雪松松针提取物抑菌活性及抑菌稳定性研究

２０１３年４月２０日第２２卷第８期　中ｌ　荔　・药物研究・　Ｖｏ１．２２，Ｎｏ．８，Ａｐｒｉｌ　２０，２０１３　Ｃｈｉｎａ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｆ　口　Ｄｒｕｇ　Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　雪松松针提取物抑菌活性及抑菌稳定性研究　楼英彪　，陈菲　，高素华　（１．浙江金华广福医院，浙江金华　３２１０００；　２．金华职业技术学院医学院，浙江金华　３２１００７）　摘要：目的研究雪松松针不同溶剂提取物的抑菌效果和抑茵稳定性。方法分别用水、９５％乙醇、乙酸乙酯、石油醚对雪松松针进行提　取，采用滤纸片法比较不同溶剂提取物的抑菌活性。采用不同体积分数的乙醇提取，确定提取雪松松针抑菌成分的最适溶剂。探讨热处　理、介质ｐＨ和糖含量对松针提取物抑茵稳定性的影响。结果松针５０％乙醇的提取物抑菌活性最佳，热处理对抑茵活性无明显影响，　介质ｐＨ和糖含量可在一定程度上影响抑菌活性。结论雪松松针提取物具有较好的抑菌作用，可作为一种天然防腐剂加以开发利用。　关键词：雪松；提取物；抑茵活性；稳定性　中图分类号：１１２８２．７１；Ｒ２８５．５　文献标识码：Ａ　文章编号：１００６—４９３１（２０１３）０８—００３９—０２　Ｓｔｕｄｙ　ｏｎ　Ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ　Ａｃｔｉｖｉｔｙ　ａｎｄ　Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　Ｅｘｔｒａｃｔｓ　ｏｆ　Ｃｅｄａｒ　Ｐｉｎｅ　Ｎｅｅｄｌｅｓ　Ｌｏｕ　Ｙｉｎｇｂｉａｏ　，Ｃｈｅｎ　Ｆｅｉ。，Ｇａｏ　Ｓｕｈｕａ。　（　．Ｊｉｎｈｕａ　Ｇｕａｎｇｆｕ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｊｉｎｈｕａ，Ｚｈｅｊｉａｎｇ，Ｃｈｉｎａ　３２１０００；２．Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｊｉｎｈｕａ　Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｊｉｎｈｕａ，Ｚｈｅｊｉａｎｇ，Ｃｈｉｎａ　３２１００７）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｓｔｕｄｙ　ｔｈｅ　ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ａｎｄ　ｓｔａｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｓｏｌｖｅｎｔ　ｅｘｔｒａｃｔｓ　ｏｆ　ｃｅｄａｒ　ｐｉｎｅ　ｎｅｅｄｌｅｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｔｈｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｓｏｌｖｅｎｔｓ　ｏｆ　ｗａｔｅｒ，９５％ｅｔｈａｎｏｌ，ｅｔｈｙｌ　ａｃｅｔａｔｅ　ａｎｄ　ｐｅｔｒｏｌｅｕｍ　ｅｔｈｅｒ　ｗｅｒｅ　ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ　ａｄｏｐｔｅｄ　ｔｏ　ｅｘｔｒａｃｔ　ｃｅｄａｒ　ｐｉｎｅ　ｎｅｅｄｌｅｓ．Ｔｈｅ　ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｅｘｔｒａｃｔｓ　ｂｙ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｓｏｌｖｅｎｔｓ　ｗａｓ　ｔｅｓｔｅｄ　ｂｙ　ｔｈｅ　ｆｉｌｔｅｒ　ｐａｐｅｒ　ｍｅｔｈｏｄ．Ｏｎ　ｔｈｉｓ　ｂａｓｉｓ，ｔｈｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｖｏｌｕｍｅ　ｆｒａｃｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｅｔｈａｎｏｌ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｗｅｒｅ　ａｄｏｐｔｅｄ　ｔｏ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ　ｔｈｅ　ｍｏｓｔ　ｓｕｉｔａｂｌｅ　ｓｏｌｖｅｎｔ　ｆｏｒ　ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ　ｔｈｅ　ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ　ｏｆ　ｐｉｎｅ　ｎｅｅ—　ｄｌｅｓ．