3-生物表面活性剂产生菌的筛选及特性研究 - 副本

大连工业大学学报

JournalofDalianPolytechnicUniversity

Vol.30No.1Jan.2011

文章编号:1674󰀁1404(2011)01󰀁0034󰀁05

生物表面活性剂产生菌的筛选及特性研究

王󰀁健,󰀁孙玉梅,󰀁王培忠,󰀁曹󰀁方

(大连工业大学生物工程学院,辽宁大连󰀁116034)

摘要:从石油污染的土壤中分离出3株生物表面活性剂产生菌,经鉴定菌株31#为假单胞菌属,菌株

37#和47#均为芽孢杆菌属。以液体石蜡为唯一碳源液态培养所筛菌株,测定发酵液的菌体密度、pH、表面张力及细胞疏水性。结果表明,菌株31#、37#及47#在发酵过程中的发酵液表面张力最低值分别为49.47、58.00和56.04mN/m;pH均在7.0~7.5;菌株均出现二次生长;细胞疏水性最大值分别为3.09%、1.49%和1.66%。菌株31#、37#及47#所产的生物表面活性剂经硅胶薄层层析方法鉴定为鼠李糖脂。

关键词:生物表面活性剂产生菌;采油微生物;筛选;表面张力中图分类号:Q939.97

文献标志码:A

Screeningandcharacteristicsofbiosurfactant󰀁producingbacteria

WANG󰀁Jian,󰀁SUN󰀁Yu󰀁mei,󰀁WANG󰀁Pei󰀁zhong,󰀁CAO󰀁Fang

(SchoolofBioengineering,DalianPolytechnicUniversity,Dalian116034,China)

Abstract:Threebacteriawereisolatedfromthesoilcontaminatedbypetroleumhydrocarbon,inwhichstrain31wasindentifiedasPseudomonas,andstrain37andstrain47asBacillusaccordingto

physiologicalandbiochemicalcharacteristics.Thestrainswereculturedwithparaffinasthesolecarbonsource,andthebiomass,pHandsurfacetensionofculturebrothandcellhydrophobicityweredetermined.Afterfermentationofstrains31,37

#

#

#

#

#

and47,thesurfacetensionofculturebroth

#

couldreduceto49.47,58.00and56.04mN/m,pHchangedbetween7.0and7.5.Thestrainsdisplayedsecondgrowthandcouldreachtheirhydrophobicitymaximum3.09%,1.49%and1.66%respectively.Thebiosurfactantproducedbystrains31#,37#and47#wasidentifiedasrhamnolipidbythin󰀁layerchromatography.

Keywords:biosurfactantproducer;microbeforoilrecovery;screen;surfacetension

0󰀁引󰀁言经过一次、二次常规采油之后,遗留在地层的残余油仍然占石油总量的60%~70%。如何最大限度地开采出地下剩余的原油,已经成为石油工业的重要任务。Zobell在1946年发表了利用微生物提高石油采收率的专利,并发现微生物提高石油采收率的机理之一是微生物代谢过程中产生了生物表面活性剂

[1󰀁2]

于微生物采油的菌种有近30个属100多种。利用不同的培养基对不同的菌种进行培养、驯化,获

得了可以产生大量表面活性剂、对稠油具有较强的分散、乳化作用的菌种。从污水中分离到的一株地衣芽孢杆菌可以耐受高温和高浓度盐,且对原油具有较强的乳化、增溶和降黏作用[4]。Ghojavand等[5]在兼性厌氧条件下筛选出耐高温(60󰀂)、高矿化度(15%NaCl)的枯草芽孢杆菌,该菌对原油具有较强的降黏作用。研究生物表面活性剂产生菌在微生物采油过程中的生长规律,探讨其作用机理,对微生物采油技术的改进和完

[6]

善具有十分重要的理论和实际意义。本研究通

[3]

。产生表面活性剂的微

生物种类很多,如酵母菌、真菌、细菌等。能以原油组分为碳源和能源产生生物表面活性剂的微生物,是微生物采油的首选菌种。现已知的能应用

收稿日期:2010󰀁03󰀁26.

作者简介:王健(1984󰀁),女,硕士研究生;通信作者:孙玉梅(1962󰀁),女,教授.

