两株不同亚型禽流感病毒NS1基区的表达及抗原性检测

中国动物检疫２００６年第２３卷第９期　一２８一　文章编号：１００５—９４４Ｘ（２００６）０９—００２８—０３　两株不同亚型禽流感病毒Ｎ　Ｓ　１基因　的表达及抗原性检测　孙进华　于志丹　曲哲会张雅为　王君伟　（东北农业大学动物医学院哈尔滨１５００３０）　摘要：为进一步研究禽流感病毒非结构蛋白ＮＳ１的功能及其在临床中的应用，本试验分别对Ｈ５Ｎ１、Ｈ９Ｎ２两　株不同亚型禽流感病毒的ＮＳ１基因进行了原核表达及抗原性检测。实验分别用限制性内切酶ＥｃｏＲＩ和ＸｈｏＩ消化　不同亚型ＮＳ１基因的重组质粒ｐＭＤ一１８Ｔ—ＮＳ１０－Ｉ９Ｎ２）和ｐＭＤ一１８Ｔ—ＮＳ１（Ｈ５Ｎ１），获得目的片段ＮＳ１．然后将　ＮＳ１基因克隆到原核表达栽体ｐＰｒｏＥＸＨＴｃ中。将重组质粒ｐＰｒｏｃ—ＮＳ１（Ｈ９Ｎ２、Ｈ５Ｎ１）转化ＤＨ５ｏｅ感受态细胞．用　ｌｍｍｏＦＬ　ＩＰＴＧ诱导表达，表达产物进行ＳＤＳ—ＰＡＧＥ检测，目的蛋白分子量大小为３０ｋｕ．与预期结果相符。Ｗｅｓｔ—　ｅｍ—ｂｌｏｔ检测表明所表达的蛋白能与Ｎｓ１的多克隆抗血清反应．并且存在交叉反应　关键词：禽流感病毒；非结构蛋白：基因表达：检测　Ａ型流感病毒是分节段的　Ｈ５Ｎ１亚型强毒株．并对该两株流感　ｐＰｒｏＥＸＨＴｃ—ＮＳＩ（Ｈ５ＮＩ１以下简称　ＲＮＡ病毒．其内部基因由８个分节　病毒ＮＳ１基因进行了表达及抗原性　ｐＰｒｏ－ｑＮＳ１。　段的ＲＮＡ所组成　流感病毒ＮＳ基　检测．为以后建立以重组蛋白为检测　１．４　ＮＳ１蛋白的表达及抗原性检　因是其内部基因组中最小的基因节　抗原的诊断技术．进行禽流感的疾病　测选择阳性克隆菌落接种于含１　段．它转录成的线性ｍＲＮＡ共编码　监测奠定基础　同时也为进一步研究　ｕｇ／ｍＬ氨苄青霉素的ＬＢ培养基中．　两种蛋白即ＮＳ１和ＮＳ２（ＮＥＰ）蛋白　两种不同亚型流感病毒ＮＳ１蛋白的　３７￣Ｃ振荡培养至ＯＤ６０Ｄ＝０．５，加ＩＰＴＧ　最初的研究表明：这两种蛋白仅在　功能奠定分子生物学基础　被流感病毒感染的细胞中发现．而　１材料与方法　在病毒体中未能发现．所以称为非　１．１病毒与质粒至终浓度为１　ｍｍｏｌ／Ｌ．继续培养４　ｈ．置冰５　ｍｉｎ．８　０００　ｒ／ｍｉｎ离心５　病毒ＭＣｈｉｃｋｅｒｄ　ｍｉｎ．取沉淀按常规法进行１２％　结构蛋白（ｎｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ）　而　ＭＤＪ／２０００（Ｈ９Ｎ２）￣本实验室分离并　ＳＤＳ—ＰＡＧＥ电泳．观察蛋白条带大　随着研究的进一步深入．发现ＮＳ２　保存。质粒ｐＭＤ一１８Ｔ—ＮＳ１　ｆＨ９Ｎ２１　小。阳性者留种保存．并进行　蛋白在成熟的病毒粒子当中少量存　（以下简称：Ｔ－ｒＮＳ１）及ｐＭＤ一１８Ｔ—　Ｗｅｓｔｅｒｎ—ｂｌｏｔ反应：ＳＤＳ—ＰＡＧＥ后　在　所以ＮＳ１蛋白是禽流感病毒唯　ＮＳＩ（Ｈ５Ｎ１）（以下简称：Ｔ—ｑＮＳ１）由　将凝胶蛋白电转移至ＰＶＤＦ膜．封　一的非结构蛋Ｉ￣［１１　在感染的晚期．　本实验室制备和保存　闭后．用含０．０５％Ｔｗｅｅｎ一２０的ＰＢＳ　ＮＳＩ蛋白可以在细胞浆中出现．且　１．２试剂Ｔ４　ＤＮＡ　Ｌｉｇａｓｅ、感受态　（ＰＢＳＴ）洗涤３次，与１：４ＯＯ稀释的　含量丰富　流感病毒感染的动物可　细胞ＤＨ５ｏｔ购自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司　限　ＮＳ１多克隆抗体反应２ｈ．用ＰＢＳＴ　能会产生针对ＮＳ蛋白的抗体．仅　制性内切酶ＥｃｏＲＩ、ＸｈｏＩ、ｐＭＤ１８－Ｔ　洗涤３次．