＡＭＰＫ的活化可减少脂质生成，抑制脂解作用，抑制前体脂肪细胞向成熟脂肪细胞分化。这些作用降低了循环中葡萄糖和脂肪酸的水平，减少了脂质异位堆积，从而使胰岛素敏感性增加。葡萄糖进入脂肪细胞内是一种易化扩敞过程，需要细胞膜上匍萄糖转运子（ｇｌｕｃｏｓｅｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ，Ｇｌｕｔ）的直接参与。目前在哺乳动物组织中已经有１５个分别由不同的基因编码的葡萄糖转运体蛋白被确定，葡萄糖转运体蛋白家族的肽骨架都含有１２个跨膜区域，６个胞外环和５个胞内环【３１１。每一种糖转运蛋白在组织、细胞中的分布及动力学性质都不同。脂肪细胞主要表达ＧＬＵＴｌ和ＧＬＵＴ４，人与大鼠的ＧＬＵＴｌ和ＧＬＵＴ４具有高度序列保守性，分别有９７．６％和９５．３％的序列相同。显示在生物进化过程中，ＧＬＵＴｌ和ＧＬＵＴ４保持着重要的葡萄糖转运功能【３２１。与Ｃｈｕｌ３３】在３Ｔ３．Ｌ１脂肪细胞中的研究结果相同。ＧＬＵＴ４仅表达于胰岛素敏感的脂肪细胞（如白色及褐色脂肪）和肌肉细胞（如骨胳肌和心肌）中，其中褐色脂肪中含量最高。基础状态下９０％以上的ＧＬＵＴ４储存在胞浆内一类特异的小管一囊泡结构中，这类结构被称为ＧＬＵＴ４储存囊泡（ＧＳＶ），只有少数位于细胞外膜上。ＧＬＵＴ４易位涉及多个信号转导途径，如胰岛素信号转导途径和蛋白激酶（ＡＭＰＫ）途径。ＡＭＰＫ途径不经过胰岛素信号转导途径，是运动、缺氧等因素使天津医科大学博士学位论文塞米松诱导的３Ｔ３．Ｌ１细胞ＡＭＰＫ、ＰＰＡＲ－丫的影响二、二甲双胍对地ＧＬＵＴ４易位到细胞膜上的主要机制Ｋ３４１。一旦ＧＬＵＴ４转移至细胞外，而葡萄糖便顺着ＧＬＵＴ４的亲水性中央通道进入细胞，完成葡萄糖的摄取与转运【３５】。ＧＬＵＴ４表达和功能的障碍是导致脂肪细胞糖代谢异常、引发胰岛素抵抗的重要因素。ＧＬＵＴ４基因敲除杂合子ＧＬＵＴ４“．老鼠出现血糖升高、胰岛素抵抗综合征，而重新引入ＧＬＵＴ４基因可以恢复整体胰岛素的活性１３６１。Ｇａｒｖｅｙ［３７】研究发现，肥胖患者葡萄糖转运率下降２０％＂－－３０％，其脂肪细胞中ＧＬＵＴ４含量比消瘦者减少了４０％。肥胖患者胰岛素抵抗可能源于细胞ＧＬＵＴ４数量减少。２型糖尿病患者在受最大刺激后的葡萄糖转运率下降５６％，脂肪细胞中ＧＬＵＴ４减少更为严重，存在ＧＬＵＴ４分布及转位异常。Ａｂｅｌ［３８Ｊ等通过选择性降低小鼠脂肪组织ＧＬＵＴ４表达，发现尽管小鼠肌肉ＧＬＵＴ４表达正常，但胰岛素刺激的葡萄糖摄取能力降低约４０％，同时肌肉和肝脏的胰岛素刺激性一羟基磷酸肌醇激酶活性也比正常低５０％－－－＇６０％。提示脂肪细胞ＧＬＵＴ４表达水平的下降可诱导其它组织的胰岛素抵抗，脂肪组织ＧＬＵＴ４在介导体内葡萄糖处理，维持胰岛素敏感性中具有独特作用。ＰＰＡＲ丫对糖代谢的调节主要是通过增加外周组织对胰岛素的敏感，从而改善胰岛素抵抗。在肌肉中葡萄糖和脂肪酸作为能量供给时相互竞争，结果，脂肪酸水平升高干扰了葡萄糖的利用；在肝中，游离脂肪酸（ＦＦＡ）的增加与升高的葡萄糖和糖异生紧密相关。ＰＰＡＲｌ，激活剂可以促进脂肪组织中脂肪酸的吸收和储存。降低循环中甘油三脂和游离脂肪酸的水平，ＰＰＡＲ７的合成激动剂ＴＺＤｓ类药物就是通过增加胰岛素作用而刺激肌肉葡萄糖的利用，抑制肝脏肝糖原的输出。脂肪组织中ＰＰＡ脚增加胰岛素敏感性的可能机制是：①ＰＰＡＲ丫激活可以促进胰岛素依赖的磷脂酰基醇３激酶（Ｐ１３Ｋ）信号通路中Ｐ１３Ｋ基因的表达ｔ３９１Ｐ１３Ｋ是是一种介导葡萄糖进入靶细胞的脂质激酶，从而增强胰岛素敏感性。②还可以通过促进脂肪组织和骨骼肌组织中ＧＬＵＴ４基因的表达，促进对葡萄糖的摄取，来改善胰岛素敏感性。⑨ＰＰＡｌⅥ也可以通过调节脂质代谢紊乱，促进脂质及脂肪酸的代谢，及增加甘油三酯在脂肪组织的合成，减少脂肪组织，肌肉组织，肝脏等组织的脂毒性，从而改善胰岛素抵抗。④ＰＰＡＲ丫可以通过抑制转录因子ＰＡＸ６的活性，实现在转录水平，及受体前水平抑制胰高血糖素的生成，来抑制肝糖原的输出，达到增加胰岛素敏感性的作用１４０］。⑤ＰＰＡ聊通过对某些脂肪细胞因子分泌的调节来改善胰岛素敏感性，如通过抑制ＴＮＦ．伐和抵抗素的表达，天津医科大学博士学位论文塞米松诱导的３Ｔ３．ＬＩ细胞ＡＭＰＫ、ＰＰＡＲ？的影响二、二甲双胍对地促进脂联素的表达是增加胰岛素敏感性的机制之一。ＰＰＡＲｙ是脂肪生成的关键转录因子，其激动剂促进脂肪细胞分化，增加胰岛素敏感性。对于ＡＭＰＫ与ＰＰＡＲｌ＇关系中，国外研究报道使用转基因小鼠的骨骼肌，在ＡＭＰＫ转基因动物模型中，ＡＭＰＫ过表达，此时ＰＰＡＲ７基因表达水平相比正常小鼠升高；在ＡＭＰＫ基因敲出动物模型中，ＰＰＡＲ７基因表达水平恢复【４ｌ】。国内有学者观察到体外培养的大鼠胰岛Ｂ细胞系ＩＮＳ．１细胞株，ＡＭＰＫ在ＡＩＣＡＲ（ＡＭＰＫ激活剂）作用下激活时，ＰＰＡＲ？基因水平表达升高，ＡＭＰＫ失活时，ＰＰＡＲ３＇表达恢复，认为ＡＭＰＫ活性改变可以调控ＰＰＡＲ？的表达，证实ＰＰＡＲ７是ＡＭＰＫ的下游分子【４２１。在地塞米松诱导的３Ｔ３一Ｌ１脂肪细胞中，我们观察到，给予二甲双胍后，ＡＭＰＫ及ＰＰＡ脚ｍＲＮＡ表达上调，与此结论一致。本实验结果显示，地塞米松作用于３Ｔ３。Ｌ１脂肪细胞，明显地抑制了细胞对培养基中葡萄糖的摄取，同时ＡＭＰＫ、葡萄糖转运子ＧＬＵＴ４及ＰＰＡＲｒ的ＲＮＡ水平也下调．，提示葡萄糖摄取减少可能是因为ＡＭＰＫ、葡萄糖转运子ＧＬＵＴ４及ＰＰＡ脚的转录水平降低，影响了ＡＭＰＫ、ＧＬＵＴ４及ＰＰＡＲ丫的生成，导致ＡＭＰＫ、葡萄糖转运子ＧＬＵＴ４及ＰＰＡＲ・／的数目减少，从培养基中转运葡萄糖入细胞的量降低，残存在培养基中的葡萄糖比对照组明显增多，胰岛素抵抗形成。二甲双胍是胰岛素增敏剂，用于治疗胰岛素抵抗和２犁糖尿病，增强组织对胰岛素的敏感性，降低血糖。实验显示，当二甲舣胍作用于地塞米松诱导的胰岛素抵抗细胞后，细胞对培养基中的葡萄糖摄取明显增多，同时ＡＭＰＫ、葡萄糖转运子ＧＬＵＴ４ｍＲＮＡ及ＰＰＡＲｒｍＲＮＡ较胰岛素抵抗时（模型组）提高，与培养基中糖检测结果吻合，提示二甲双胍可能与ＡＭＰＫ、ＰＰＡＲ７结合以后，启动了其下游基因ＧＬＵＴ４的转录，ＧＬＵＴ４ｍＲＮＡ水平提高，翻译的葡萄糖转运子增多，细胞转运葡萄糖的能力增强，进而改善了葡萄糖摄取。二甲双胍改善胰岛素抵抗时，ＡＭＰＫ、ＧＬＵＴ４及ＰＰＡＲＹ的转录增强，ＡＭＰＫ、ＧＬＵＴ４ｍＲＮＡ及ＰＰＡＲ７ｍＲＮＡ水平升高，二甲双胍可改善高糖诱导的胰岛素抵抗的ＡＭＰＫ、ＧＬＵＴ４及ＰＰＡ脚的降低，其中０．０５Ｍ，１Ｍ－－甲双胍对高糖诱导的胰岛素抵抗的改善作用更为明显，与糖的检测结果一致，揭示二甲双胍的改善作用与ＡＭＰＫ、ＰＰＡＲｌ＇、ＧＬＵＴ４蛋白水平直接相关，此结果是否暗示地塞米松削弱ＡＭＰＫ、ＰＰＡＲ３，、ＧＬＵＴ４ｍＲＮＡ的翻译能力，导致葡萄糖转运子ＧＬＵＴ４数目降低而减少了葡萄糖的摄取，尚需进一步证明。天津医科大学博士学位论文塞米松诱导的３Ｔ３．Ｌ１细胞ＡＭＰＫ、ｒ＇ｒ＇ＡＲ，ｔ的影响二、－－甲ｇｙ，胍对地二甲双胍是目前应用广泛的口服降糖药，其降糖机制在于增强胰岛素的敏感性，促进外周组织对葡萄糖的摄取利用以及抑制肝糖输出。近年来，大量的研究发现二甲双胍增强胰岛素敏感性的作用是通过激活ＡＭＰＫ实现的【４３删，即二甲双胍实际上是一种ＡＭＰＫ的激活剂。本课题给予模型组不同浓度的二甲双胍，观察其改善脂肪细胞胰岛素抵抗状态是否与ＡＭＰＫ、ＰＰＡＲｌ，、ＧＬＵＴ４的表达有关。结果显示：二甲双胍可显著增高胰岛素抵抗状态脂肪细胞ＡＭＰＫ、ＰＰＡＲ７ＧＬＵＴ４的表达，从而提示了二甲双胍在脂肪细胞具有ＡＭＰＫ激活效应。二甲双胍作为ＡＭＰＫ的激活剂在临床具有举足轻重的地位，而具有多种生物学疗效的ＰＰＡ脚与二甲双胍之间又存在怎样的关系，也是许多实验研究的重点。继续更深入的了解ＡＭＰＫ和ＰＰＡＲ７作用的分子机制，以更好的指导临床，制备出更有效且副作用少的新一代药物是研究的最终目的。２．４小结１、地塞米松诱导的３Ｔ３．Ｌ１脂肪细胞胰岛素抵抗模型中ＡＭＰＫ、ＰＰＡＲ＇／、ＧＬＵＴ４ｍＲＮＡ下降。２、二甲双胍呈剂量依赖性上调ＡＭＰＫ、ＰＰＡＲ７、ＧＬＵＴ４ｍＲＮＡ。３、二甲双胍处理后胰岛素抵抗状态下的３Ｔ３．Ｌ１细胞葡萄糖摄取率上升。４、在脂肪细胞中二甲双胍可能是通过上调ＡＭＰＫ、ＰＰＡ脚及ＧＬＵＴ４ｍＲＮＡ水平改善胰岛素抵抗。天津医科大学博士学位论文全文结论全文结论１、胰岛素抵抗状态下ＡＭＰＫ及ＰＰＡＲ一、／ｍＲＮＡ水平下降。本文通过糖尿病大鼠的动物试验观察到，在高脂饮食辅以小剂量链脲佐菌素制备的２型糖尿病大鼠模型制备成功后，血糖、血脂升高、胰岛素敏感指数降低，存在胰岛素抵抗，用ＰＴ－ＰＣＲ法检测大鼠脂肪组织中ＡＭＰＫ及ＰＰＡＲ３，ｍＲＮＡ，其表达下降。通过对地塞米松诱导的３Ｔ３．Ｌ１脂肪细胞观察到，在９６小时细胞培养基中葡萄糖含量空白组与模型组差值达最高，胰岛素达抵抗最佳，用ＲＴ．ＰＣＲ检测地塞米松诱导的３Ｔ３．Ｌ１脂肪细胞中ＡＭＰＫ及ＰＰＡＲ，、／ｍＲＮＡ水平下降。２、二甲双胍上调ＡＭＰＫ及ＰＰＡＲ一、／ｍＲＮＡ的水平。本文在糖尿病大鼠的动物实验中观察到，采用高脂饮食联合腹腔注射小剂量ＳＴＺ的方法制备２型糖尿病模型，二甲双胍治疗４周后，检测脂肪组织中ＡＭＰＫ及ＰＰＡＲ＇ｙｍＲＮＡ的表达，较糖尿病大鼠未治疗组含量显著升高。地塞米松诱导的３Ｔ３．Ｌ１脂肪细胞观察到，检Ｎ－－－甲双胍作用４８小时胰岛素抵抗脂肪细胞ＡＭＰＫ、ＰＰＡＲｌ，及ＧＬＵＴ４ｍＲＮＡ的水平，二甲双胍处理后ＡＭＰＫ、ＰＰＡ脚及ＧＬＵＴ４ｍＲＮＡ上调，且呈剂量依赖性。３、二甲双胍改善血糖、血脂、胰岛素敏感性。动物实验采用高脂饮食联合腹腔注射小剂量ＳＴＺ的方法制备２型糖尿病模型，高脂饮食４周大鼠体重明显高于普通饲料喂养组，说明大鼠肥胖，胰岛素抵抗明显。