第1期

王健等:生物表面活性剂产生菌的筛选及特性研究

35

过原油平板培养法,筛选出3株生物表面活性剂产生菌,对各菌株进行生理生化试验和初步鉴定;测定各菌株在发酵过程中发酵液表面张力、pH、菌体密度和细胞疏水性等特征参数;对各菌株产生的生物表面活性剂组成进行分析。

180r/min振荡培养1~3d,再以体积分数为5%的接种量将种子培养液接于液体发酵培养基,于30󰀂、180r/min振荡培养。根据液体石蜡被乳化及发酵液表面张力的变化,筛选出产生物表面

活性剂的优势菌株。

生物表面活性剂产生菌的鉴定:根据∀伯杰氏(Berge)菌种鉴定手册#对分离得到的部分菌株进行形态观察和生理生化鉴定。1.2.4󰀁生物表面活性剂提取与分析1.2.4.1󰀁生物表面活性剂的提取

将发酵液用滤纸过滤除油,滤液于3000g离心20min除菌,取上清液加入等体积的氯仿和甲醇(体积比为2∃1)的混合液,萃取3次。将萃取后的有机相于40󰀂旋转蒸发得表面活性剂粗品。1.2.4.2󰀁生物表面活性剂的化学组成分析

将发酵液用滤纸过滤除油,滤液于3000g离心20min除菌,取上清液加入等体积氯仿和甲醇(体积比为2∃1)萃取所得有机相进行薄层层析。以氯仿、甲醇和水(体积比为65∃15∃2)为展开剂,以苯酚󰀁硫酸试剂为显色剂,显棕色斑点为糖脂;以茚三酮试剂为显色剂,显红色斑点为脂肽。

取150mg样品加入2mol/LH2SO4,于100󰀂密封水解8h,用BaCO3中和至中性,3000g离心10min,取上清液进行薄层层析。以氯仿、甲醇和水(体积比为65∃15∃2)为展开剂,以苯酚󰀁硫酸试剂为显色剂,以鼠李糖为标准样品[9]。

薄层层析用硅胶板为德国Merck公司产品silicagel60F254。

1.2.5󰀁生物表面活性剂产生菌的生长特性

菌体密度的测定:采用浊度法[10]。移除发酵液上层油相,取发酵液3mL,加入TritonX󰀁100(0.2%)溶液0.5mL,漩涡振荡1min,于3000g离心20min,倒掉上清液,用3mL去离子水重悬菌体,以去离子水为空白,于600nm测定菌悬液的光密度OD600,以此表示发酵液的菌体密度。疏水性(BATH)测定:采用BATH测定方法[10󰀁11]。移除发酵液上层油相,取发酵液3mL,测定OD%600。加入石油醚0.1mL,振荡1min,静置30s,再振荡1min,于30󰀂水中静置15min,取下层液体测定OD600。细胞疏水性BATH=OD600/OD%600。

表面张力测定:采用JY󰀁180表面张力仪(承德大华试验机有限公司)测定。将发酵液用滤纸过滤除油,滤液于3000g离心20min除菌,取上清液测定表面张力。[8]

1󰀁材料与方法1.1󰀁材󰀁料

1.1.1󰀁菌󰀁源

盘锦油田被原油污染的土壤。1.2󰀁方󰀁法

1.2.1󰀁培养基及其制备方法

液体富集培养基(g/L):原油3.0,NaCl3.0,NH4Cl0.1,MgSO40.02,NaNO30.2,KH2PO40.1,K2HPO40.2,pH7.0。于1.03 10Pa灭菌30min。

平板富集培养基(g/L):原油3.0,蛋白胨5.0,琼脂20.0,NaCl3.0,NH4Cl0.1,MgSO40.02,NaNO30.2,KH2PO40.1,K2HPO40.2,pH7.0。于1.03 105Pa灭菌30min。

平板分离及保藏培养基(g/L):葡萄糖3.0,蛋白胨8.0,酵母膏3.0,KH2PO42.7,NaCl5.0,琼脂20.0,pH7.0。于0.8 10Pa灭菌30min。

种子培养基(g/L):NaCl5.0,牛肉膏5.0,蛋白胨10.0,pH7.0,于1.03 10Pa灭菌30min。

发酵培养基(g/L):KH2PO43.4,Na2HPO4

1.5,(NH4)2SO44.0,MgSO4!7H2O0.7,酵母粉0.2,液体石蜡17,pH7.0,于1.03 10Pa灭菌30min。

1.2.2󰀁菌源微生物的富集

称取土样10g,加入生理盐水90mL,振荡均匀,静止12h。取上清液按10%接种量接种到液体富集培养基中,于30󰀂、180r/min的恒温摇床中振荡培养3d。连续转接培养3次。

1.2.3󰀁生物表面活性剂产生菌的分离、筛选与鉴定

生物表面活性剂产生菌的分离、初筛:将液体富集培养液用无菌生理盐水稀释10、10、10

5

6

7

5

55

5

倍,每个稀释度取0.1mL菌液涂布于平板富集培养基上,于30󰀂静置培养4d。将平板富集培养基上有乳化圈或噬油斑[7]的菌落,进一步在平板分离培养基上划线分离纯化,挑取单菌落保藏在斜面保藏培养基上。