再与１：２　０００稀释的羊　接种灭活疫苗的动物则不会产生这　载体、ｐＰｒｏＥＸＨＴａ原核表达载体购　抗兔Ｉｇｇ—ＨＲＰ酶标二抗室温反应　种抗体．因此以ＮＳ１蛋白可作为检　自ＴＡＫＡＲＡ公司。ＮＳ１蛋白阳性血　ｌｈ，ＰＢＳＴ充分洗涤后．浸入ＴＭＢ显　测抗原区分ＡＩＶ疫苗免疫动物和　清由本实验室制备和保存　羊抗兔酶　色液中．３７℃显色１５　ｍｉｎ．观察颜色　野毒感染动物　标二抗购自ＳＩＧＭＡ公司　区带。　分别用　１．５交叉反应试验Ｗｅｓｔｅｒｎ—ｂｌｏｔ　目前在我国所流行的禽流感主　１．３　ＮＳ１基因的亚克隆要有强毒株Ｈ５Ｎ１亚型及弱毒株　ＥｃｏＲＩ、ＸｈｏＩ消化重组质粒Ｔ—ｒＮＳ１、　分析时．将Ｈ５Ｎ１的多克隆抗血清　Ｈ９Ｎ２亚型　１．不同亚型禽流感病　Ｔ—ｑＮＳ１及表达载体ｐＰｒｏＥＸＨＴｃ回　用作Ｈ９Ｎ２　ＮＳＩ蛋白的一抗．将　毒ＮＳ基因序列的同源性差异较　收目的片断．连接后转化感受态细　Ｈ９Ｎ２的多克隆抗血清用作Ｈ５Ｎ１　大．所翻译的氨基酸序列也有较大　胞ＤＨ５ａ．在含有氨苄青霉素的ＬＢ　ＮＳ１蛋白的一抗．其他步骤同上。　的差异　因此．本研究选取两个典型　平板上进行蓝白筛选．挑取阳性菌　１．６　ＮＳ１蛋白的纯化将阳性菌　的流感病毒代表株：弱毒株　落．提取质粒进行酶切鉴定．从而构　株用ｌｍｍｏｌ／Ｌ的ＩＰＴＧ诱导４　ｈ后．　（Ｈ９Ｎ２１以下简称ｐＰｒｏ—ｒＮＳ１和　剂的纯化说明进行纯化。　　用变性方法．按Ｎｉ—ＮＡＴ　Ａｇａｒｏｓｅ试　Ｃｈｉｃｋｅｎ／ＭＤＪ／２０００（Ｈ９Ｎ２）和一株　建出表达载体ＤＰｒ０ＥＸＨＴｃ—ＮＳ１★通讯作者　维普资讯 http://www.cqvip.com

一２９一　中国动物检疫２００６年第２３卷第９期　２结果　Ｉ　Ｇ诱导后有预期的融合蛋白表　Ｈ９Ｎ２与Ｈ５Ｎ１亚型的ＮＳ１蛋白之　２．１重组质粒ｐＰｒｏ—ｒＮＳ１及ＤＰｒｏ—　达．其分子量约为３０ｋｕ．加ＩＰＴＧ的　间存在明显的交叉反应　ｑＮＳ１的酶切鉴定结果　通过对　对照样本则没有预期蛋白表达　３讨论　ｐＰｒｏ—ｒＮＳ１及ｐＰｒｏ—ｑＮＳ１阳性质粒　Ｗｅｓｔｅｒｎ—ｂｌｏｔ法进行了表达产物特　ＥｃｏＲＩ＋ＸｈｏＩ及ＰＣＲ鉴定．分别得　ＮＳ１重组质粒的样本有特异条带．　本实验所表达的蛋白中．Ｈ９Ｎ２　的’单酶切ＥｃｏＲＩ、ＸｈｏＩ．双酶切　异性检测．结果如图所示，含ｐＰｒｏ—　的ＮＳ１蛋白出现了两条带．其中有　一条带要比预期的结果大一点．并　到大小约为５　４００　ｂｐ、４　７００　ｂｐ和　而对照样本未见特异条带．证明该　且用Ｎｉ一树脂吸附柱进行纯化及　７００ｂｐ左右大小目的片段（图１、２）．　３０ｋＤａ蛋白带系ＮＳ１基因表达产　ｗｅｓｔｅｒｎ—ｂｌｏｔ检测．此条带仍然存　结果均与预期值相符．证明目的片　物，该蛋白为融合蛋白．含有６个连　在．经序列分析可知．Ｈ９Ｎ２的ＮＳ１　段已插入表达载体ＤＰｒｏＥＸＨＴｃ中。　续的组氨酸标签　因此．用Ｎｉ＋ＮＡＴ　基因的终止密码子为非典型的　２．２　ＮＳ１基因表达产物的ＳＤＳ—　Ａｇａｒｏｓｅ方法成功地纯化出该蛋白　ＴＧＡ．可能是由于读码过程中没有　ＰＡＧＥ及Ｗｅｓｔｅｒｎ—ｂｌｏｔ检测　ＳＤＳ—　（见图３、４、５）。　及时终止所至　ＰＡＧＥ结果表明，含ＤＰｒｏ—ＮＳ１重组　２．３交叉反应试验结果表达产物　Ａ型流感病毒ＮＳ１蛋白具有　质粒的ＤＨ５　０【大肠杆菌经ｌｍｍｏｌ几　经ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ交叉反应试验显示：　抗Ｉ型ＩＦＮ的功能．这一功能是维　持Ａ型流感病毒传播所必需的基　础，ＮＳ１蛋白阻止Ｉ型ＩＦＮ的产生．　