２型糖尿病模型大鼠血糖、血清ＴＣ、ＴＧ、ＬＤＬ水平明显升高，ＨＤＬ、胰岛素敏感指数水平明显下降，出现了糖、脂代谢紊乱及胰岛素抵抗，二甲双胍治疗４周，糖尿病大鼠血清ＨＤＬ．Ｃ水平、胰岛素敏感指数显著增高；血糖、血清ＴＣ、ＴＧ、ＬＤＬ水平显著降低，糖尿病大鼠的糖、脂代谢紊乱、胰岛素抵抗明显改善。本实验显示经二甲双胍治疗组２型糖尿病大鼠体重及肾周睾周脂肪重量均较２型糖尿病大鼠有所增加，表明二甲双胍在促进非脂肪组织脂质氧化，降低非脂肪组织ＴＧ的堆积的同时，有抑制血糖过高引起的脂肪细胞的脂解的作用。在地塞米松诱导的３Ｔ３．Ｌ１脂肪细胞观察到，地塞米松诱导的３Ｔ３．Ｌ１脂肪细胞胰岛素抵抗模型中糖摄取率下降，随着地塞米松作用时间的延长，与空白组比较，模型组的葡萄糖含量逐渐升高，在地塞米松作用９６ｈ（第４ｄ），模型组与空白组的葡萄糖含量差值最高，表明此时为胰岛素抵抗的最佳状态。给予二甲双胍干预后，随二甲双胍浓度增加，培养基中的葡萄糖摄取率逐渐增加，且呈剂量依赖性。当二甲双胍作用于胰岛素抵抗脂３９天津医科大学博士学位论文全文结论肪细胞后，细胞对培养基中的葡萄糖摄取明显增多。４、二甲双胍可能是通过ＡＭＰＫ、ＰＰＡＲｌ，改善血糖、血脂、胰岛素敏感性。在高脂饮食联合腹腔注射ｄ，Ｎ量ＳＴＺ的方法制备２型糖尿病模型中观察到，给予二甲双胍干预后血糖、血脂、胰岛素敏感性发生变化，同时ＡＭＰＫ、ＰＰＡＲｌ，ｍＲＮＡ随着其发生变化。在地塞米松诱导的３Ｔ３．Ｌ１脂肪细胞中观察Ｎ－甲双胍呈剂量依赖性降低细胞培养基葡萄糖，同时呈剂量依赖性上调ＡＭＰＫ、ＰＰＡＲ，），、ＧＬＵＴ４的表达，二甲双胍可能是通过上调ＡＭＰＫ、ＰＰＡＲ＂？在脂肪组织及脂肪细胞中改善血糖、血脂、胰岛素敏感性。５、不足与展望。本研究从体内、外实验探讨胰岛素抵抗状态下ＡＭＰＫ、ＰＰＡ脚的变化，二甲双胍对ＡＭＰＫ、ＰＰＡ脚的影响，探讨其改善血糖、血脂、胰岛素抵抗的关系。推测二甲双胍改善血糖、血脂及胰岛素抵抗，可能是通过上调ＡＭＰＫ、ＰＰＡＲｌ，的表达，从而影ｎ向了脂肪细胞、组织葡萄糖代谢、血脂以及胰岛素信号转导系统。在本研究中，其影响具体的机制未完全阐明，尚需选择最佳二甲双胍浓度，从蛋白水平，细胞分子生物学水平探讨详细机制。需通过联合检测肝脏以及骨骼肌等方面对胰岛素抵抗深入探讨。同时为二甲双胍更好、更合理的应用临床，最大程度降低副总用，制备新一代药物，仍需从人群整体水平探讨及观测。４０天津医科大学博士学位论文论文创新点论文创新点１、在２型糖尿病大鼠脂肪组织中同时检测了ＡＭＰＫ、ＰＰＡＲ７ｍＲＮＡ水平，及二甲双胍的干预，国内尚未见相关报道。２、通过建立胰岛素抵抗３Ｔ３．Ｌ１细胞，检测脂肪细胞ＡＭＰＫ、ＰＰＡＲ７、ＧＬＵＴ４的ｍＲＮＡ水平及不同浓度二甲双胍对其的影响，探讨二甲双胍对胰岛素抵抗的分子机制，国内未见相关报道。天津医科大学博士学位论文参考文献参考文献【１１ＨａｎｓｅｎＰＡ，ＨａｒｔＤＨ，ＮｏｌｔｅＬＡ，ｅｔａｌ．ＤＨＥＡｐｒｏｔｅｃｔｓａｇａｉｎｓｔｖｉｓｃｅｒａｌｏｂｅｓｉｔｙａｎｄｍｕｓｃｌｅｉｎｓｕｌｉｎｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｉｎｒａｔｓｆｅｄａｈｉｇｈ—ｆａｔｄｉｅｔ［Ｊ］．ＡｍＪＰｈｙｓｉｏｌ，１９９７，２７３（５Ｐｔ２）：Ｒ１７０４—１７０８．【２】ＭａｒｋｏｖｉｃＴＰ，ＪｅｎｋｉｎｓＡＢ，ＣａｍｐｂｅｌｌＬＶ，ｅｔａｌ．ＴｈｅｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓｏｆｇｌｙｃｅｍｉｃｒｅｓｐｏｎｓｅｓｔｏｄｉｅｔｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎａｎｄｗｅｉｇｈｔｌｏｓｓｉｎｏｂｅｓｉｔｙａｎｄＮＩＤＤＭ［Ｊ］．ＤｉａｂｅｔｅｓＣａｒｅ，１９９８，２１（５）：６８７－６９４．【３１ＳｃｈｅｒｅｒＰＥ．Ａｄｉｐｏｓｅｔｉｓｓｕｅ：ｆｒｏｍｌｉｐｉｄｓｔｏｒａｇｅｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔｔｏｅｎｄｏｃｒｉｎｅｏｒｇａｎ【Ｊ】．Ｄｉａｂｅｔｅｓ，２００６，５５（６）：１５３７—１５４５．［４１ＫｉｒｐｉｃｈｎｉｋｏｖＤ，ＭｃＦａｒｌａｎｅＳＩ，ＳｏｗｅｒｓＪＲ．Ｍｅｔｆｏｒｍｉｎ：ａｎｕｐｄａｔｅ［Ｊ］．ＡｎｎＩｎｔｅｒｎＭｅｄ，２００２，１３７（１）：２５－３３．【５】ＭｉｎｏｋｏｓｈｉＹ，ＫｉｍＹＢ，ＰｅｒｏｎｉＯＤ，ｅｔａｌ．Ｌｅｐｔｉｎｓｔｉｍｕｌａｔｅｓｆａｔｔｙ—ａｃｉｄｏｘｉｄａｔｉｏｎｂｙａｃｔｉｖａｔｉｎｇＡＭＰ—ａｃｔｉｖａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ，２００２，４１５（６８６９）：３３９—３４３．【６１ＣｈｏＫ，ＫｉｍＳＪ，ＰａｒｋＳＨ，ｅｔａｌ．ＰｒｏｔｅｃｔｉｖｅｅｆｆｅｃｔｏｆＣｏｄｏｎｏｐｓｉｓｌａｎｃｅｏｌａｔａｒｏｏｔｅｘｔｒａｃｔａｇａｉｎｓｔａｌｃｏｈｏｌｉｃｆａｔｔｙｌｉｖｅｒｉｎｔｈｅｒａｔ［Ｊ］．ＪＭｅｄＦｏｏｄ，２００９，１２（６）：１２９３—１３０１．［７１ＦｏｌｍｅｓＣＤ，ＬｏｐａｓｃｈｕｋＧＤ．Ｒｏｌｅｏｆｍａｌｏｎｙｌ—ＣｏＡｉｎｈｅａｒｔｄｉｓｅａｓｅａｎｄｔｈｅｈｙｐｏｔｈａｌａｍｉｃｃｏｎｔｒｏｌｏｆｏｂｅｓｉｔｙ［Ｊ］．ＣａｒｄｉｏｖａｓｃＲｅｓ，２００７，７３（２）：２７８－２８７．【８１ＭｕｓｉＮ，ＨｉｒＳｈｍａｎＭＦ，ＮｙｇｒｅｎＪ，ｅｔａｌ．ＭｅｔｆｏｒｍｉｎｉｎｃｒｅａｓｅｓＡＭＰ．ａｃｔｉｖａｔｅｄＰｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙｉｎｓｋｅｌｅｔａｌｍｕｓｃｌｅｏｆｓｕｂｊｅｃｔｓｗｉｔｈｔｙｐｅ２ｄｉａｂｅｔｅｓ【Ｊ】．Ｄｉａｂｅｔｅｓ，２００２，５１（７）：２０７４—２０８１．１９１ＹｏｏｎＭＪ，ＬｅｅＧＹ，ＣｈｕｎｇＪＪ，ｅｔａｌ．ＡｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎｉｎｃｒｅａｓｅｓｆａｔｔｙａｃｉｄｏｘｉｄａｔｉｏｎｉｎｓｋｅｌｅｔａｌｍｕｓｃｌｅｃｅｌｌｓｂｙｓｅｑｕｅｎｔｉａｌａｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆＡＭＰ—ａｃｔｉｖａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅ，ｐ３８ｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅ，ａｎｄｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅｐｒｏｆｉｆｅｍｔｏｒ—ａｃｔｉｖａｔｅｄｒｅｃｅｐｔｏｒａｌｐｈａ［Ｊ］．Ｄｉａｂｅｔｅｓ，２００６，５５（９）：２５６２－－２５７０．【１０１ＬｉｎＣＹ，ＧｕｒｌｏＴ，ＨａａｔａｊａＬ，ｅｔａｌ．Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒａｃｔｉｖａｔｅｄｂｙｒｏｓｉｇｌｉｔａｚｏｎｅｐｒｏｔｅｃｔｓｈｕｍａｎｉｓｌｅｔｃｅｌｌｓａｇａｉｎｓｔｈｕｍａｎｉｓｌｅｔｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｔｏｘｉｃｉｔｙｂｙａｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ３－ｋｉｎａｓｅ—ｄｅｐｅｎｄｅｎｔＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌＭｅｔａｂ，２００５，９０（１２）：６６７８—６６８６．【１１］ＬｅｅＷＪ，ＫｉｍＭ，ＰａｒｋＨＳ，ＫｉｍＨＳ，ＪｅｏｎＭＪ，ＯｈＭＳ，ＫｏｈＥＨ，ＷｏｎＭＳ，ＯｈＧＴ，４２ｍｉｔｏｇｅｎ—ａｃｔｉｖａｔｅｄｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｇａｍｍａａｍｙｌｏｉｄｐａｔｈｗａｙ［Ｊ］．Ｃｌｉｎ天津医科大学博士学位论文ＹｏｏｎＭ，ＬｅｅＫＵ，ｐａｒｋＪＹ．ＡＭＰＫａｃｔｉｖａｔｉｏｎ参考文献ｉｎｃｒｅａｓｅｓｆａｔｔｙａｃｉｄｏｘｉｄａｔｉｏｎｉｎｓｋｅｌｅｔａｌｍｕｓｃｌｅｂｙａｃｔｉｖａｔｉｎｇＰＰＡＲａｌｐｈａａｎｄＰＧＣ一１［Ｊ］．ＢｉｏｅｈｅｍＢｉｏＰｈｙｓＲＥＳＣｏｍｍｕｎ２００６，３４０（１）：２９１—２９５．【１２１王斐，刘毅，高冠起，等．二甲双胍降低大鼠肝脏胆固醇和甘油三酯含量的机制探讨［Ｊ】．中华内分泌代谢杂志，２００８，４（２４）：２０４．２０７．［９１鲁瑾，邹大进，张家庆．高脂饮食诱发大鼠胰岛素抵抗后肿瘤坏死因子２Ａ的改变【Ｊ］．中国糖尿病杂志，１９９９，７（５）：２８４－２８６．【１０］吴德红，王风杰，邓娟，等．黄芪多糖对２型糖尿病大鼠肝脏ＡＭＰＫ苏氨酸磷酸化的影响［Ｊ］．微循环学杂志，２００９，１９（３）：１－３．【１１】李延兵，翁建平．保护细胞功能以改善２型糖尿病的自然病程【Ｊ】．国外医学内分泌学分册，２００５，２５（３）：１８１．【１２１ＬａｕＤＣ，ＤｈｉｌｌｏｎＢ，ＹａｎＨ，ｅｔａｌ．Ａｄｉｐｏｋｉｎｅｓ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｌｉｎｋｓａｎｄｂｅｔｗｅｅｎｏｂｅｓｉｔｙａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ［Ｊ］．