生物表面活性剂产生菌的复筛:将斜面保存的初筛菌株接种在种子培养基中,于30󰀂、36

大󰀁连󰀁工󰀁业󰀁大󰀁学󰀁学󰀁报

pH测定:采用pH3󰀁3C精密pH计(上海雷

第30卷

表2󰀁生物表面活性剂产生菌的生理生化特性

Tab.2󰀁Physiologicalandbiochemicalcharacteristicsof

thebiosurfactantproducers

特征

31#&

37#+

47#+

磁仪器厂)测定。将发酵液用滤纸过滤除油,滤液于3000g离心20min除菌,取上清液测定pH。

2󰀁结果与分析2.1󰀁生物表面活性剂产生菌的筛选

经富集分离共得到49株细菌,初步筛选出14株生长较好的目的菌株接种于发酵培养基。在微生物采油过程中,表面活性剂和有机酸可以把原油从岩层中剥离下来,提高原油流动性。因此,以发酵过程中发酵液的pH和表面张力的降低为指标,对初筛得到的菌株进行复筛,同时分析所产生物表面活性剂的类型,结果见表1。

表1󰀁初筛菌株的发酵测定结果

Tab.1󰀁Determinationresultsonfermentationof

strainisolated

菌种󰀁(发酵液)/(mN!m-1)发酵液pH生物表面活性剂类型3#5#7#12#22#29#30#31#32#35#37#38#47#49#

51.0059.2354.6354.5751.4047.6049.6046.9052.2355.5748.3357.7550.9357.50

7.127.057.187.167.186.226.336.376.857.017.276.896.937.01

糖脂脂肽糖脂糖脂糖脂糖脂糖脂糖脂脂肽、糖脂糖脂糖脂脂肽、糖脂糖脂脂肽、糖脂

革兰氏染色菌落形态菌落大小/mm菌体形态运动性葡萄糖蔗糖甘油甘露醇氧化酶试验甲基红试验硝酸盐还原试验淀粉水解试验柠檬酸盐试验明胶液化试验石蕊牛乳试验产硫化氢试验V.P试验荧光色素试验脓青素试验注:+阳性,&阴性。

绿色,边缘不白色半透明,白色,边缘规规则,出现噬边缘不规则,则,出现噬油油斑

2.86杆状++&&&+&+&++还原+&++

出现噬油斑

3.84短杆状++&&++&&&&&酶凝固&+&&

斑

1.96短杆状+&&&&+&+&&&还原&&&&

2.3󰀁生物表面活性剂产生菌的生长特性2.3.1󰀁菌株31#的生长特性

菌株31#的生长特性如图1所示。在发酵前48h,菌株31#细胞疏水性呈上升趋势,菌体密度逐步增长,发酵液的表面张力下降。表明较强的细胞疏水性能增加菌体对疏水性有机物的吸附,从而增加菌体与有机物的接触机会,增强对有机

物的利用能力,导致菌体大量生长并产生大量的生物表面活性物质,使发酵液的表面张力大幅度下降,产生的生物表面活性物质通过改变吸附界面的特性来调节细胞与界面之间的亲和力,进一步促进微生物细胞对烃类化合物的附着和烃类化合物穿透细胞膜间隙[12󰀁13]。在发酵48~84h期间,菌体生长进入衰亡期,细胞疏水性下降,发酵液的表面张力呈下降趋势,这是部分菌体自溶释放出细胞内的生物表面活性物质的结果[14]。在发酵84~108h期间,细胞疏水性呈下降趋势,发酵液的表面张力随菌体密度增大而增大,表明菌体摄取烃类化合物能力降低,利用发酵液中积累的生物表面活性剂呈现二次生长。在发酵108~120h期间,细胞疏水性上升,表面张力下降。由注:发酵培养基的初始表面张力为69.87mN/m,初始pH7.0。

由表1可知,菌株29、30、31、37、47

#

#

#

#####

的发酵液的表面张力值及pH较低。选取该5株菌进行分析,菌株29、30、31发酵液的表面张力及pH比较接近,产生的生物表面活性剂均为糖脂,在原油平板上的菌落均为荧光绿色,种子液和发酵液均为荧光绿色,细胞均为杆状且大小相同。因此,判断该3株菌为同一菌种。复筛得到的菌株为31、37、47。

2.2󰀁生物表面活性剂产生菌的生理生化特性

对筛选所得菌株进行常规生理生化特性实验,结果如表2所示。根据表2所示结果和∀伯杰氏(Berge)菌种鉴定手册#的描述,可鉴定菌株31#为假单孢属,菌株37#、47#均为芽孢杆菌属。#