主要是通过阻止潜在的转录因子　ＩＲＦ一３和ＮＦ—ＫＢ产生的抗病毒活　５Ｏｏｏ　性蛋白［５１。ＮＳ１的功能主要是阻碍　２５ｏ０　ＩＦＮ对流感病毒感染的反应能力．　１Ｏｏｏ　提高了病毒的毒力　ＮＳ１的活性影　４５ｋｕ　响宿主细胞ＩＦＮ应答．是通过ＮＳ１　２５０　２Ｓｋｕ　结合有关ＲＮＡ或与之相关特殊的　蛋白质来实现的。然而．并不是每种　亚型的ＮＳ１蛋白都具有抗干扰素　图１　重组质粒ｐＰｒｏｒ－ｒＮＳ１的酶切鉴定　的功能．第９２位谷氨酸的存在是决　１：ｐＰｒｏ－ｒＮＳ１质粒ＰＣＫ鉴定结果　２：ＥｃｏＫＩ酶切重组质粒ｐＰｒｏ—ｒＮｓ１　定该功能的关键因素。有试验证明．　１￣＇ｐＰｒｏ－ｒＮＳ１阳性质粒谤导后４ｈ的裂解物　３：ＤＬ１５０００ｂｐ　ｎｉｃｋｅｒ　２，￣＇ｐＰｒｏＥＸＨＴｃ空质粒的阴性对照　Ｈ５Ｎ１／９７、Ｈ５Ｎ１／００病毒株能抵抗机　４：ＥｃｏＫｌ和ＸｈｏＩ￣（切重组质拉ｐＰｒｏ—ｒＮＳ１　３　Ｎｉ＋一ＮＡＴ　Ａｇａｒｏｓｅ￣４Ｅ的产物　体的抗病毒反应．尤其抑制了ＩＦＮ　５：Ｘｈｏｌ酶切重组质ｇ￣．ｐＰｒｏ—ｒＮＳ１　４蛋白质ｍａｒｋｅｒ（ｋｕ）　和ＴＮＦ介导的抗病毒反应．该反应　图３　ｐＰｒｏ－ｒＮＳ１表达产物的ＳＤｓ＿Ｐ＾ＧＥ分析　过程与流感病毒ＮＳ１基因有关．且　１　２　３　４　需要９２位谷氨酸（Ｇｌｕ）的存在啕　本　实验研究的强毒株的ＮＳ１蛋白９２　位为谷氨酸．而Ｈ９Ｎ２亚型的流感　病的ＮＳ１蛋白的９２位为天冬氨　２　３　４　１：ｐＰｒｏ－ｑＮＳ１质粒ｐｃ又鉴定结果　１￣＃ｐＰｒｏ－ｒＮＳ１阳性质拉　２：ＤＬ１５０００ｂｐ　ｍａｒｋｅｒ　１　Ｎｉ＋一ＮＡＴ　Ａｇａｒ０ｓｅ纯化后的产物　２￣＃ｐＰｒｏＥＸＨＴｃ空质粒的　３：ＥｃｏＲｌ和ＸｈｏｌＸ￣．切重组质粒ｐＰｒｏ－ｑＮＳ１　２蛋白质ｍａｒｋｅｒ（ｋｕ）　３￣＃ｐＰｒｏ－ｒＮＳ１阳性质拉的　４－Ｘｈｏｌ酶切重组质￣ｉ．ｐＰｒｏ－ｑＮＳ１　３　Ｚ￣Ｐｒｏ－ｑＮＳ１阳性质粒诱导后４ｈ的裂解物　４￣＃ｐＰｒｏＥＸＨＴｃ空质拉的　５：ＥｃｏＫｌ酶切重组质粒ｐＰｍ—ｑＮＳ１　４舍ｐＰｒ０ＥｘＨＴｃ空质粒的阴性对照　图５　ｐＰｒｏ—ｒＮＳ１及ｐＰｒｏ—ｑＮＳ１表达产物的　图２重组质粒ｐＰｒｏ—ｑＮＳ１的酶切鉴定　图４　ｐＰｒｏ－ｑＮＳ１表达产物的ＳＤＳ—ＰＡＧＥ分析　ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂ　Ｉ　ｏｔ分析　维普资讯 http://www.cqvip.com

中国动物检疫２００６年第２３卷第９期　一３０一　酸　据此理论．强毒株的ＮＳ１蛋白　这样便省去了需要表达不同亚型　ｅｓｃａｐｅ　ｈｏｓｔ　ａｎｔｉｖｉｒａｌ　ｃｙｔｏｋｉｎｅ　ｒｅ—　应该具有抗干扰素和肿瘤坏死因子　ＮＳ１蛋白的繁琐工作　ｓｐｏｎｓｅｓ［Ｊ】．Ｎａｔ　Ｍｅｄ，２００２，８（９）：９５０—　９５４．　的作用．然而是否９２位不存在　参考文献　Ｇｌｕ，ＮＳ１蛋白就没有此功能？蛋白　［１】Ｔａｉｓｕｋｅ　Ｈｏｒｉｍｏｔｏ　ａｎｄ　Ｙｏｓｈｉｈｉｒｏ　［５】Ｓａｎｇ　Ｈｅｕｉ　Ｓｅｏ，Ｅｒｉｃｈ　Ｈｏｆｆｍａｎｎ　质发挥生物学功能还需要有正确的　Ｋａｗａｏｋａ．Ｐａｎｄｅｍｉｃ　Ｔｈｒｅａｔ　Ｐｏｓｅｄ　Ｒｏｂｅｒｔ　Ｇ．Ｗｅｂｓｔｅｒ．Ｔｈｅ　ＮＳ　１　ｇｅｎｅ　，空间构象．ＮＳ１蛋白的哪些氨基酸　ｂｙ　Ａｖｉｌｆａｎ　Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ　Ａ　Ｖｉｖｕｓｅｓ［Ｊ］．　