ＡｍＪＰｈｙｓｉｏｌＨｅａｒｔＣｉｒｃＰｈｙｓｉｏｌ２００５，２８８（５）：２０３１－２０４１．ｏｒｇａｎ【１３】ＳｃｈｅｒｅｒＰＥ．Ａｄｉｐｏｓｅｔｉｓｓｕｅ：ｆｒｏｍｌｉｐｉｄｓｔｏｒａｇｅｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔｔｏｅｎｄｏｃｒｉｎｅ５３７－１５４５．［Ｊ】．Ｄｉａｂｅｔｅｓ，２００６，５５（６）：１【１４１ＲｏｎｔｉＴ，ＬｕｐａｔｔｅｌｌｉＣＬＭａｒｍａｒｉｎｏＥ．Ｔｈｅｅｎｄｏｃｒｉｎｅｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆａｄｉｐｏｓｅｔｉｓｓｕｅ：ａｎｕｐｄａｔｅ［Ｊ］．ＣｌｉｎＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌ（Ｏｘｆ），２００６，６４（４）：３５５—３６５．【１５】买淑鹏，李晓山，徐增光，等．高脂饮食对大鼠脂肪组织ＡＭＰ激活的蛋白激酶表达的影响［Ｊ】．营养学报，２００８，３０（３）：２５３＿２５６．【１６１ＫｅｒｓｔｅｎＳ．Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒａｃｔｉｖａｔｅｄｒｅｃｅｐｔｏｒｓａｎｄｏｂｅｓｉｔｙ［Ｊ］．ＥｕｒＪＰｈａｒｍａｃｏｌ，２００２，４４０（２—３）：２２３－２３４．【１７］ＧａｒｇＡ．Ｄｙｓｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｅｍｉａａｎｄｄｉａｂｅｔｅｓ［Ｊ］．ＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌＭｅｔａｂＣｌｉｎＡｍ，１９９８，２７（３）：６１３—６２５，ｉｘ—ｘ．【１８１ＯｋｕｎｏＡ，ＴａｍｅｍｏｔｏＨ，ＴｏｂｅＫ，ｅｔａｌ．ＴｒｏｇｌｉｔａｚｏｎｅｉｎｅｒｅａｓｅｓｔｈｅｎｕｍｂｅｒｏｆｓｍａｌｌＮｏｒｔｈａｄｉＰｏｅｙｔｅｓｗｉｔｈｏｕｔｔｈｅｃｈａｎｇｅｏｆｗｈｉｔｅａｄｉｐｏｓｅｔｉｓｓｕｅｍａｓｓｉｎｏｂｅｓｅＺｕｅｋｅｒＣｌｉｎｒａｔｓ［Ｊ］．ＪＩｎｖｅｓｔ，１９９８，１０１（６）：１３５４—１３６１．【１９】李蓉．２型糖尿病血脂异常的处理［Ｊ］．中国实用内科杂志，２００９；２９（３）：２８１—２８３．【２０１ＷＨＯ．ＴｈｅＷｏｒｌｄＨｅａｌｔｈＲｅｐｏｒｔ，１９９８，９１．［２１】《中国糖尿病防治指南》总论，２００６．４３天津医科大学博士学位论文ｌｅｃｔｕｒｅ１９８８．Ｒｏｌｅｏｆｉｎｓｕｌｉｎｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｉｎ参考文献１２２］ＲｅａｖｅｎＧＭ．Ｂａｎｔｉｎｇｈｕｍａｎｄｉｓｅａｓｅ［Ｊ】．Ｄｉａｂｅｔｅｓ，１９８８，３７（１２）：１５９５—１６０７．１２３】廖二元，超楚生．内分泌学（下册）．北京：人民卫生出版社，２００１：１５１５．１５２０．［２４１陈家伦．胰岛素信号转导及临床意义．国外医学内分泌分册２００２，２２（１）．［２５】ＴｕｍｂｏｗＭＡ，ｅｔａｌ．ＤｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅＤｏｗｎ—ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆＩｎｓｕｌｉｎＳｕｂｓｔｒａｔｅ－１ｉｎ３Ｔ３一Ｌ１ＲｅｃｅｐｔｏｒＡｄｉｐｏｃｙｔｅｓ［Ｊ］．ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ，１９９４，２６９（４）：２５１６－２５２０．１２６］ＭｏｒａｎｇｅＰＥ，ＡｕｂｅｒｔＪｅｔａｌ．Ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄｓａｎｄｉｎｓｕｌｉｎｐｒｏｍｏｔｅｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎａｃｔｉｖａｔｏｒｉｎｈｉｂｉｔｏｒ１ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｂｙｈｕｍａｎａｄｉｐｏｓｅｔｉｓｓｕｅ［Ｊ】．Ｄｉｂｅｔｅｓ，１９９９，４８（４）：８９０－８９５．【２７】ＢｉｌｌｉｎｇｓＥ，ＭａｙＪＷ．ＨｉｓｔｏｒｉｃａｌａｕｔｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎｉｎｐｌａｓｔｉｃｒｅｖｉｅｗａｎｄｐｒｅｓｅｎｔｓｔＭｕｓｏｆｆｒｅｅｓｕｒｇｅｒｙｆａｔｇｒａｆｔＲｅｃｏｎｓｔｒａｎｄｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｖｅ［Ｊ】．ＰｌａｓｔＳｕｒｇ，１９８９，８３（２）：３６８－３８１．［２８】ＬｕｎｄｇｒｅｎＭ，，ＢｕｒｅＵｐｔａｋｅＣａｐａｃｉｔｙＪ，ＲｕｇｅＭ，ｅｔａｌ．ＯｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄｓＤｏｗｎ—ＲｅｇｕｌａｔｅＧｌｕｃｏｓｅａｎｄＩｎｓｕｌｉｎ—ＳｉｇｎａｌｉｎｇＰｒｏｔｅｉｎｓｉｎＯｍｅｎｔａｌＢｕｔＮｏｔＣｌｉｎＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌＳｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓＨｕｍａｎＡｄｉｐｏｃｙｔｅｓ［Ｊ】．Ｊ［２９１Ｍｅｔａｂ，２００４，８９（６）：２９８９—２９９７．ａｎｄＢｕｒｅｎＪ，ＬｉｕＨＸ，ＪｅｎｓｅｎＪ，ｅｔａｌ．Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅｉｍｐａｉｒｓｉｎｓｕｌｉｎｓｉｇｎａｌｌｉｎｇｇｌｕｃｏｓｅｔｒａｎｓｐｏｒｔｂｙｄｅｐｌｅｔｉｏｎｏｆｉｎｓｕｌｉｎｒｅｃｅｐｔｏｒｓｕｂｓｔｒａｔｅ一１，ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ３－ｋｉｎａｓｅａｎｄｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅＢｉｎｐｒｉｍａｒｙｃｕｌｔｕｒｅｄｒａｔａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ【Ｊ】．ＥｕｒＪＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌ，２００２，１４６（３）：４１９—４２９．【３０１ＦｒｙｅｒＬｑＦｏｕｆｅｌｌｅＦ，ＢａｒｎｅｓＫ，ｅｔａｌ．ＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｒｏｌｅｏｆｔｈｅＡＭＰ．ａｃｔｉｖａｔｅｄｍｕｓｃｌｅｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅｉｎｔｈｅｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎｏｆｇｌｕｃｏｓｅｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎｓｋｅｌｅｔａｌｃｅｌｌｓ［Ｊ］．ＢｉｏｃｈｅｍＪ，２００２，３６３（Ｐｔ１）：１６７—１７４．】ＭｕｅｃｋｌｅｒＭ．Ｆａｃｉｌｉｔａｔｉｖｅｇｌｕｃｏｓｅ【３１ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ［Ｊ］．ＥｕｒＪＢｉｏｃｈｅｍ，１９９４，２１９（３）：７１３－７２５．【３２１ＢｅｌｌＧＬ，ＫａｙａｎｏＴＢ，ＢｕｓｅＪ，ｅｔａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｙｏｆｍａｍｍａｌｉａｎｇｌｕｃｏｓｅｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ［Ｊ】．ＤｉａｂｅｔｅｓＣａｒｅ，１９９０，１３（３）：１９８－２０８．【３３】ＣｈｕｇｌｕｃｏｓｅＤＴ，ＩｓａａｃｓｏｎＣＭ，ＢｅｌｌＰＡ．ＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆＧＬＵＴ－１ｍＲＮＡｌｅｖｅｌｓａｎｄＧＬＵＴ－４Ｓｏｃｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｉｎ３Ｔ３一Ｌ１ａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ【Ｊ】．ＢｉｏｃｈｅｍＴｒａｎｓ，１９９０，１８（６）：１２４７—１２４８．Ｈ，ＣａｓｋｉｌｌＳＰ，ＳｔｅｒｍＭＰ．Ｄｅｃｒｅａｓｅｄｉｎｓｕｌｉｎｓｅｃｒｅｔｉｏｎ【３４］ＨａｆｆｎｅｒＳＭ，Ｍｉｅｔｔｉｎｅｎａｎｄｉｎｃｒｅａｓｅｄｉｎｓｕｌｉｎｒｅｓｉｓｔａｎｃｅａｒｅｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙｒｅｌａｔｅｄｔｏｔｈｅ７－ｙｅａｒｒｉｓｋ天津医科大学博士学位论文参考文献ｏｆＮＩＤＤＭｉｎＭｅｘｉｃａｎ—Ａｍｅｒｉｃａｎｓ［Ｊ］．