考马斯亮蓝 法测定蛋白质含量

考马斯亮蓝G250 ( CBB- G-250）与蛋白质结合后形成蓝色的化合物，在595nm有最大吸收峰，且蓝色的深浅与蛋白浓度成正比。这是一种快速、准确、重复性好的蛋白质定量方法。

该方法快速、准确、干扰因素少。CBB- G-250在2分钟内即可完全与蛋白结合，并在2小时内保持稳定，该反应几乎不受钠、钾等阳离子的干扰，更不受蔗糖等碳水化合物的干扰。但较高浓度的十二烷基硫酸钠（Soldium dodecyl sulfate），Triton X－100等对其有干扰，此影响可通过选择适当的对照品来消除。

（二）器材及试剂 1、器材

A. 分光光度计 B. 微量加样器

C. 移液管、试管及试管架 D. 坐标纸 2. 试剂

（1）考马斯亮蓝G-250溶液：

称取CBB- G-250 100毫克 溶于 50 ml 95%(V/V)乙醇溶液中，然后加入100毫升 85%（V/V） 磷酸，最后加蒸馏水定容至1000毫升。 （2）0.14mol/L 氯化钠溶液（生理盐水） （3）标准蛋白质溶液（0.1mg/ml）：

精确称取10.0毫克牛血清白蛋白，用生理盐水定容至100毫升。 (4) 血清样品(已稀释200倍) (5) 层析样品 (三）、操作（标准曲线制作） ： 取7支试管按下表操作： 标准蛋白 （ml） 待测样品2（ml） 生理盐水（ml） CBB-G250(ml) 空白 1.0 5.0 待测 标1 标 2 标 3 标 4 标 5 0.2 0.8 5.0 0.2 0.8 5.0 0.4 0.6 5.0 0.6 0.4 5.0 0.8 0.2 5.0 0.0 5.0 1.0 最终蛋白浓度（ug/ml） 3.3 6.6 9.9 13.2 16.5 混匀，室温放置5分钟，在595nm测定各管O.D值并以蛋白浓度为横坐标，以O.D

值为纵坐标绘制标准曲线．

以Bradford法测定层析分离蛋白内的蛋白浓度

取试管从层析样品中各取20.0ul，加入生理盐水20ul,最后加入考马斯亮蓝G-250溶液5.0ml，混匀，以595nm 波长测定二者光密度，在标准曲线上查出其蛋白浓度

以上需要购买的试剂有：1、标准蛋白质即牛血清白蛋白。

教学内容：

实验八考马斯亮蓝法（Bradford法）测定蛋白质含量

【实验目的】

1. 掌握考马斯亮蓝染色法定量测定蛋白质的原理与方法 2. 熟练分光光度计的使用和操作方法 【实验原理】

此方法是1976年Bradform建立。考马氏亮蓝G-250在酸性溶液中为棕红色，当它与蛋白质结合后，变成蓝色，最大吸收波长从465nm转移到595nm处，在一定的范围内，蛋白质含量与595nm的吸光度成正比。 【器材与试剂】

器材 1.可见光分光光度计 2. 刻度移液管 3.移液枪 4. 新鲜小麦叶片或绿豆芽下胚轴等

试剂 1. 0.9%生理盐水 2. 考马斯亮蓝试剂

称取CBB- G-250 100毫克 溶于 50 ml 95%(V/V)乙醇溶液中，然后加入100毫升 85%（V/V） 磷酸，最后加蒸馏水定容至1000毫升。 3. 1000µg /ml蛋白质标准液

标准蛋白质溶液（1000ug/ml）：

精确称取100.0毫克牛血清白蛋白，用生理盐水定容至100毫升。

【实验步骤】 1. 标准曲线的制作

(1) 取试管6支，按下表进行编号并加入试剂。

试 剂 1 1000µg/ml标准蛋白溶液（ml） 0 0.9%生理盐水（ml） 蛋白质含量（µg/0.1ml） 2 试管编号 3 4 5 6 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0 20 40 60 80 100 (2) 另取试管6支，吸取上述各管蛋白质溶液0.1ml，加入3.0ml考马斯亮蓝G250试剂, 充分振荡混合，放置5min后，测定A595值。

(3) 分光光度法的基本原理和分光光度计的使用方法（分组实际操作、讲解） 注意事项：(1) 持杯方法

(2) 一定要开盖调T 零点，盖盖调T 100 (3) 波长选择 (4) 空白杯所装的溶液

(4) A595为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，绘制标准曲线。 2. 样品提取液中蛋白质含量的测定

(1)蛋白质提取:称取样品约200mg，加蒸馏水5ml，匀浆，4000rpm离心10min，取上清液。残渣用2.0ml蒸馏水悬浮，4000rpm离心10min，合并上清液并定容至10ml。

(2)蛋白质含量测定: 取3支试管，各吸取样品提取液0.1ml，加入考马斯亮蓝G250试剂3.0ml，充分振荡混合，放置5min后，测 A595 值 (3) 根据A595值，在标准曲线上求出样品中蛋白含量。 3. 结果计算

样品蛋白质含量（µg/g鲜重）＝a (µg) ×提取液总体积 (ml) / [测定所取提取液体积（ml）×样品鲜重（g）], a为从标准曲线上查得的蛋白质含量，单位为µg 【实验结果与分析】 写出实验报告