Ｍｅａｎｗｈｉｌｅ，ｔｈｅ　ｉｎｆｌＨｅｎｃｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｔｈｅｒｍａｌ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，ｍｅｄｉｕｍ　ｐＨ　ａｎｄ　ｓａｃｃｈａｒｏｓｅ　ｃｏｎｔｅｎｔ　ｏｎ　ｔｈｅ　ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｓｔａｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　ｐｉｎｅ　ｎｅｅｄｌｅｓ　ｅｘｔｒａｃｔ　ｗａｓ　ａｌｓｏ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｐｉｎｅ　ｎｅｅｄｌｅｓ　ｅｘｔｒａｃｔ　ｂｙ　５０％ｅｔｈａｎｏｌ　ｈａｄ　ｔｈｅ　ｂｅｓｔ　ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ　ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｔｈｅ　ｔｈｅｒｍａｌ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｈａｄ　ｎｏ　ｏｂｖｉｏｕｓ　ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ　ｏｎ　ｔｈｅ　ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ　ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｔｈｅ　ｍｅｄｉｕｍ　ｐＨ　ｖａｌｕｅ　ａｎｄ　ｓａｃｃｈａｒｏｓｅ　ｃｏｎｔｅｎｔ　ａｆｆｅｃｔｅｄ　ｔｈｅ　ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｔｏ　ｓｏｍｅ　ｅｘｔｅｎｔ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｃｅｄａｒ　ｐｉｎｅ　ｎｅｅｄｌｅｓ　ｅｘｔｒａｃｔ　ｈａｓ　ｂｅｔｔｅｒ　ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ａｎｄ　ｃａｎ　ｂｅ　ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ　ａｎｄ　ｕｔｉｌｉｚｅｄ　ａｓ　ｏｎｅ　ｏｆ　ｎａｔｕ—　ｒａｌ　ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｖｅ　ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｃｅｄａｒ；ｅｘｔｒａｃｔ；ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ　ａｃｔｉｖｉｔｙ；ｓｔａｂｉｌｉｔｙ　以植物资源为原料研制无化学毒害、无残留、无副作用的天　烧瓶中，以１：１０的料液比分别加入水、９５％乙醇、乙酸乙酯和石　然防腐剂正成为当今研究热点。松针是松科松属植物的叶，是一　油醚进行混合，置恒温水浴锅中分别回流提取２．５ｈ，过滤，收集　种来源广泛、储蓄量大的天然可再生资源。现代研究表明，松针富　滤液。其中９５％乙醇、乙酸乙酯、石油醚提取液用旋转蒸发仪回　含叶绿素、维生素、挥发油类、蛋白质、氨基酸、有机酸、可溶性糖　收溶剂得到浸膏，置通风橱中风干、备用；水提液浓缩后真空冷冻　类、矿质元素等成分，除具有镇静、镇咳、镇痛、解热、抗炎等作用　干燥。在测定抑菌活性前将４种提取物用二甲基亚砜（ＤＭＳＯ）溶　外，还具有增强免疫力、调节血脂、抗衰老、抗疲劳等功能　－５］。民　解，配成质量浓度为２００　ｇ／Ｌ的溶液，备用。　间一直有用松针泡酒消毒和水果保鲜的习俗，过去对松针的药用　２．１．２　抑菌活性检测　及药理活性研究较多，而对松针的抑菌活性研究甚少，特别是对　供试菌株悬浮液制备：将金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大　雪松（ｃｅｄｒｕｓ　ｄｅｏｄａｒａ）的抑菌活性尚未见报道。