Ｄｉａｂｅｔｅｓ，１９９５，４４（１２）：１３８６－１３９１．［３５１ＭａｒｔｉｎＳ，Ｔｅｌｌａｍｖｅｓｉｃｌｅ－－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄＪ，ＬｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅＣ，ｅｔａｌ．Ｔｈｅｇｌｕｃｏｓｅｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ（ＧＬＵＴ－－４）ａｎｄｆｒｏｍｒｅｃｙｃｌｉｎｇｍｅｍｂｒａｎｅｐｒｏｔｅｉｎ－－２（ＶＡＭＰ・－２）ａｒｅｓｅｇｒｅｇａｔｅｄｅｎｄｏｓｏｍｅｓｉｎｉｎｓｕｌｉｎ－－ｓｅｎｓｉｔｉｖｅｃｅｌｌｓ［Ｊ］．ＪＣｅｌｌＢｉｏｌ，１９９６，１３４（３）：６２５—６３５．【３６】ＺｉｓｍａｎＡ，ＰｅｒｏｎｉＯＤ，ＡｂｅｌＥＤ，ｅｔａｌ．Ｔａｒｇｅｔｅｄｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎｏｆｔｈｅｇｌｕｃｏｓｅｃａｕｓｅｓｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ４ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙｉｎｍｕｓｃｌｅｉｎｓｕｌｉｎｒｅｓｉｓｔａｎｃｅａｎｄｇｌｕｃｏｓｅｉｎｔｏｌｅｒａｎｃｅ［Ｊ】．ＮａｔＭｅｄ．２０００，６（８）：９２４—９２８．【３７】ＧａｒｖｅｙＷＴ，ＭａｉａｎｕｇｌｕｃｏｓｅＬ，ＨｕｅｃｋｓｔｅａｄｔＴＰ，ｅｔａ１．ＰｒｅｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｃａｕｓｅｓａｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｐｒｏｔｅｉｎｉｎｓｕｌｉｎｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｉｎａｄｉｐｏｃｙｔｅｓｆｒｏｍｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈＩｎｖｅｓｔ，１９９１，ｎｏｎ—ｉｎｓｕｌｉｎ—ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｄｉａｂｅｔｅｓｍｅｌｌｉｔｕｓａｎｄｏｂｅｓｉｔｙ［Ｊ］．ＪＣｌｉｎ８７（３）：１０７２－１０８１．１３８１ＡｂｅｌＥＤ，ＰｅｒｏｎｉＯ，ｅｔａｌ．Ａｄｉｐｏｓｅ—ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｔａｒｇｅｔｉｎｇｏｆｔｈｅＧＬＵＴ４ｇｅｎｅｉｍｐａｉｒｓｉｎｓｕｌｉｎａｃｔｉｏｎｉｎｍｕｓｃｌｅａｎｄｌｉｖｅｒ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ，２００１，４０９（６８２１）：７２９＂。７３３．【３９］陈永熙，王伟铭，周同，等．ＰＰＡＲ－Ｙ作用及其相关信号转导途径【Ｊ】．细胞生物学杂志，２００６，２８（３）：３８２．３８６．［４０１程万里，王彦华，贾国洪．ＰＰＡＲ．ａ，ＰＰＡＲｏＹ和胰岛素抵抗及糖尿病【Ｊ】．邯郸医学高等专科学校学报，２００５，１８（４）：２９２．２９４．［４１】ＬｏｎｇＹＣ，ＢａｍｅｓＢＲ，ＭａｈｌａＰｕｕＭ，ｅｔａｌ．．ＲｏｌｅｏｆＡＭＰ．ａｃｔｉｖａｔｅｄｉｎｔｈｅｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｇｅｎｅｓｅｍｏｕｓｅｗｈｉｔｅｓｋｅｌｅｔａｌｏｎＰｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅｔｒｏｌｌｉｎｇｇｌｕｃｏｓｅａｎｄｌｉＰｉｄｍｅｔａｂｏｌｉｓｍｉｎｍｕｓｅｌｅ［Ｊ］．Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ，２００５，４８（１１）：２３５４—６４．［４２１郭华，卞丽香，孙英，ｅｔａｌ．ＡＭＰＫ活化对ＩＮＳ．１细胞胰岛素释放的影响［Ｊ］．中国药理学通报，２００８，２４（２），１８３．１８６．［４３】ＺａｎｇＭ，ＺｕｃｅｏｌｌｏＡ，ＨｏｕＸ，ＮａｇａｔａＤ，ＷａｌｓｈＫ，ＨｅｒｓｅｏｖｉｔｚＨ，ＢｒｅｅｈｅｒＰ，ＲｕｄｅｒｍａｎＮＢ，ＣｏｈｅｎＲＡ．ＡＭＰａｃｔｉｖａｔｅｄＰｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅｉｓｒｅｑｕｉｒｅｄｆｏｒｔｈｅｌｉｐｉｄ－ｌｏｗｅｒｉｎｇｅｆｆｅｃｔｏｆｍｅｔｆｏｒｍｉｎｉｎｉｎｓｕｌｉｎ—ｒｅｓｉｓｔａｎｔｈｕｍａｎＨｅＰＧ２ｃｅｌｌｓ［Ｊ］。ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ．２７９（４６）：４７８９８—４７９０５．［４４１ＺｈｏｕＯ，ＭｙｅｒｓＪ，ＤｏｅｂｂｅｒＲ，ＬｉＹ，ＣｈｅｎＹ，ＳｈｅｎＸ，Ｆｅｎｙｋ．ＭｅｌｏｄｙＪ，ＷｕＭ，ＶｅｎｔｒｅＴ，ＦｕｊｉｉＮ，ＭｕｓｉＮ，ＨｉｒｓｈｌｎａｎＭＦ，ＧｏｏｄｙｅａｒＬＪ，ＭｏｌｌｅｒＤＥ．ＲｏｌｅｏｆｋｉｎａｓｅｉｎｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｍｅｔｆｏｒｍｉｎＡＭＰ—ａｃｔｉｖａｔｅｄＰｒｏｔｅｉｎａｅｔｉｏｎ［Ｊ］．ＪＣｌｉｎＩｎｖｅｓｔ，１０８（８）：１１６７—１１７４．４５天津医科大学博士学位论文发表论文和参加科研情况说明发表论文和参加科研情况说明在学期间发表论文情况：【１】吴乃君，冯凭，金秀平，等．二甲双胍对糖尿病大鼠脂肪组织ＡＭＰＫ和ＰＰＡＲｌ，的表达及胰岛素抵抗影响［Ｊ］．中国医院药学杂志，２０１１，３１（４）：２９７—２９９．［２］吴乃君，冯凭，金秀平，等．二甲双胍对２型糖尿病大鼠脂肪组织ＡＭＰＫａ２表达的影响［Ｊ］．山东医药，２０１１，５１（８）：５０。５２．天津医科大学博士学位论文综述综述皇刁；比ＣＡＭＰＫ、ＰＰＡＲｙ与糖、脂代谢及胰岛素敏感性一、ＡＭＰＫ与糖、脂代谢及胰岛素敏感性胰岛素抵抗（ＩｎｓｕｌｉｎＲｅｓｉｓｔａｎｃｅ，ＩＲ）是指胰岛素作用的靶器官对胰岛素作用的敏感性下降（表现为肝脏、肌肉、脂肪等外周组织对葡萄糖的代谢障碍），即正常剂量的胰岛素产生低于正常生物学效应的一种状态。ＩＲ不仅是２型糖尿病的发病基础，更是贯穿多种代谢相关疾病的主线，是连结它们的纽带，为这些疾病的共同病理生理基础。腺苷酸活化蛋白激酶（ＡＭＰＫ）是～种重要的代谢应激蛋白激酶，ＡＭＰＫ被活化后可以增强葡萄糖摄取，脂肪酸氧化，减少葡萄糖，甘油三酯，胆固醇，调节机体能量平衡，素有细胞“能量感受器”之称。大量研究显示二甲双胍类降糖药可以激活骨骼肌，肝脏和其他组织的ＡＭＰＫ，提示ＡＭＰＫ信号及其传导通路可在调节脂质代谢紊乱中发挥了巨大作用。１ＡＭＰＫ的结构、分布ＡＭＰＫ作为一种重要的蛋白激酶，它是由催化亚单位０【，和调节亚单位１３、Ｙ３个亚基构成的异三聚体Ⅲ，３个亚单位对于ＡＭＰＫ的活化都是必需的，每种亚基都有２至３钟亚型（ａｌ、ｏｃ２、ｐ１、１３２、Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３），各个亚型分布的组织细胞也不相同。ＡＭＰＫ广泛存在于骨骼肌，肝脏，胰腺和脂肪组织中。Ｍｕｓｉ等研究发现二甲双胍激活ＡＭＰＫ的分子机制与ＡＭＰＫａ２的１７２位点苏氨酸磷酸化增加有关１２１０也有文献记载脂肪组织的合成和代谢主要是通过ＡＭＰＫａ２起作用的１３ｌｏ２ＡＭＰＫ的激活＠ＡＭＰ／ＡＴＰ比值升高，如运动，缺氧，应激（能量供给不足时），ＡＭＰＫ被ＡＭＰ别构激活；值得注意的是ＡＭＰＫ可被磷酸肌酸和三磷酸腺苷（ＡＴＰ）别构抑制。值得指出的是这个作用较弱。＠ＡＭＰ可直接激活位于上游的ＡＭＰＫＫ（ＡＭＰＫ激酶，如ＬＫＢｌ，ＣａＭＫＫｌ３），后者再磷酸化ＡＭＰＫ的ａ亚单位的１７２位点得以激活。此作用较强③抑制蛋白磷酸酶对ＡＭＰＫ的Ｏ【亚单位的１７２位点的去磷酸化。以上３个途径共同协调ＡＭＰｋ的激活过程。３ＡＭＰＫ的激活剂目前发现的主要的激活剂有①二甲双胍和ＴＺＤ类抗糖尿病药物，二甲双胍天津医科大学博士学位论文综述是通过抑制ＡＴＰ合成，ＡＭＰ／ＡＴＰ比值升高激活ＡＭＰＫ的。也有研究发现二甲双胍对ＡＭＰＫ的活化是通过线粒体起源的活性氮自由基（ＲＮＳ）实现的１４１０ＴＺＤ激活ＡＭＰＫ的机制尚不清楚。但是有研究表明ＴＺＤ类药物可以通过激活某些脂肪细胞因子如脂联素，瘦素，抵抗素等间接激活ＡＭＰＫ。②某些脂肪细胞因子如：脂联素（ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ），瘦素（１ｅｐｔｉｎ），抵抗素（Ｒｅｓｉｓｔｉｎ）也可以使之激活。③人工合成的腺苷酸类似物５一氨基一４．甲酰胺咪唑核糖核苷酸（ＡＩＣＡＲ），可以模拟．ＡＭＰ而激活ＡＭＰＫ。④最新的研究显示Ａ７６９６６２。ｔｈｉｅｎｏｐｙｒｉｄｏｎｅ家族的成员可通过抑制蛋白磷酸酶对ＡＭＰＫ的０【亚单位的１７２位点的去磷酸化直接激活ＡＭＰＫ。３ＡＭＰＫ与脂代谢肝细胞中激活的ＡＭＰＫ可以磷酸化乙酰辅酶Ａ羧化酶（ＡＣＣ）和羟甲基戊二酸单酰辅酶还原酶（ＨＭＧＲ），从而抑制脂肪和胆固醇的合成，增加脂肪酸的氧化以及酮体的生成‘５１。丙二酸单酰辅酶Ａ脱羧酶（ＭＣＤ）被ＡＭＰＫ激活后，肝细胞内丙二酸单酰辅酶Ａ水平下降，抑制脂肪酸的合成。