#

#

第1期

王健等:生物表面活性剂产生菌的筛选及特性研究

37

于31#为革兰氏阴性菌,细胞外壁中存在与其疏水性密切相关的脂多糖,发酵液中大量积累的生物表面活性剂导致细胞壁中脂多糖大量流失,从而引起细胞疏水性增大[15]。

能力增强,从而产生大量的生物表面活性物质,使发酵液的表面张力下降。在发酵96~120h期间,细胞疏水性的降低,菌体密度降低,菌体生长进入衰亡期,发酵液的表面张力上升。2.3.3󰀁菌株47#的生长特性

菌株47#的生长特性如图3所示。在发酵前48h,菌体密度显著增长,细胞疏水性增大,发酵液的表面张力降低。在发酵60~72h期间,菌体密度减小,细胞疏水性降低,发酵液表面张力降低,菌体生长进入衰亡期。在发酵72~84h期间,菌体密度增加,细胞出现二次生长,产生大量的生物表面活性物质,使发酵液的表面张力大幅下降。在发酵84~120h期间,菌体密度降低,发

图1󰀁菌株31#的好氧培养过程曲线

Fig.1󰀁Cultivationcoursecurveofstrain31#under

aerobiccondition

酵液的表面张力在保持一段时间的基本稳定后升高。表明菌体在利用烃类生长过程中,产生了生物表面活性剂。生物表面活性剂的产生降低了油水界面张力,使烷烃得以有效扩散,增大油水界面面积,从而便于细胞与较大油滴之间的直接接触,同时使细胞的疏水性变大,导致细胞亲油,从而有利于菌对烃类的利用

[18]

2.3.2󰀁菌株37的生长特性

菌株37#的生长特性如图2所示。在发酵过程中,细胞疏水性总体呈上升趋势。发酵24h时,细胞疏水性大于1,菌体密度随细胞疏水性的增大而增大。发酵36h时,发酵液的表面张力降低,这是因为烃类的难溶性使得微生物在摄取烃类生长过程中往往伴随着生物表面活性剂的生成,其主要作用是使烃类在水溶液中有效扩散,并渗入细胞内部被同化分解[16],菌体能够更好地利用烃类碳源生长,菌体密度上升。在发酵48~84h期间,菌体生长进入稳定期,菌体密度保持不变。在发酵84~96h期间,菌体密度上升,细胞出现二次生长。这是由于液体石蜡是一种混合物,菌体首先摄取较易利用的10个碳以上的长链烷烃

[17]

#

。

,然后再利用其他链长的烷烃进行生长,

图3󰀁菌株47的好氧培养过程曲线

Fig.3󰀁Cultivationcoursecurveofstrain47#under

aerobiccondition

#

同时因为细胞疏水性上升,细胞利用液体石蜡的󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁

2.4󰀁生物表面活性剂的化学组分分析

将菌株31、37和47于30󰀂培养后,对发酵液萃取所得生物表面活性剂粗制品进行硅胶薄层层析,结果如图4所示。将萃取所得生物表面活性剂粗制品进行酸解,硅胶薄层层析结果如图5所示。

图4的层析结果显棕色,说明菌株31#、37#

和47所产的生物表面活性剂均为糖脂。由图5可知,菌株31#、37#和47#所产的生物表面活性

图2󰀁菌株37#的好氧培养过程曲线

Fig.2󰀁Cultivationcoursecurveofstrain37#under

aerobiccondition#

#

#

#

剂经酸解后显棕色斑点,且Rf值与鼠李糖的Rf值相同,说明菌株31#、37#和47#所产的生物表面活性剂的糖基均为鼠李糖。38

大󰀁连󰀁工󰀁业󰀁大󰀁学󰀁学󰀁报

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3󰀁结󰀁论通过对发酵液表面张力及pH的测定,筛选出3株生物表面活性剂产生菌,且所产的生物表面活性剂均为鼠李糖脂;经生理生化鉴定,菌株###31为假单胞菌属,菌株37、47为芽孢杆菌属;通过对所筛菌株的生长特性的研究,说明菌体密度、细胞疏水性、发酵液的pH及表面张力之间密切相关,相互制约。在以液体石蜡为唯一碳源培养时,菌株31的发酵液表面张力下降最多,且表现出的细胞疏水性最强,发酵液表面张力下降到49.47mN/m,细胞疏水性为3.09%。较强的细胞疏水性有利于菌体对疏水性基质的利用,从而导致菌体密度的增长及发酵液表面张力的下降,这对微生物开采稠油十分有利。

#

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