ｏｆ　Ｈ５Ｎ１　ｉｎ的改变对其功能有影响．还需进一　Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ１．２００１．１４：１２９—１４９．　步研究　ｕｅｎｚａ　ｖｉｒｕｓｅｓ　ｃｉｒｃｕｍ．　ｖｅｎｔｓ　ｔｈｅ　ｈｏｓｔ　ａｎｔｉ－ｖｉｒａｌ　ｅｙｔｏｋｉｎｅ　［２】Ｗａｎｇ　Ｓ，Ｓｈｉ　ＷＭ，Ｍｗｅｅｎｅ　Ａ，　ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ［Ｊ】．Ｖｉｕｓｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００４，　１０３：１０７一ｌ１３．　表达载体ｐＰｒｏＥＸＨＴｅ所表达　Ｇｅｎｅｔｉｃ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｎｏｎｓｔｒｕｃ—　的蛋白带有６个Ｈｉｓ标签．易于用　ｔｕｒａｌ（ＮＳ）ｇｅｎｅｓ　ｏｆ　Ｈ９Ｎ２　ｃｈｉｃｋｅｎ　［６】Ｓｕａｒｅｚ　Ｄ　Ｌ．Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｖｉａｎ　离子交换法纯化出目的蛋白　本实　ｉｌｕｅｎｚａ　ｖｉｆｎｒｕｓｅｓ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｉｎ　Ｃｈｉｎａ　ｉｌｕｅｎｚａ　ｖｉｆｎｕｓｅｓ［ｒＪ］．Ｖｅｔ．Ｍｉｅｒｏｂｉｏｌ，　验用Ｎｉ十一ＮＡＴ　Ａｇａｒｏｓｅ方法成功纯　ｄｕｒ７４：１５—２７．　ｉｎｇ　１９９８－２００２［Ｊ］．Ｖｉｕｓ　Ｇｒｅｎｅｓ，　２０００，化了ＮＳ１蛋白．并且蛋白浓度较　２００５．３　１　ｆ３）：３２９—３５．　［７】Ｂａｓｌｅｒ　Ｃ　Ｆ，Ｒｅｉｄ　Ａ　Ｈ，Ｊｏｄｙ　Ｋ　ｅｔ　高．为今后以ＮＳ１蛋白为检测抗原　［．Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　１　９　１　８　ｐａｎｄｅｍｉｃ　３】Ｇｕａｎ　Ｙ，Ｐｅｉｉｒｓ　Ｍ，Ｋｏｎｇ　Ｋ　Ｆ　ｅｔ　ａ１建立区分免疫禽和感染禽的检测方　ａ１．Ｈ５　Ｎ　１　Ｉｎｌｕｅｎｚａ　Ｖｉｆｕｓｒｅｓ　Ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｉｎｌｕｅｎｚａ　ｖｉｆｕｓ　ｎｏｎｓｔｒｒｕｃｔｕｒａｌ　ｇｅｎｅ　ｒｏｍ　Ｇｅｅｓｅ　ｉｎ　Ｓｏｕｔｈｅａｓｔｅｒｎ　Ｃｈｉｎａ：　（法奠定了基础．ＮＳ１蛋白交叉反应　ｆＮＳ）ｓｅｇｍｅｎｔ　ａｎｄ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　实验中．Ｗｅｓｔｅｒｎ—ｂｌｏｔｔｉｎｇ结果显示：　Ｅｖｉｄｅｎｃｅ　ｆｏｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｒｅａｓｓｏｒｔｍｅｎｔ　ｒｅｃｏｍｂｉｈａｎｔ　ｖｉｕｓｅｓｒ　ｂｅａｒｉｎｇ　ｔｈｅ　不同亚型禽流感病毒ＮＳ１蛋白的　ａｎｄ　Ｉｎｔｅｒｓｐｅｃｉｅｓ　Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ　ｔｏ　１９１８　ＮＳ　ｇｅｎｅｓ．Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　多克隆血清存在明显的交叉反应１７一．　Ｄｕｃｋｓ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．