肌肉组织中ＡＭＰＫａ２表达居多，运动时消耗ＡＴＰ，ＡＭＰ／ＡＴＰ比值升高，激活ＡＭＰＫａ２，也可以使ＡＣＣ磷酸化，使之活性降低，并降低丙二酸单酰辅酶Ａ水平来促进脂肪酸氧化，为肌肉运动供能。脂肪细胞中，上述的ＡＭＰＫ激活剂均可使之激活，此外解耦连蛋白１（ＵＣＰｌ）也可以激活ＡＭＰＫ。与肝脏类似，激活的ＡＭＰＫ可以磷酸化ＡＣＣ第７９位苏氨酸和ＨＭＧＲ抑制其活性，同时ＭＣＤ被磷酸化和活化，降低丙二酸单酰辅酶Ａ水平来促进脂肪酸氧化。活化的ＡＭＰＫ一方面通过抑制甘油．３．磷酸乙酰转移酶而抑制甘油三酯的合成，另一方面使诱导甘油三酯水解的激素敏感脂肪酶（ＨＳＬ）磷酸化，从而抑制了异丙肾上腺素诱导的脂肪分解哺１，避免了血清中游离脂肪酸浓度过高。但ＡＭＰＫ抑制脂解的具体机制尚不完全清楚。目前已有研究提示ＡＭＰＫ对脂肪形成的作用，尤其是ＡＭＰＫａ２对糖尿病大鼠脂肪积聚有影响，但此方面的研究还不成熟。在脂肪细胞分化过程中ＡＭＰＫ激动剂ＡＩＣＡＲ可通过下调脂肪生成过程中Ｃ／ＥＢＰａ、ＳＲＥＢＰｌ和ＰＰＡ脚的表达，抑制前体脂肪细胞向成熟脂肪细胞分化Ⅲ。５ＡＭＰＫ与糖代谢葡萄糖利用的外周组织…骨骼肌组织，脂肪组织等，促进外周组织葡萄糖摄取的机制主要与细胞膜上的可以诱导葡萄糖转运的葡萄糖转运体４（ＧＬＵＴ４）天津医科大学博士学位论文综述有关。有研究证实，在骨骼肌细胞中，ＡＭＰＫ通过磷酸化组蛋白脱乙酰基酶５调节ＧＬＵＴ４转录碍１。在静息状态，大部分ＧＬＵＴ４蛋白位于细胞内的管状囊泡中，当信号转导事件促进葡萄糖转运的时候，ＧＬＵＴ４从囊泡易位到细胞膜上，发挥其生理作用。ＧＬＵＴ４易位涉及多个信号转导途径，如胰岛素信号转导途径和蛋白激酶（ＡＭＰＫ）途径。给胰岛素抵抗大鼠模型注射一定剂量的ＡＭＰＫ激动剂５．氨基．４．甲酰氨咪唑核糖核苷酸（灿ＣＡＲ）后，可激活ＡＭＰＫ并通过胰岛素信号通路提高胰岛素抵抗大鼠的胰岛素敏感度四１。研究发现２型糖尿病患者当血糖升高时，骨骼肌组织的ＧＬＵＴ４ｍＲＮＡ表达下降，葡萄糖转运率降低，与ＡＭＰＫａ２密切相关１１０１。ＡＭＰＫ的激动剂或者ＡＴＰ减少，ＡＭＰ／ＡＴＰ比值增大，或者肌肉收缩时可以通过ＡＭＰＫ途径增加ＧＬＵＴ４向胞膜的转位，从而增加葡萄糖向细胞内的转运，增加葡萄糖的利用。在脂肪组织中此途径有所不同，可能是通过Ｐ３８ＡＭＰＫ依赖的机制激活脂肪细胞ＧＬＵＴ４向胞膜的转位，，以此来增加葡萄糖的摄取Ⅲ１。此外，ＡＭＰＫ还可以通过调节糖酵解的限速酶如６．磷酸果糖２．激酶含量直接调节糖酵解途径，也可以通过抑制糖异生酶如磷酸烯醇式丙酮酸激酶（ＰＲＰＣＫ）抑制糖异生过程。在肝脏，有研究发现ＬＫＢｌ介导的ＡＭＰＫ激活对于二甲双胍的降糖作用是必需的［１２１。６ＡＭＰＫ与胰岛素敏感性所谓“糖脂病”即指脂代谢障碍加重或引起糖代谢异常的概念。不难理解在骨骼肌，肝脏胰岛素作用的两个重要的靶组织中，ＡＭＰＫ可以减少甘油三酯的异位堆积，增强脂肪酸的氧化，调节脂代谢紊乱，减少脂毒性。ＡＭＰＫ可以通过促进ＧＬＵＴ４的转运来增加葡萄糖的摄取，来调节糖代谢。糖脂代谢调节平衡可以减轻胰岛素抵抗。ＡＭＰＫ可以减轻胰岛Ｄ细胞脂毒性，有抗Ｄ细胞凋亡的作用，可以改善胰岛素分泌的调节。有研究显示，ＡＩＣＡＲ诱导的ＡＭＰＫ活化减少了葡萄糖刺激的胰岛素分泌‘１３１。７ＡＭＰＫ与脂肪细胞因子许多脂肪细胞因子如脂联素，瘦素，抵抗素等可通过激活ＡＭＰＫ来参与调节胰岛素抵抗¨４’１５’１６’１７１。这些因子可激活ＡＭＰＫ，来刺激脂肪酸氧化和葡萄糖的氧化，或降低糖异生，减少肝糖原输出等，来改善胰岛素敏感性。脂肪组织分泌的大量生物活性物质统称为脂肪细胞因子（包括脂联素、瘦素、抵抗素、ａｐｅｌｉｎ等）。脂肪细胞因子对血糖水平及外周组织胰岛素敏感性行使天津医科大学博士学位论文综述正负两方面的调控作用，与胰岛素抵抗、代谢综合征密切相关。血清脂联素水平与机体的胰岛素敏感性呈正相关。对居住在非洲和欧洲的美国人进行的调查显示，代谢性疾病和胰岛素抵抗的发生与低分子量的脂联素和脂联素三聚物呈负相关，而高分子量的脂联素在其中作用较小１１８１０脂联素具有促进糖脂代谢、减轻胰岛素抵抗、抗炎以及抗动脉粥样硬化等作用，研究表明上述作用均依赖于ＡＭＰＫ的激活［１９１０在脂肪组织，脂联素通过促进ＡＭＰＫｌ７２位苏氨酸磷酸化和促进ＡＭＰＫ下游的限速酶－ＡＣＣ７９位丝氨酸的磷酸化，从而促进脂肪细胞摄取葡萄ｔ２０１０在骨骼肌，脂联素主要通过促进ＡＭＰＫ的磷酸化，从而激活其下游靶点ＭＡＰＫ，增强ＰＰＡＲ０ｔ的转录活性及其靶基因的表达，进而促进脂肪酸氧化，降低脂质在骨骼肌细胞中的沉积１２１１。在肝脏，脂联素通过激活ＡＭＰＫ，下调葡萄糖．６．磷酸酶的表达，从而减少肝糖原输出。瘦素与胰岛素敏感指数呈明显负相关［２２１０一方面，瘦素作用于下丘脑，降低食欲和食物摄入从而影响能量代谢平衡。另一方面，瘦素可活化骨骼肌和肝脏内的ＡＭＰＫ，加速脂肪酸分解，通过此途径并可能协同中枢神经系统作用，降低骨骼肌和肝脏中的脂质沉积ｔ２３１０抵抗素可作用于脂肪组织、肝脏及骨骼肌等胰岛素靶器官，促进肝糖原输出，导致胰岛素抵抗，上述作用可通过抑制ＡＭＰＫ活性介导。研究表明，将大鼠骨骼肌细胞与抵抗素共孵育２４ｈ，能降低脂肪酸氧化，并伴随ＡＭＰＫ和ＡＣＣ磷酸化水平降低，提示ＡＭＰＫ介导了抵抗素抑制脂肪酸摄取和利用的过程１２４］ｏ在肝脏高表达抵抗素的小鼠模型中，存在肝脏胰岛素抵抗，表现为空腹血糖明显升高，糖耐量减低和高胰岛素血症；敲除抵抗素基因后，小鼠表现出正常的血糖水平和胰岛素敏感性，这可能是通过磷酸化ＡＭＰＫ，抑制糖异生基因表达实现的ｔ２５１。Ａｐｅｌｉｎ主要是由脂肪细胞分泌的一种生物活性肽。有报道指出ａｐｅｌｉｎ可受到胰岛素的作用而表达增加，而在糖皮质激素的作用下可出现下调１２６１０研究发现，ａｐｅｌｉｎ可以通过ＡＭＰＫ磷酸化等途径促进外周组织摄取葡萄糖，进而改善糖耐量受损１２７１。这说明ａｐｅｌｉｎ有可能作为一种胰岛素相关信号分子参与机体胰岛素抵抗的调控，从而起到有益的保护作用。二、ＰＰＡＲ了与糖、脂代谢及胰岛素敏感性过氧化物酶体增殖物激活受体丫是一种配体活化的核转录因子，具有多种生物学效应。除能调节脂肪细胞分化、脂代谢，细胞增殖、细胞周期外，还能调控细胞因子生成，增强机体对胰岛素的敏感性等作用。天津医科大学博士学位论文综述１ＰＰＡＲｓ的分型及配体过氧化物酶体增殖物活化受体（Ｐ眦ｓ）是一类由配体激活的转录因子，它有三种亚型，分别是ＰＰＡＲａ、ＰＰＡＲｌ３／８和ＰＰＡＲ？眨８、２９１。它们由不同的基因编码，结构、功能各不相同，与不同的配体结合不同的部位，产生的分子构型也不同，诱发生物学效应的组织与基因也不同。ＰＰＡＲ？是目前研究最为广泛的一种，它是一种活性配体转录蛋白，主要表达于脂肪细胞，巨噬细胞，影响脂肪细胞的分化和成熟脂肪细胞中脂肪酸的吸收和存储。ＰＰＡＲ？由５个结构域组成，即Ｎ２末端配体非依赖转录活化域、ＤＮＡ结合域、铰链区、配体结合域和Ｆ域‘３０’川。这种结构使得ＰＰＡＲ？具有既可与ＤＮＡ结合，又可与配体结合的特性。ＤＮＡ结合域由两个锌指结构组成，可特异结合靶基因ＰＰＡＲ反应元件（ＰＰＡＲｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｅｌｅｍｅｎｔ，ＰＰＲＥ）。ＰＰＡＲｓ转录后的调控作用依赖于与配体的结合。ＸｒｅｃｅｐＰＰＡＲｓ不能自身形成同源二聚体，而是与ＲＸＲａ（ｒｅｔｉｎｏｉｄｔｏｒＯ形成异源二聚体。当有ＰＰＡＲ和、或与ＲＸＲ｛１激动剂结合时，ＰＰＡＲ／ＲＸＲａ二聚体构象发生改变，并结合到靶基因启动子区的ＰＰＲＥ上，从而发挥转录调控作用，调节靶基因表达口刀。它可以与视黄酸受体ＲＸＲ结合成二聚体，再与过氧化体增值反应元件（即ＰＰＩ也）结合，调节目的基因转录。ＰＰＡＲ７的配体分为天然配体和合成配体，前者主要是多种食物源性脂肪酸及其衍生物，包括前列腺素Ｊ２，１５．脱氧前列腺素Ｊ２等，后者主要是Ｉ塞唑烷二酮（ＴＺＤ）类降糖药，如吡格列酮，罗格列酮。双胍类与ＰＰＡ脚的激活之间的具体机制尚不明确，有文献记载ＡＭＰＫ可以激活多种转录因子，尤其需要指出的是可以激活过氧化物酶体增殖物激活受体ＰＰＡＲａ，而且是通过ＰＰＡＲ７共激活子ｌａ（ＰＧＣｌａ）介导完成的，提示二甲双胍对ＰＰＡＲ７的活化是通过先激活ＡＭＰＫ间接激活的Ｂ３’３４１。２ＰＰＡＲｙ与脂肪细胞分化脂肪细胞由起源于中胚层的多能干细胞，经间质前体细胞，前脂肪细胞，最后到成熟脂肪细胞逐步分化发育而形成的。ＰＰＡＲｓ的三种亚型中，ＰＰＡ脚最具脂肪组织特异性，脂肪组织的分化过程受到ＰＰＡＲ７／Ｒ．ＸＲ异二聚体、ＣＣＡＡＴＴ增强子结合蛋白（Ｃ／ＥＢＰ）及脂肪细胞分化决定因子１／固醇调控元件结合蛋白ｌ（ＡＤＤｌ／ＳＲＥＢＰｌ）共同调控Ｂ５’３６１。已有许多实验研究发现，ＰＰＡＩⅥ和、或Ｃ／ＥＢＰ过少的表达都会造成脂肪细胞分化障碍，二者对脂肪分化起着协同促进的作用，值得注意的是Ｐ呐过度表达也会产生严重的脂代谢紊乱。由此可见ＰＰ触Ⅵ对天津医科大学博士学位论文综述脂肪形成过程既是必要的也是充分的，起着核心的作用。而且ＰＰＡＲｌ，的表达随着白色小脂肪细胞的分化不断增加，至成熟脂肪细胞达最高。Ｐ呐是脂肪形成的主要的调节因子，是诱导小脂肪细胞形成的特异性转录因子，它的活化转录作用可以影响参与脂肪细胞分化过程中细胞因子的信号传导途径ｔ３７１。如胰岛素样生长因子．１（ＩＧＦ．１），增加脂肪组织特异性基因的表达；表皮生长因子，转化生长因子，肿瘤坏死因子（ＴＮＦ．０【），抑制脂肪细胞分化过程，胰岛素，糖皮质激素，胞内ｃＡＭＰ均可诱导并促进脂肪细胞分化过程。３ＰＰＡＲｌ，与脂类代谢ＰＰＡ脚主要表达于脂肪细胞，在对脂肪细胞分化起关键的启动作用的同时，：对脂类代谢过程和脂肪酸氧化有重要作用。