AD转基因小鼠的鉴定

一、 剪鼠尾

1. 剪鼠尾的时间 当新生的小鼠年龄达到两到三周（耳朵已经长开）时剪鼠尾较好，

此时鼠尾剪起来比较容易且小鼠的生命力比较强。 2. 分辨小鼠的年龄

a当小鼠整个身体较红且腹部无奶时，此小鼠当天出生或前一晚出生；

b当小鼠腹部有奶（腹部有一小团白色物质），此小鼠出生2~3天； c当小鼠背部长出皮毛时，此小鼠出生3~4天；

d当小鼠毛长全，但眼未开时，此小鼠出生10天左右； e当小鼠眼刚开，耳未开时，此小鼠出生12天左右； f当小鼠耳刚开时，此小鼠出生14天左右。 3. 剪鼠尾后对小鼠的标记 ：打耳孔法 二、 从鼠尾中提取DNA

采用鼠尾基因组DNA提取试剂盒（康为世纪：cw2094）提取DNA，操作如下： 1. 剪取小鼠长度为0.4-0.6cm的尾巴，放入灭菌后的离心管中，加入180μL Buffer GTT。震荡混匀。

2. 加入20μL proteinase K，涡旋震荡，彻底混匀。

3. 置于56℃水浴，直到组织溶液完全清澈，一般需消化6-8h，赋予过程中涡旋震荡，使样品均匀分离。 注意：

1） 如果赋予和涡旋震荡后仍然有胶状物质，必要时过夜消化再加入20μl proteinase K消化，不会影响后续操作。

2） 如需去除RNA，可在上述步骤完成后，加入4μl浓度为100mg/μl的RNase A溶液，震荡混匀，室温放置5-10min。

4. 14000rpm 离心 1min，以消除未消化的类似于鼠毛等组织，将上清转移到一个新的灭过菌的离心管中。

5. 加入200μl Buffer GL，涡旋震荡，充分混匀，加入200μl 无水乙醇，涡旋振荡，充分混匀，短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。 注意：

1）加入Buffer GL 和无水乙醇后要立即涡旋震荡混匀。

2） 如果多个样品一起操作，Buffer GL 和无水乙醇可以等比例混匀后一起加入样品。

3）加入Buffer GL 和无水乙醇后可能会产生白色沉淀，不会影响后续操作。 6. 将步骤5中所得到的溶液全部加入到已装入收集管的吸附柱中，若以此不能加完溶液，可分多次转入。10000rpm 离心 1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

7. 向吸附柱中加入 500μl Buffer GW1（使用前检查是否已加无水乙醇），10000 rpm 离心 1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。 8. 向吸附柱中加入 500μl Buffer GW2（使用前检查是否已加无水乙醇），10000 rpm 离心 1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。如需进一步提高DNA纯度，可重复步骤8。

9. 12000rpm 离心 2min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾

干。

注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的乙醇去除，乙醇的残留会影响后续的酶促反应（酶切，PCR等）。

10. 将吸附柱置于一个新的灭过菌的离心管中，向吸附柱的中间部位悬空加入50-200μl Buffer GE或灭菌水，室温放置2-5min，10000rpm 离心 1min，收集DNA溶液，-20℃保存DNA。 注意：

1）如果下游实验对PH值或EDTA敏感，可以用灭菌水洗脱，洗脱液的PH值对洗脱效率有很大影响，若用水作洗脱液应保证其PH值在7.0-8.5直接，PH值低于7.0时洗脱效率不高。

2）离心前室温孵育5min可增加产量。

3）用另外的50-200μL Buffer GE或灭菌水再次洗脱可以增加产量。

4）如果需要提高DNA的终浓度，可以将步骤10所得的DNA洗脱液重新加至吸附膜上，重复步骤10；若洗脱体积小于200μL，可以增加DNA的终浓度，但可能会减少总产量。 三、 PCR PCR程序设定：

1＝ 94.0℃ for 5:00 2＝ 94.0℃ for 1:00 3＝ 59.0℃ for 0:50 4＝ 72.0℃ for 1:00 5＝ Goto 2 2times 6＝ 94℃ for0:50 7＝ 58℃ for 0:50 8＝72℃ for 1:00 9＝Goto 6 2times 10＝ 94.0℃ for 0:50 11＝56.0℃ for 0:50 12＝ 72.0℃ for 1:00 13＝ Goto10 32times 14＝ 72.0℃ for 10:00 15＝ 4.0℃ for 5:00 16＝END

目前实验室的双转基因小鼠AD体系采用： PCR反应的体系（12μl）：APP

Primer APP-1 1.3μl Primer APP-2 1.3μl ddH2O 2μl mix（CW0682） 6μl DNA 1μl

PCR反应的体系（12μl）：PS1

Primer PS1-1 1.3μl Primer PS1-2 1.3μl 内参-1 1μl 内参-2 1μl

mix（CW0682）6μl DNA 1μl

先在1.5ml的EP管中加入总的体系再平均分装入各个PCR管中（一般多加两小管的量），将移液器调到总量的1/3到1/2体积在EP管中缓慢抽吸若干次（尽量避免产生气泡）以便Taq酶混合均匀，最后再在各PCR管中依次加入DNA样品。

引物处理方法：引物在安基生物有限公司合成后，EP管上会有标记，一般为x nmol，使用前先用12000rpm 离心 1min，加入10x μl ddH2O，涡旋振动混匀，微型离心机离心，即可得到100μM的母液，取10μl 的母液，用ddH2O稀释10倍，即加入90μl，混匀后即可得到10μM的引物工作液。 四、 电泳

1． 配胶：鉴定用的胶板有大、中、小3种，分别用的梳子为50、25、11齿。分别用的0.5*TBE的量为90ml、45ml、25ml。用1.5%的琼脂糖凝胶。

2． 点样：12μl的DNA，Marker加5μl。点样时注意逐个点样，不要点错，最好把中间的那个孔留着点Marker，这样可避免点样的出错。Marker的选择依基因片段大小而定。

3． 跑电泳：打开电源，150v电压，30min左右即可。

4． 照胶：看是否有目的条带，即可判断对应小鼠是阳性、阴性或是杂合子。 5． 保存。