因此，本试验中针　肠杆菌分别接种于固体肉汤培养基中，３７℃恒温培养２４　ｈ；将黄　对雪松提取物进行了抑菌活性和抑菌稳定性研究，旨在为将松针　曲霉、青霉接种于查氏培养基上，２６℃恒温培养４８　ｈ；将啤酒酵　提取物用作抑菌防腐剂的开发利用提供理论依据和试验数据。　母接种于麦氏培养基上，恒温培养４８　ｈ。用接种钩挑取已进行菌种　１　仪器与材料　斜面活化的培养基表面的菌块，加入无菌生理盐水，在组织研磨器　ＤＨＰ一９０５２型电热恒温培养箱（上海和呈仪器制造有限公　中研磨均匀，并将菌悬液的浓度调节到１×１０６～６　Ｘ　１０　ｃｆｕ／ｍＬ。　司）；ＬＤＺＸ一７５ＫＢＳ型高压灭菌器（上海楚柏实验室设备有限公　抑菌试验：采用滤纸片法，将直径５　ｅｍ的滤纸圆片，经高压　司）；净化工作台（苏州安泰空气技术有限公司）；旋转蒸发仪（上　灭菌处理后干燥，分别滴加２０　上述４种不同溶剂的提取液作　海盛玻仪器有限公司产品）；ｓｃｉｅｎｔｚ一１９２高通量组织研磨器（宁　为试验样片，滴加ＤＭＳＯ液作为阴性对照片。根据不同菌种，配制　波新芝生物科技股份有限公司）；恒温水浴锅（上海科析实验仪器　相应的固体培养基，将固体培养基溶化倒入培养皿中冷却、凝固　厂）等。雪松松针叶采摘于金华广福医院后山上，烘干备用。金黄　后，用无菌棉拭子分别蘸取各试验菌的菌悬液，均匀涂布培养基　色葡萄球菌（Ｓｔａｐｈｙ　ｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）、大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）、　表面，制成含菌平板，每个菌种重复３次。稍干后用无菌镊子将４片　枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂ　ｔｉｌｌｓ）、黄曲霉（Ａ　ｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｆｌａｖ．ｓ）、青霉　试验样片和１片阴性对照样片贴放于每个培养皿表面，盖好培养　（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｓｐ）、酵母菌（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由金华职业技　皿，细菌于３７℃培养２４　ｈ，真菌于２８℃培养７２　ｈ。测量抑菌圈的　术学院基础医学实验中心提供。　直径，计算３次重复试验的平均值。结果见表１。可见，雪松松针　２　方法与结果　水提物和９５％乙醇提取物对各试验菌有较强的抑菌活性，其中　２．１　松针不同溶剂提取物抑菌试验　对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的抑菌活性较强，抑菌圈直径都达　２．１．１　提取物制备　到了１０　ｍｍ以上；相对而言，乙酸乙酯和石油醚提取物对各试验　取烘干的雪松松针，剪成ｌ一２　ｃｍ，称取２０　ｇ，置２５０ｍＬ圆底　菌的抑菌活性较弱。在相同条件下，不同极性溶剂能提取的活性　・药物研究・　中目茜　（　ｍａ　Ｊｌａｒｍａｃｅｕ咖口　２０１３年４月２０日第２２卷第８期　Ｖｏ１．２２，Ｎｏ．８，Ａｐｒｉｌ　２０，２０１３　Ｄｒｕｇ　Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃｏｔｉｏｎ　成分种类和数量不同，这会直接影响提取物的抑菌活性。为了更　和５．０时，培养基本身就能抑制细菌的生长，故ｐＨ为４．０和５．０　时无法测量抑菌圈。松针提取物在碱性条件下抑菌活性减弱，可能　好地把雪松松针的抑菌活性成分提取出来，进一步确定提取雪松　松针抑菌物质的最佳溶剂，进一步设计了不同体积分数乙醇提取　物的抑菌活性试验。　表１　松针不同溶剂提取物的抑菌试验结果（抑茵圈直径／ｍｍ）　与碱性介质促使松针提取物中的抑菌成分发生了一些变化有关。　培养基含糖量：在培养基中添加蔗糖，分别配制含４％，８％，　１２％，１６％，２０％蔗糖的培养基，以不加蔗糖的培养基作为对照。　以金黄色葡萄球菌为指示菌，测定培养基糖含量对５０％乙醇提　取物抑菌效果的影响，结果见表３。可见，当培养基含糖量达到一　定水平后，松针提取物的抑菌活性有加强趋势。这表明松针与糖　有一定的协同作用，这可能与一定含量的蔗糖溶液会影响微生物　生长的渗透压而抑制细菌生长的机制有关。　注：“一”表示未观察到明显的抑茵圈，下表同。　表３　不同处理方法对提取物抑茵活性的影响（抑茵圈直径／ｍｍ）　处理方法　热处理（温度，＇ｔ３）　２．２　松针不同体积分数乙醇提取物抑菌试验　２．２．１　提取物制备　水平　４０　６０　８０　抑茵圈（ｍｍ）　处理方法　水平　抑茵圈（ｒａｍ）　１２．６　１３．１　ｌ２．８　培养基ｐＨ　８．０　９．０　对照　８．４　６．５　１３．