脂肪细胞也是活跃的内分泌细胞，它可以分泌在脂肪细胞自身以及其它组织细胞之间传递信息的信号蛋白，如瘦素，肿瘤坏死因子，脂联素等。ＰＰＡ脚调节脂类代谢的作用重要的一点就是调节这些细胞因子的表达。ＰＰＡＩｑ调控参与脂类代谢相关的靶因子的表达途径，正向调节脂肪的储存与释放，维持机体能量平衡。①活化的ＰＰＡＲｌ，与ＰＰＲＥ相互作用，能够增加促进脂肪酸储存的基因的表达：脂肪酸转运蛋白（ＦＡＴＰ），脂蛋白脂酶（ＬＰＬ），脂肪酸结合蛋白，ＣＤ３６／脂肪酸异位酶（ＣＤ３６爪盯），乙酰辅酶Ａ合成酶（ＡＣＳ）等，从而促进脂解和脂肪酸释放１３８１。还有些与脂肪酸储存相关的基凶：过氧化物酶体脂肪酸氧化酶系，。肾上腺素能受体，瘦素，肿瘤坏死因子（ＴＮＦ一０【）当ＰＰＡ脚降低这些基因的表达时，可减缓脂解和脂肪酸释放，降低游离脂肪酸的量。说明ＰＰＡＲ３，可以调节脂肪酸代谢的各个环节。②当ＰＰＡＲ丫被ＴＺＤｓ激活后，可诱导肝细胞表达载脂蛋白，脂蛋白脂酶等，促进脂质氧化，使高密度脂蛋白（ＨＤＬ）升高，低密度脂蛋白（ＬＤＬ），甘油三酯（ＴＧ）降低，纠正脂代谢紊乱。同时，ＰＰＡＩⅥ调节胆固醇反转运物（ＡＢＣＡＩ），肉毒碱乙酰肉毒碱转运酶（ＣＡＣＩ）的表达，促进高密度脂蛋白对胆固醇的转运，从而达到降低胆固醇的作用ｔ３９１。４ＰＰＡＲｙ与糖代谢和胰岛素敏感性ＰＰＡＲｌ，对糖代谢的调节主要是通过增加外周组织对胰岛素的敏感，从而改善胰岛素抵抗。在肌肉中葡萄糖和脂肪酸作为能量供给时相互竞争，结果，脂肪酸水平升高干扰了葡萄糖的利用；在肝中，游离脂肪酸（ＦＦＡ）的增加与升高的葡萄糖和糖异生紧密相关。ＰＰＡＲｌ，激活剂可以促进脂肪组织中脂肪酸的吸收和储存。降低循环中甘油三脂和游离脂肪酸的水平，ＰＰＡＲ３，的合成激动剂ＴＺＤｓ类药物就５２天津医科大学博士学位论文综述是通过增加胰岛素作用而刺激肌肉葡萄糖的利用，抑制肝脏肝糖原的输出。脂肪组织中ＰＰＡＲｙ增加胰岛素敏感性的可能机制是：＠ＰＰＡＫｙ激活可以促进胰岛素依赖的磷脂酰基醇３激酶（Ｐ１３Ｋ）信号通路中Ｐ１３Ｋ基因的表达［４０ｌｊＰ１３Ｋ是是一种介导葡萄糖进入靶细胞的脂质激酶，从而增强胰岛素敏感性。②还可以通过促进脂肪组织和骨骼肌组织中ＧＬＵＴ４基因的表达，促进对葡萄糖的摄取，来改善胰岛素敏感性。（重）ＰＰＡＲｙ也可以通过调节脂质代谢紊乱，促进脂质及脂肪酸的代谢，及增加甘油三酯在脂肪组织的合成，减少脂肪组织，肌肉组织，肝脏等组织的脂毒性，从而改善胰岛素抵抗。＠ＰＰＡＲｙ可以通过抑制转录因子ＰＡＸ６的活性，实现在转录水平，及受体前水平抑制胰高血糖素的生成，来抑制肝糖原的输出，达到增加胰岛素敏感性的作用［４１１０⑤ＰＰＡＩⅥ通过对某些脂肪细胞因子分泌的调节来改善胰岛素敏感性，如通过抑制ＴＮＦ．０【和抵抗素的表达，促进脂联素的表达是增加胰岛素敏感性的机制之一。关于ＡＭＰＫ和ＰＰＡ脚信号通路及其介导的许多代谢途径，尤其是在肌肉，肝脏，脂肪组织靶组织的作用机制有了较为深入的研究。二甲双胍作为ＡＭＰＫ的激活剂在临床具有举足轻重的地位，而具有多种生物学疗效的ＰＰＡＲ７与二甲双胍之间又存在怎样的关系，也是许多实验研究的重点。继续更深入的了解ＡＭＰＫ和ＰＰＡＩｑ作用的分子机制，以更好的指导临床，制备出更有效且副作用少的新一代药物是研究的最终目的。综述参考文献【１】ＳｃｏｔｔＪＷ，ＲｏｓｓｋｉｎａｓｅｂｙａＦＡ，ＬｉｕＪＫ，ｅｔａｌ．ＲｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｏｎＡＭＰ－－ａｃｔｉｖａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎＪ，２００７，ｐｓｅｕｄｏｓｕｂｓｔｒａｔｅｓｅｑｕｅｎｃｅｔｈｅｇａｍｍａｓｕｂｕｎｉｔ［Ｊ】．ＥＭＢＯ２６（３）：８０６—８１５．【２】ＭｕｓｉＮ，ＨｉｒｓｈｍａｎＭＦ，ＮｙｇｒｅｎＪ，ｅｔａｌ．ＭｅｔｆｏｒｍｉｎｉｎｃｒｅａｓｅｓＡＭＰ－ａｃｔｉｖａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙｉｎｓｋｅｌｅｔａｌｍｕｓｃｌｅｏｆｓｕｂｊｅｃｔｓｗｉｔｈｔｙｐｅ２ｄｉａｂｅｔｅｓ．【Ｊ】．Ｄｉａｂｅｔｅｓ，２００２，５１（７）：２０７４—２０８１．【３】买淑鹏，李晓山，徐增光，等．高脂饮食对大鼠脂肪组织ＡＭＰ激活的蛋白激酶表达的影响．营养学报，２００８，３０（３）：２５３—２５６．【４】ＺｏｕＭＨ，ＫｉｒｋｐａｔｒｉｃｋＳＳ，ＤａｖｉｓＢＪ，ｅｔａｌ．ＡｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆｌｈｅＡＭＰ－ａｃｔｉｖａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅｂｙｔｈｅａｎｔｉ—ｄｉａｂｅｔｉｃｄｒｕｇｍｅｔｆｏｒｍｉｎｉｎｖｉｖｏ．Ｒｏｌｅｏｆｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌｒｅａｃｔｉｖｅｎｉｔｒｏｇｅｎｓｐｅｃｉｅｓ．［Ｊ］．ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ，２００４，２７９（４２）：４３９４０—４３９５１．天津医科大学博士学位论文综述【５】ＨｅｎｉｎＮ，ＶｉｎｃｅｎｔＭＦ，ＧｒｕｂｅｒＨＥ，ｅｔａｌ．ＩｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆｆａｔｔｙｓｙｎｔｈｅｓｉｓｂｙｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎａｃｉｄａｎｄｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌＪ，１９９５，９（７）：ｏｆＡＭＰ—ａｃｔｉｖａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅ［Ｊ］．ＦＡＳＥＢ５４ｌ一５４６．１６１ＳｕｌｌｉｖａｎＪＥ，ＢｒｏｃｋｌｅｈｕｒｓｔＫＪ，ＭａｒｌｅｙＡＥ，ｅｔａｌ．ＩｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆｌｉｐｏｌｙｓｉｓａｎｄｌｉｐｏｇｅｎｅｓｉｓｉｎｉｓｏｌａｔｅｄｒａｔａｄｉｐｏｃｙｔｅｓｗｉｔｈＡＩＣＡＲ，ａｃｅｌｌ－ｐｅｒｍｅａｂｌｅａｃｔｉｖａｔｏｒｏｆＡＭＰ—ａｃｔｉｖａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅ［Ｊ】．ＦＥＢＳＬｅｔｔ，１９９４，３５３（１）：３３—３６．ＣＳ，ＬｅｅＨＧ，ｅｔａｌ．Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙｅｆｆｅｃｔ［７１ＭｏｏｎＨＳ，Ｃｈｕｎｇｇａｌｌａｔｅｏｎｏｆ（一）一ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ．３一ｌｉｐｉｄａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎｏｆ３Ｔ３一Ｌ１ｃｅｌｌｓ．［Ｊ】．Ｏｂｅｓｉｔｙ（ｓｉｌｖｅｒｓｐｒｉｎｇ），２００７，１５（１１）：２５７１—２５８２．【８１ＭｃＧｅｅＳＬ，ｅｔａｌ．ＡＭＰ－ＡｃｔｉｖａｔｅｄｂｙＰｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｎｇＰｒｏｔｅｉｎＫｉｎａｓｅＲｅｇｕｌａｔｅｓＤｅａｃｅｔｙｌａｓｅＧＬＵＴ４５．ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＨｉｓｔｏｎｅ［Ｊ】．Ｄｉａｂｅｔｅｓ，２００８，５７（４）：８６０－８６７．［９１ＷｒｉｇｈｔｇｌｕｃｏｓｅｓｏｌｅｕｓＤＣ，ＧｅｉｇｅｒＰＣ，ＨｏｌｌｏｓｚｙＪＯ，ｅｔａｌ．Ｃｏｎｔｒａｃｔｉｏｎ－ａｎｄｈｙｐｏｘｉａ－ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄｉｓｍｅｄｉａｔｅｄｂｙａｔｒａｎｓｐｏｒｔＣａ２＋一ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｍｅｃｈａｎｉｓｍｉｎｓｌｏｗ－ｔｗｉｔｃｈｒａｔｍｕｓｃｌｅ．［Ｊ】．ＡｍＪＰｈｙｓｉｏｌＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌＭｅｔａｂ，２００５，２８８（６）：１０６２—１０６６．【１０１ＳａｋｏｄａＨ，ＯｇｉｈａｒａＴ，ＡｎａｉＭ，ｅｔａｌ．ＡｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆＡＭＰＫｉｓｅｓｓｅｎｔｉａｌｆｏｒＡＩＣＡＲ—ｉｎｄｕｃｅｄｇｌｕｃｏｓｅｕｐｔａｋｅｂｙｓｋｅｌｅｔａｌｍｕｓｃｌｅｂｕｔｎｏｔＰｈｙｓｉｏｌＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ［Ｊ］．ＡｍＪＭｅｔａｂ，２００２，２８２（６）：１２３９—１２４４．Ｓ，ＫａｔａｈｉｒａＨ，ＯｚａｗａＳ，ｅｔａｌ．ＡｃｔｉｖａｔｏｒｓｏｆＡＭＰ．ａｃｔｉｖａｔｅｄａｎ【１１】ＹａｍａｇｕｃｈｉｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅｅｎｈａｎｃｅＧＬＵＴ４ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ３Ｔ３－Ｌ１ｉｔｓｇｌｕｃｏｓｅｔｒａｎｓｐｏｒｔａｃｔｉｖｉｔｙｉｎａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ［Ｊ］．