２００２，２９２：１６－２３．　这一点对于建立以ＮＳ１蛋白为包　［４］Ｓｅｏ　ＳＨ，Ｈｏｆｆｍａｎｎ　Ｅ，Ｗｅｂｓｔｅｒ　ＲＧ　被抗原的检测方法是非常有利的．　ｅｔ　ａ１．Ｌｅｔｈａｌ　Ｈ５Ｎ　１　ｉｎｌｕｅｎｚａ　ｖｉｆｕｓｅｓ　ｒＳｃｉＵＳＡ，２００１，９８（５）：２７４６—２７５　１．　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎｄ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｎｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　ＮＳ１　Ｇｅｎｅ，　ｏｆ　Ｔｗｏ　Ａｖｉａｎ　ＩＩｌｆｌｕｅｎｚａ　Ｖｉｒｕｓ　Ｓｔｒａｉｎｓ　Ｓｕｎ　Ｊｉｎ—ｈｕａ，Ｙｕ　Ｚｈｉ—ｄａｎ，Ｑｕ　Ｚｈｅ—ｈｕｉ，Ｚｈａｎｇ　Ｙａ—ｗｅｉ，ＷＡＮＧ　Ｊｕｎ—ｗｅｉ　（Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ａｎｉｍａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｎｏｒｔｈｅａｓｔ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ．Ｈａｒｂｉｎ　１５００３０）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｎ　ｏｒｄｅｒ　ｔｏ　ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｔｈｅ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｎｏｎｓｔｕｃｔｒｕｒａｌ　（ＮＳ１）ｏｆ　ｔｈｅ　ａｖｉａｎ　ｉｌｕｅｎｚａ，ｆｎ　ｔｈｅ　ｎｏｎｓｔｕｃｔｒｕｒａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ＮＳ　１　ｇｅｎｅ　ｏｆ　ｔｗｏ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ａｖｉａｎ　ｉｌｕｅｎｚａ　ｖｉｆｎｕｓ（ｒＨ５Ｎ　１、Ｈ９Ｎ２）ｗａｓ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ａｎｄ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ．Ｔｈｅ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｐｌａｓｉｍｉｄ　ｏｆ　ｐＭＤ一１８Ｔ－ＮＳ１（Ｈ９Ｎ２）ａｎｄ　ｐＭＤ一１８Ｔ—ＮＳ１（Ｈ５Ｎ１）ｗａｓ　ｄｉｇｅｓｔｅｄ　ｂｙ　ＥｃｏＲＩ　ｏｒ　ＸｈｏＩ　ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ　ｗｅｒｅ　ｃｌｏｎｅｄ　ｏｎｔｏ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒ　ｐＰｒｏＥＸＨＴｅ　ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｐｌａｓｍｉｄ　ｐＰｒｏ—ＮＳ１（Ｈ９Ｎ２、Ｈ５Ｎ１）ｗａｓ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ　ｉｎｔｏ　Ｅ．