噬菌体展示布鲁氏菌基因文库插入效率鉴定

吉林农业科技学院学报

2019年3月Journal of Jilin Agricultural Science and Technology University

Vol. 28 No. 1Mar. 2019

噬菌体展示布鲁氏菌基因文库插入效率鉴定

于凌姘，张履冰，王阔鹏，刘倩宏*

摘要:布鲁氏菌病是由布鲁氏菌引起的以流产和发热为主要特征的人兽共患病，严重威胁着人和多种动物的

生命健康，导致巨大经济损失及严重危害公共安全。实验室前期利用噬菌体展示技术建立布鲁氏菌16M株基 因组文库，以期从该文库中筛选具有良好抗原性的诊断制剂。为检测构建文库的随机性及多样性，本研究利用

Touch - down PCR对构建的噬菌体展示布鲁氏菌基因组文库进行评价。结果表明，构建文库具有较好随机性及

多样性，为后续试验奠定基础。

关键词:布鲁氏菌;Touch - down PCR;噬菌体展示基因文库

基金项目：吉林农业科技学院大学生科技创新项目（吉农院合字[2018]第11439024号）收稿日期=2018-09-20

文章编号:1674-7852(2019)01-0001-03

作者简介:于凌娇，吉林农业科技学院动物科技学院野生动物与自然保护区管理专业学生，本科;刘倩宏，通讯作

者，吉林农业科技学院动物科技学院副教授，博士，从事布鲁菌病相关研究。（吉林132101 )

布鲁氏菌病的诊断方法主要包括流行病学调查、临床诊断、病理变化、细菌学和血清学诊断[1]。血清 学方法有快速准确等诸多优越性，是国际上最常用的诊断方法。但其不能用于区分动物的天然感染和后 天免疫。且一些其它革兰氏阴性细菌，如大肠杆菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、沙门氏菌等亦有类似的脂多 糖〇 -链结构，与布鲁氏菌存在严重的血清学交叉反应，易产生假阳性。因此，新型诊断抗原的筛选成为

关键[2]〇

实验室前期建立噬菌体展示布鲁氏菌16M株基因组文库，拟从该文库中筛选具有良好抗原性的诊断 制剂，为新型诊断方法建立奠定基础。本研究利用Touch - down PCR技术对建立的文库进行评价，检测文 库插入片段的随机性及多样性，为后续试验奠定基础。

1试验材料与方法

噬菌体展示马耳他布鲁氏菌16

1.1试验材料与主要仪器

M株基因组文库(本实验室前期构建）；无菌水;Taq MaSterMiX(购自康 为世纪生物有限公司）；标准DNA marker;质粒pYWOl。PYWF、PYWR(长春库美生物公司合成）。

LB液体培养基(含2(Vg/mL氯霉素）：称取胰蛋白胨0• 5 g，酵母提取物0• 5 g，NaCL 0• 25 g，用去离子

水定容补足体积至50

mL。加热融化，用Imol/LNaOH溶液调节PH至偏碱性。待蒸汽灭菌后，将培养基

放置水浴锅中，待温度降至40 T左右添加氯霉素以20 pg/mL的终浓度添加于培养基中。

LB固体培养基(含20 pg/mL氯霉素）：称取胰蛋白胨2 g，酵母提取物2 g，NaCL 1 g，琼脂糖4 g，用去

离子水定容补足体积至500 mL。待蒸汽灭菌后，将培养基放置水浴锅中，待温度降至40 1左右添加氯霉 素以20 /

pgmL的终浓度添加于培养基中。冷却之前倒板保存。

mL

1%琼脂糖凝胶电泳上样缓冲液:取EDTA 4. 4 g，溴酚蓝250 mg，二甲苯腈蓝FF250 mg，溶于200

蒸馏水加热搅拌溶解。加入180

mL甘油后，用NaOH调PH至7.0。蒸馏水定容至500 mL，分装保存。

1 %琼脂糖凝胶:称取〇. 3 g琼脂糖置于锥形瓶中，加入30 mL 1 x TAE缓冲液，瓶口倒扣小烧杯，微波 炉加热煮沸至琼脂糖全部融化溶液澄清透明为止，大约需2 min，取出摇勻，冷却至60 1以下，加入2斗 EB，摇勻。（注意:一定要等冷却至60 T以下再加入EB，EB高温挥发致癌性较强，全程要戴手套操作。）