４　取烘干的雪松松针，剪成１～２　ｃｍ，称取２０　ｇ，置２５０ｍＬ圆底　烧瓶中，以１：１０的料液比分别加入２５％，５０％，７５％，９５％４种　不同体积分数的乙醇，置恒温水浴锅中分别回流提取２．５　ｈ，过　滤，收集滤液。其中９５％乙醇用旋转蒸发仪回收溶剂得到浸膏，　置通风橱中风干备用；２５％，５０％，７５％乙醇提取物适当浓缩后真　空冷冻干燥。在测定抑菌活性前将４种提取物用５０％乙醇溶解，　配成质量浓度为２００　ｇ／Ｌ的溶液，备用。　２．２．２　抑菌活性检测　１００　对照　ｌ２．７　１２．９　培养基糖含量（％）４　８　１１．９　１３．３　培养基ｐＨ　４．０　５．０　６．０　—　—　１５．９　１２　ｌ６　２Ｏ　１２．３　１５．４　１６．８　７．Ｏ　１３．１　对照　１２．６　采用滤纸片法，将上述４种不同体积分数的乙醇提取物作为　试验样片，将５０％乙醇作为阴性对照片。按２．１．２项下方法进行　试验，测量抑菌圈的直径，计算３次重复试验的平均值。结果见表２。　可见，５０％乙醇提取物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆　菌、啤酒酵母的抑菌活性最强，７５％乙醇提取物对黄曲霉和青霉　３　讨论　在考察各提取物的抑菌活性时，充分考虑了提取溶剂可能对　试验结果的干扰，因此在进行抑菌试验时，都对各提取溶剂进行　浓缩回收，且在抑菌试验前统一用同种溶剂溶解，以消除提取溶　剂对结果的影响。考虑到实际应用，本试验选取了在制备和加工　两种霉素的抑菌活性最好。综合考虑，５０％乙醇可作为雪松松针　抑菌活性成分提取的最佳溶剂。　表２　松针不同体积分数乙醇提取物的抑菌活性（抑茵圈的直径／ｍｍ）　供试品　２５％乙醇提取物　５Ｏ％乙醇提取物　食品药品过程中常采用的处理方式来考察松针提取物的抑菌稳　定性，如热处理、介质ｐＨ的变化和添加蔗糖等，以期能对松针　应用于食品药品的抑菌防腐提供一些参考　。本试验通过两步　法考察了可用于提取雪松松针抑菌成分的最合适溶剂，但对于　金黄色葡萄球菌大肠杆菌枯草芽孢杆菌　黄曲霉　青霉　啤酒酵母　１１．５　１３．２　９．２　１１　９　９．５　１０．６　７．４　１０．９　９．６　１０．３　９．０　１０．５　其中起主要抑菌作用的成分尚不能明确，下一步将对松针主要　抑菌成分进行分离纯化与结构测定，以明确松针抑菌活性的物　质基础。　７５％乙醇提取物　９５％己醇提取物　５０％乙醇对照　ｌ１　８　１０　０　一　１Ｏ．３　１１．３　５．５　９．３　９．７　７．３　１１．５　７．３　—　１１．５　ｌ０．５　５．６　８．２　９．９　５．８　作者简介：楼英彪（１９６８一），大学本科，副主任药师，研究方　向为医院药学，（电子信箱）ｊｈｌｏｕｙＢ１２６．ｃｏｒｎ；陈菲（１９６５一），硕士　研究生，副主任药师，研究方向为天然药物提取与质检，本文通讯　作者，（电子信箱）１５４６３４７２＠ｑｑ．ｅｏｌｎ。　２　３　松针提取物抑菌稳定性试验　由于雪松松针５０％乙醇提取物的抑菌活性较好，因此以金　黄色葡萄球菌为指示菌，对该提取物不同处理方法的抑菌稳定性　进行研究。　参考文献：　【１］张志琴，肖培云，刘光明．松针的化学成分和药理活性研究进展【ｊ】．　现代药物与临床，２０１１，２６（４）：２７８—２８１．　热处理：将５０％乙醇提取物分别置４０，６０，８０，１００℃的水浴　［２】刘东彦，石晓峰，李　冲，等．雪松松针黄酮类化学成分的研究［Ｊ］．　中处理３０　ｍｉｎ，以未加热处理的样品作为对照。以金黄色葡萄球　菌为指示菌，测定热处理对５０％乙醇提取物抑菌效果的影响，结果　见表３。可见，雪松松针５０％乙醇提取物经不同温度处理后，抑菌活　中草药，２０１１，４２（４）：６３１—６３３．　［３］孔庆峰，杨金宇，潘西芬．松针药理作用研究进展［Ｊ］．中国医药导　报，２０ｌ０，７（２６）：１６—１８．　性基本保持不变，表明松针中的抑菌成分具有较高的热稳定性。　培养基ｐＨ：用０．１　ｍｏｌ／Ｌ的ＨＣ１和０．１　ｍｏｌ／Ｌ　ＮａＯＨ溶液分　别调节培养基的ｐＨ至４．０，５．０，６．０，７．０，８．０，９．０，以未调节ｐＨ　的培养基为对照。以金黄色葡萄球菌为指示菌，测定培养基ｐＨ对　５０％乙醇提取物抑菌效果的影响，结果见表３。可见，随着基质ｐＨ　的升高，松针提取物对试验菌的抑菌活性持续下降，当ｐＨ为４．０　【４］王加志，刘树民，孙保芳．松针临床应用及药理研究概况【Ｊ］．中国药　师，２００７，ｌｏ（８）：８１６—８１８．　［５１张军民，石晓峰，李　冲．雪松松针化学成分研究［Ｊ］．中药材，２０１０，　３３（２）：６０—６３．　［６］程道梅，王中凤，曾凡坤，等．紫苏乙醇提取物抑菌活性研究［Ｊ】．成　都医学院学报，２０１１，６（３）：２２２—２２５　（收稿日期：２０１２—０８—２０）