ｅｏｌｉ　ＤＨ５　ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　ｃｅｌｌｓ　ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ　ａｎｄ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｗｉｔｈ　ｌ　ｍｍｏｌ／Ｌ　ＩＰＴＧ．Ｔｈｅ　ｔａｒｇｅｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｗａｓ　ｐｒｏｄｕｃｅｄ．ＳＤＳ—ＰＡＧＥ　ｔｅｓｔ　ｉｎｄｉｃａｔｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｍｏｌｅｃｕｌｒ　ａｗｅｉｇｈｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｗａｓ　３０ｋｕ　ａｓ　ｅｘｐｅｃｔｅｄ．Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ　ｔｅｓｔ　ｉｎｄｉｃａｔｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｃａｎ　ｒｅａｃｔ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ＮＳ１　ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｉｌｕｅｎｚａ　ｖｉｆｎｕｓ，ａｎｄ　ｅａＲ　ｃｒｒｏｓｓ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｅａｃｈ　ｏｔｈｅｒ　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ａｖｉａｎ　ｉｌｕｅｎｚａ　ｖｉｆｎｕｓ；Ｎｏｎｓｔｒｕｃｔｒｕｒａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ；ＮＳ　１　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ；Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’？’、　■　三大因素让山东禽猪业步履维艰　山东省畜牧业经过这些年的发展，已形成规模化，也具备了一定的抵抗风险的能力，但今年缘何会出　ｉ　现如此大的波动呢？对此，有关专家分析了该省畜牧业目前发展受到影响的几个主要原因　供过于求，出现了阶段性过剩。据介绍，养猪业自２００３年下半年开始，市场价格回升，养猪效益增加，　ｉ　农民养猪积极性提高，生猪饲养量增大；动物疫情在一定程度上影响了消费。有关专家认为，高致病性禽　ｉ　流感和人感染禽流感病例的发生，使一些消费者谈禽色变，ｇ－禽及其制品消费量迅速下降；进口畜产品冲　击了国内市场；一些新闻媒体对重大畜禽疫病的报道把握不准，部分畜禽养殖加工企业应对市场调整的　动作滞后以及政府对畜禽市场调控缺乏有力的手段等，也在一定程度上加剧了畜禽市场的波动　摘自：中国家禽业信息网２００６—０７—２７　。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。　。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。……………。。　；