PCR扩增仪（BIO - RAD 621BR28014 Made in Singapore );超净台（北京东联哈尔仪器制造有限公司 BSC - 1100 IIA2);稳压电泳仪(北京君意东方电泳设备有限公司JY300E);摇床(上海领成生物科技有限 公司 TC -200B);凝胶成像仪（Prism LPMPI230 - 12070010);无菌恒温培养箱（Thermol)。

1.2试验方法

1.2.1复苏噬菌体展示布鲁菌基因组文库取出-80 保存的基因文库，用接菌环蘸取适量菌液，涂布

T

2

于

吉林农业科技学院学报

第28卷

LB固体平板(含20 pg/mL的氯霉素）；静置于37 1恒温培养箱中过夜培养，次日观察菌落形态;并挑 取单菌落导入到5 ML新鲜LB液体培养基中（含20 pg/mL的氯霉素），37 1180 rmp条件下摇动培养12 - 16 h，此即为复苏布鲁氏菌基因组文库。

1.2.2检测布鲁菌基因组文库容量将新鲜的布鲁氏菌基因组文库菌液10倍比稀释，并将不同稀释倍

LB固体培养基中（含20 pg/mL的氯霉素）。37 1静置培养过夜。次日观察单菌落个 数，按照以下公式计算基因文库容量。菌落数(cfn/ mL)=单菌落数X稀释倍数X 100。1.2.3引物设计及合成根据pYWOl质粒序列，利用primer 5• 0设计引物，引物序列如下：

上游引物(F) 5'AACATATGAAATACCTGCTGCCGAC 3';下游引物（R) 5'TCTTCCTCAGAGATCAGCTTCTGCT

数菌液分别涂布于

3'。（引物由长春库美生物公司合成)。

将合成好的引物放入离心机瞬离然后放入超净台内，关闭风机，轻轻打开装有引物的离心管，取37 蒸馏水轻缓稀释。（注意:打开离心管要轻，防止引物跑出去）。

PCR体系及运行条件建立由于插入质粒pYWOl中的外源片段大小在0.3-2.0 kb之间，因此 建立的文库为随机文库。因此，我们利用Touch-down PCR方法对不同大小质粒进行扩增。

Touch - down PCR反应体系如下：

Taq MasterMix10^LPYWF1 |jlL

20ulPCR 体系:PYWR1 |jlL

6jjlL无菌水

、模板菌液(布鲁菌16M基因组文库）2^L

Touch-down PCR 运行条件:95 T 3 min，95 T 30sec，65 T30sec，72 T 1 min，其中退火温度从65 T依

1.2.4

次降落到50 1，温度每降一度运行两个循环，最后50 1运行10个循环，共计40个循环。

PCR对基因文库进行扩增，检测其插入效率及随机性。

1.2.5布鲁氏菌基因组文库插入效率及随机性检测以

pYWF、pYWR为上下游引物，利用Touch-down

T

以1%琼脂糖凝集电泳检测结果。将制胶板洗净晾干，置于水平位置，并放好样品梳子。将冷到60中进行点样。

取5斗样品溶液和2斗上样缓冲液，混勻后，加入样品孔中。加

左右的琼脂糖凝胶液缓缓倒入制胶槽内。待胶凝固后，取出梳子，将胶槽放在已倒好电泳缓冲液的电泳槽

5 pLmarker于另一孔。上样完毕

后，调电泳仪各参数(U:80 V; A ;200 A;T:40 min)进行电泳，凝胶成像系统观察结果。

2试验结果

基因组文库容量检测

观察培养布鲁氏菌基因组文库菌液平板上，共生长了约26个单菌落，则库容量检测结果为:26xl00

1 25 68 9 10 11 12 13 14 15 16 17X 100 = 2. 6 x 105 pfu/mL0 达到建 库要求，进行文库插入效率及随机 性检测。