ＡｍＪＰｈｙｓｉｏｌＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌＭｅｔａｂ，２００５，２８９（４）：Ｅ６４３－－６４９．【１２１ＳｈａｗＲＪ，ＬａｍｉａＫＡ，ＶａｓｑｕｅｚＤ，ｅｔａｌ．ＴｈｅｋｉｎａｓｅＬＫＢ１ｍｅｄｉａｔｅｓｇｌｕｃｏｓｅｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓｉｎｌｉｖｅｒａｎｄｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｅｆｆｅｃｔｓｏｆ３１０（５７５４）：１６４２—１６４６．ｍｅｔｆｏｒｍｉｎ．【Ｊ】Ｊ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００５，【１３】ｄａＳｉｌｖａＸａｖｉｅｒＧＬｅｃｌｅｒｃＩ，ＶａｒａｄｉＡ，ｅｔａｌ．ＲｏｌｅｆｏｒＡＭＰ—ａｃｔｉｖａｔｅｄＰｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅｉｎｇｌｕｃｏｓｅ—ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄｉｎｓｕｌｉｎｓｅｃｒｅｔｉｏｎａｎｄｐｒｅｐｒｏｉｎｓｕｌｉｎｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．［Ｊ］Ｊ．ＢｉｏｃｈｅｍＪ，２００３，３７１（３）：７６１－７７４．【１４】ＹａｍａｕｃｈｉＴ，ＫａｍｏｎＪ，ＭｉｎｏｋｏｓｈｉＵｔｉｌｉｚａｔｉｏｎＹ，ｅｔａｌ．Ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎｓｔｉｍｕｌａｔｅｓｇｌｕｃｏｓｅａｎｄｆａｔｔｙ－ａｃｉｄｏｘｉｄａｔｉｏｎｂｙａｃｔｉｖａｔｉｎｇＡＭＰ－ａｃｔｉｖａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅ［Ｊ］．ＮａｔＭｅｄ，２００２，８（１１）：１２８８—１２９５．【１５】ＷｕＸ，ＭｏｔｏｓｈｉｍａＨ，ＭａｈａｄｅｖＫ，ｅｔａｌ．ＩｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔｏｆＡＭＰ．Ａｃｔｉｖａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎ天津医科大学博士学位论文综述ＫｉｎａｓｅｉｎＧｌｕｃｏｓｅＵｐｔａｋｅＳｔｉｍｕｌａｔｅｄｂｙｔｈｅＧｌｏｂｕｌａｒＤｏｍａｉｎｏｆＡｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎｉｎＰｒｉｍａｒｙＲａｔＡｄｉｐｏｃｙｔｅｓ［Ｊ］．Ｄｉａｂｅｔｅｓ，２００３，５２（６）：１３５５—１３６３．【１６１ＭｃＧａｒｒｙＪＤ．ＢａｎｔｉｎｇＬｅｃｔｕｒｅ２００１：ＤｙｓｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆＦａｔｔｙＡｃｉｄＭｅｔａｂｏｌｉｓｍＩｎｔｈｅＥｔｉｏｌｏｇｙｏｆＴｙｐｅ２Ｄｉａｂｅｔｅｓ［Ｊ］．Ｄｉａｂｅｔｅｓ，２００２，５１（１）：７—１８【１７】ＳａｔｏｈＨ，ＮｇｕｙｅｎＭＴ，ＭｉｌｅｓＰＤ，ｅｔａｌ．Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ—ｍｅｄｉａｔｅｄｃｈｒｏｎｉｃ”ｈｙｐｅｒｒｅｓｉｓｔｉｎｅｍｉａ”ｌｅａｄｓｔｏｉｎｖｉｖｏｉｎｓｕｌｉｎｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｉｎｎｏｒｍａｌｒａｔｓ［Ｊ］．ＣｌｉｎＩｎｖｅｓｔ，２００４，１１４（２）：２２４—２３１．【１８１Ｌａｒａ－ＣａｓｔｒｏＣ，ＤｏｕｄＥＣ，ＴａｐｉａＰＣ，ｅｔａｌ．Ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎｍｕｌｔｉｍｅｒｓａｎｄｍｅｔａｂｏｌｉｃｓｙｎｄｒｏｍｅｔｒａｉｔｓ：ｒｅｌａｔｉｖｅａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｉｎＡｆｒｉｃａｎＡｍｅｒｉｃａｎｓ．Ｏｂｅｓｉｔｙ（ＳｉｌｖｅｒＳｐｒｉｎｇ），２００８，１６（１２）：２６１６－２６２３．【１９１ＡｈｉｍａＲＳ．Ａｄｉｐｏｓｅｔｉｓｓｕｅａｓａｎｅｎｄｏｃｒｉｎｅｏｒｇａｎ［Ｊ］．Ｏｂｅｓｉｔｙ，２００６，１４（５）：２４２—２４９．【２０】ＷｕＸ，ＭｏｔｏｓｈｉｍａＨ，ＭａｈａｄｅｖＫ，ｅｔａｌ．ＩｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔｏｆＡＭＰ—ａｃｔｉｖａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅｉｎｇｌｕｃｏｓｅｕｐｔａｋｅｓｔｉｍｕｌａｔｅｄｂｙｔｈｅｇｌｏｂｕｌａｒｄｏｍａｉｎｏｆａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎｉｎｐｒｉｍａｒｙｒａｔａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ．【Ｊ】．Ｄｉａｂｅｔｅｓ，２００３，５２（６）：１３５５—１３６３．［２１】ＹｏｏｎＭＪ，ＬｅｅＧＹＣｈｕｎｇＪＪ，ｅｔａｌ．ＡｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎｉｎｃｒｅａｓｅｓｆａｔｔｙａｃｉｄｏｘｉｄａｔｉｏｎｉｎｓｋｅｌｅｔａｌｍｕｓｃｌｅｃｅｌｌｓｂｙｓｅｑｕｅｎｔｉａｌａｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆＡＭＰ－ａｃｔｉｖａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅ，ｐ３８ｍｉｔｏｇｅｎ—ａｃｔｉｖａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅ，ａｎｄｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ－ａｃｔｉｖａｔｅｄｒｅｃｅｐｔｏｒａｌｐｈａ．［Ｊ】．Ｄｉａｂｅｔｅｓ，２００６，５５（９）：２５６２—２５７０．【２２】翟玲玲，赵剑，姚兴家，等．肥胖与肥胖抵抗大鼠瘦素、胰岛素水平分析．中国公共卫生，２００７，２３（７）：７８５－７８６．［２３】ＷａｋｉＨ，ＴｏｎｔｏｎｏｚＥＥｎｄｏｃｒｉｎｅｆｕｎｃｔｉｏｎｓｏｆａｄｉｐｏｓｅｔｉｓｓｕｅ．［Ｊ】．ｍｎｎｕＲｅｖＰａｔｈｏｌ，２００７，２：３１—５６．【２４１ＰａｌａｎｉｖｅｌＲ，ＳｗｅｅｎｅｙＧ．ＲｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｆａｔｔｙａｃｉｄｕｐｔａｋｅａｎｄｍｅｔａｂｏｌｉｓｍｉｎＬ６ｓｋｅｌｅｔａｌｍｕｓｃｌｅｃｅｌｌｓｂｙｒｅｓｉｓｔｉｎ．［Ｊ】．ＦＥＢＳＬｅｔｔ，２００５，５７９（２２）：５０４９—５０５４．【２５】ＳｕｌＨＳ．ＲｅｓｉＳｔｉｎ／ＡＤＳＦ／ＦＩＺＺ３ｉｎｏｂｅｓｉｔｙａｎｄｄｉａｂｅｔｅｓ．［Ｊ］．ＴｒｅｎｄｓＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌＭｅｔａｂ，２００４，１５（６）：２４７－２４９．【２６】ＷｅｉＬ，ＨｏｕＸ，ＴａｔｅｍｏｔｏＫ．ＲｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆａｐｅｌｉｎｍＲＮＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｂｙｉｎｓｕｌｉｎａｎｄｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄｓｉｎｍｏｕｓｅ３Ｔ３一Ｌ１ａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ．【Ｊ】．ＲｅｇｕｌＰｅｐｔ，２００５，１３２（１—２）：２７．３２．［２７１ＤｒａｙＣ，ＫｎａｕｆＣ，ＤａｖｉａｕｄＤ，ｅｔａｌ．ＡｐｅｌｉｎＳｔｉｍｕｌａｔｅｓＧｌｕｃｏｓｅＵｔｉｌｉｚａｔｉｏｎｉｎ５５天津医科大学博士学位论文ＮｏｒｍａｌａｎｄＯｂｅｓｅ综述Ｉｎｓｕｌｉｎ－ＲｅｓｉｓｔａｎｔＭｉｃｅ．【Ｊ］．ＣｅｌｌＭｅｔａｂ，２００８，８（５）：４３７—４４５．ａｎｄＩｍｍｕｎｅＳｙｓｔｅｍ—ＷｈａｔＤｏＷ．ｅＫｎｏｗ？叨．［２８】ＺｈａｎｇＸ，ＹｏｕｎｇＨＡ．ＰＰＡＲＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＩｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ，２００２，２（８）：１０２９—１０４４．ｏｆＧｌｙｃｅｍｉｃＣｏｎｔｒｏｌ【２９】ＫｅｎｄａｌｌＭ，ＲｕｂｉｎＣＪ，Ｍｏｈｉｄｅｅｎ，ｅｔａｌ．ＩｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔＴｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅｓ，ａｎｄＨＤＬＣｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌＬｅｖｅｌｓＷｉｔｈＭｕｒａｇｌｉｔａｚａｒ，ａＤｕａｌ（嘶）Ｔｙｐｅ２ｄｏｕｂｌｅ—ｂｌｉｎｄ，ＰｅｒｏｘｉｓｏｍｅＰｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ－ＡｃｔｉｖａｔｅｄＲｅｃｅｐｔｏｒＡｃｔｉｖａｔｏｒ，ｉｎＰａｔｉｅｎｔｓＤｉａｂｅｔｅｓＩｎａｄｅｑｕａｔｅｌｙＣｏｎｔｒｏｌｌｅｄＷｉｔｈＷｉｔｈＭｅｔｆｏｒｍｉｎＭｏｎｏｔｈｅｒａｐｙ：Ａｓｔｕｄｙ．【Ｊ】．Ｄｉａｂｅｔｅｓｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ，ｐｉｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ—ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ１０１６．１０２３．Ｃａｒｅ，２００６，２９（５）：［３０１ＹａｎｇＸ巧ＷａｎｇＬＨ。Ｃｈｅｎ乃ｅｔａｌ。ＡｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆＨｕｍａｎＴＬｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓｉｓＩｎｈｉｂｉｔｅｄｂｙＰｅｒｏｘｉｓｏｍｅＰｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ－ａｃｔｉｖａｔｅｄＲｅｃｅｐｔｏｒＣＯ．ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｗｉｔｈＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＦａｃｔｏｒ．４５４４．７（ＰＰＡＲ７）ａｇｏｎｉｓｔｓ．ＰＰＡ脚Ｃｈｅｍ，２０００，２７５（７）：４５４１ＮＦＡＴ［Ｊ】．ＪＢｉｏｌ【３ｌ】嗽ａｈａｓｈｉＮ，ＧｏｔｏＴ’ＫｕｓｕｄｏＴｅｔａｌ．ＴｈｅＳｔｒｕｃｔｕｒｅｓａｎｄＦｕｎｃｔｉｏｎｓｏｆＲｅｃｅｐｔｏｒｓ（ＰＰＡＲｓ）【Ｊ】．ＮｉｐｐｏｎＲｉｎｓｈｏ，２００５，６３ＰｅｒｏｘｉｓｏｍｅＰｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ（４）：５５７—５６４．［３２１ＴａｋａｈａｓｈｉＳ，ＴａｎａｋａＴ，ｋｏｄａｍａｔ，ｅｔａ１．ＰｅｒｏｘｉｓｏｍｅＰｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒａｃｔｉｖａｔｅｄＲｅｃｅｐｔｏｒＤｅｌｔａ（ＰＰＡＲｄｅｌ２ｔａ），ａＮｏｖｅｌＴａｒｇｅｔＳｉｔｅｆｏｒＤｒｕｇＤｉｓｃｏｖｅｒｙｉｎＭｅｔａｂｏｌｉｃＳｙｎｄｒｏｍｅ【Ｊ】．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌｒｅｓｅａｒｃｈ，２００６，５３（６）：５０１—５０７．［３３】ＧｕｏＨ，ＳｕｎＳ，ＺｈａｎｇＸ，ｅｔａｌ．ＡＭＰＫｅｎｈａｎｃｅｓｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｐａｎｃｒｅａｔｉｃｎｏｔｄｕｏｄｅｎａｌｈｏｍｅｏｂｏｘ．１ｖｉａＰＰＡＲａ，ｂｕｔＰＰＡＲｒ，ｉｎｒａｔｉｎｓｕｌｉｎｏｍａｃｅｌｌｌｉｎｅＩＮＳ．１［Ｊ】．ＡｃｔａＰｈａｒｍａｃｏｌ【３４１ＧｕｏＨ，ＺｈａｎｇＳｉｎ，２０１０，３１（８）：９６３－９６９．ｅｔａｌ．ＳｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎｅｆｆｅｃｔｓｏｆＡＩＣＡＲｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ－ａｃｔｉｖａｔｅｄｒｅｃｅｐｔｏｒｏｎＸＪ，ＷａｎｇＦ＇ＷａｎｇＹｉｎｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅｉｎｓｕｌｉｎｓｅｃｒｅｔｉｏｎｃｈａｎｇｅｓｉｎｉｎｖｏｌｖｅｄｇａｍｍａＩＮＳ一１ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．ＪＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌＩｎｖｅｓｔ．２０１０，３３（７）：４６５－４７１．【３５】ＬｏｒｄＥ，ＭｕｒｐｈｙＢＤ，ＤｅｓｍａｒａｉｓＪＡ，ｅｔａｌ．ＭｏｄｕｌａｔｉｏｎＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｓｏｆＰｅｒｏｘｉｓｏｍｅＰｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ－ａｃｔｉｖａｔｅｄＲｅｃｅｐｔｏｒＤｅｌｔａａｎｄＧａｍｍａＴｉｓｓｕｅＤｕｒｉｎｇＥａｒｌｙｉｎＳｗｉｎｅＥｎｄｏｍｅｔｒｉａｌＧｅｓｔａｔｉｏｎ【Ｊ】．Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，２００６，１３１（５）：９２９－９４２．ＳＲ，ＰｉｌｃｈＰＥＧｌｕｔ４ＳｔｏｒａｇｅＶｅｓｉｃｌｅｓｗｉｔｈｏｕｔＧｌｕｔ４：【３６】ＧｒｏｓｓＤＮ，ＦａｒｍｅｒＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌＲｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆＩｎｓｕｌｉｎ—ＤｅｐｅｎｄｅｎｔＶｅｓｉｃｕｌａｒＴｒａ衔ｃ［Ｊ］．ＭｏｌＣｅｌｌＢｉｏｌ，２００４，２４（１６）：７１５１．７１６２．天津医科大学博士学位论文【３７】ＡｄａｍｓＭｅｔａｌ．Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌａｃｔｉｖａｔｉｏｎｂｙｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ－ａｃｔｉｖａｔｅｄａｃｏｎｓｅｎｓｕｓｒｅｃｅｐｔｏｒ丫ｉｓｉｎｈｉｂｉｔｅｄｂｙｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎａｔｋｉｎａｓｅｍｉｔｏｇｅｎ－ａｃｔｉｖａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｓｉｔｅ［Ｊ】．ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ，１９９７，２７２（８）：５１２８—５１３２．ＢｒｏｗｎＪＤ，ＰｌｕｔｚｋｙＪ．Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ－ａｃｔｉｖａｔｅｄｒｅｃｅｐｔｏｒｓａｓ【３８】ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｎｏｄａｌｐｏｉｎｔｓａｎｄｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ５１８．５３３．ｔａｒｇｅｔｓ［Ｊ】．ＣｉｒＣｕｌａｔｉｏｎ，２００７，１１５（４）：［３９１ＲｉｃｏｔｅＭ，ＧｌａｓｓＣＫ．ＮｅｗｒｏｌｅｓｆｏｒＰＰＡＲｓｉｎｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ［Ｊ］．ＴｒｅｎｄｓＰｈａｒｍａｃｏｌＳｃｉ，２００１，２２（９）：４４１－４４３；ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ４４４．【４０】陈永熙，王伟铭，周同，等．ＰＰＡＲ．Ｙ作用及其相关信号转导途径［Ｊ】．细胞生物学杂志，２００６，２８（３）：３８２—３８６．［４１】程万里，王彦华，贾国洪．ＰＰＡＲ－ａ，ＰＰＡＲ－７和胰岛素抵抗及糖尿病【Ｊ】．邯郸医学高等专科学校学报，２００５，１８（４）：２９２－２９４．５７天津医科大学博士学位论文致谢致谢在三年的研究生学习生活即将结束之际，衷心向每一位给予我关心和帮助的老师、同学和亲朋好友致以最诚挚的感谢。首先我由衷地感谢敬爱的导师冯凭教授。在本课题的设计、实施及总结过程中给予了严格教诲和悉心指导。恩师高尚的医德、精湛的医术、渊博的知识、缜密的科研思路、敏锐的科研头脑和对事业兢兢业业、无私奉献的精神使我受益匪浅！感谢华北煤炭医学院附属医院内分泌科金秀平、陈冬、王颖、马绍杰、贾伟、魏剑芬老师，王玉香护士长及全体医护人员三年来对我悉心的指导和帮助。感谢我的好友王红阳、高捷、邢军在做实验过程中给予的无私帮助。感谢我的师兄刘清军在学业中的热情帮助。感谢研究生部潘老师在三年来学习和生活中的关心和照顾。感谢相关教研室及实验室的老师所给予的方便和指导。在此谨向指导、帮助和支持过我的每一位老师及同学致以最诚挚的谢意。二甲双弧对AMPK、PPARγ的影响与胰岛素抵抗的研究

作者：

学位授予单位：

吴乃君

天津医科大学

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