10000bp5000bp3000bp2000bp1500bplOOObp750bp500bp250bplOObp

2.2布鲁氏菌基因组文库插入效 率及随机性检测

以布鲁氏菌16M基因组文库 为模板进行1%琼脂糖凝胶电泳检 测扩增结果，如图1所示。

PCR

由图1可见，第2、4、5、7、8、9、11、13、14、15、16、17 泳道为阳性，且阳性条带位置大小不一，插入效 率达到75%以上。结果表明片段

图1 PCR检测结果

1泳道为lOOOOmarker，条带大小如图所示；2 - 17泳道为PCR鉴定结果。

第1期___________________于凌娇，等:噬菌体展示布鲁氏菌基因文库插入效率鉴定_______________________3_成功高效插入噬菌体载体筛选需要。

pYWOl中，且插入的片段大小不一，具有较好的随机性。结果表明，实验室前期 构建的噬菌体展示布鲁氏菌16M株基因组文库具有良好的插入效率及随机性，满足建库要求，符合后续

讨论

3

为了筛选出布鲁氏菌新型诊断抗原，为该病诊断方法的完善奠定基础。实验室前期利用噬菌体展示 技术构建了布鲁氏菌16株基因组文库，以满足实验大范围的筛选需要。为检测实验前期构建文库的随

M

Touch - down PCR对构建的噬菌体展示布鲁氏菌基因组文库进行评价[3]。

传统PCR方法退火温度越低，引物和底物越容易结合，错配情况增多，造成PCR特异性降低，产物混 入预期外片段[4]。退火温度高则会引起扩增效率下降，甚至无扩增产物出现。Touch-down PCR也称降 落PCR。其原理是，选定一个退火温度范围，随着退火温度的降低，特异性逐渐降低，但在较高温度下特 异带已被放大，其浓度远高于非特异性带，并且随着退火温度的降低，特异带优先扩增[5]。Touch - down PCR程序与传统PCR程序相比能够很好的避免使用复杂基因组模板时非特异性PCR产物的出现，不仅

机性及多样性，本研究利用

提高了目的基因组模板的相对特异性，还具有分辨率高、重复性好等优点，可以敏感、准确、快速地鉴定基 因组文库插入效率，满足本试验临床大规模筛选和检测的需要[6]。

因引物大小为〇〇，且由于插入质粒中的外源片段为随机大小，因此建立的文库为随机文

lbppYWOl

库，且插入序列大小在0.3 -2.0测

kb之间。以布鲁氏菌16M基因组文库为模板进行1%琼脂糖凝胶电泳检

PCR扩增结果所示第3、6、10、12泳道条带为阴性，第2、4、5、7、8、9、11、13、14、15、16、17泳道为阳性，且 M

阳性条带位置大小不一，插入效率达到75%以上。（注:第2、3、4、5、7泳道上为引物二聚体，第7、8、15泳 道上出现两条条带，是引物特异性的问题，不影响结果的分析），结果表明，实验室前期构建的布鲁氏菌 16株基因组文库具有良好的多样性及随机性，满足建库要求，符合后续筛选需要[7_8]。

4结论

研究通过

PCR技术对实验室前期构建的布鲁氏菌基因组文库进行评价，根据电泳图谱表明;插入片

段大小数量不一。结果表明;插入片段具有良好的随机性及多样性。

参考文献：

[1] 王芳，冯宇，张阁，等.牛布鲁氏菌间接ELISA抗体检测方法的建立[J].华中农业大学学报，2008(6) :745-748.[2] 萨姆布鲁克J.分子克隆实验指南[M]. 3版.北京:科学出版社，2002.

[3] 宋晓蕾，周芬芬，吴堤，等.Tgf2转座子在团头鲂基因组中的插入效率[J].中国感染与化疗杂志，2017(1) :33-36.[4] Wightman F, Walters T, Ayres A, et al. Comparison of sequenceanalysis and a novel discriminatory real-time PGR assay for

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【责任编辑:吴艳玲】

第28卷第1期

吉林农业科技学院学报

2019年3月Journal of Jilin Agricultural Science and Technology University

Identification of phage display efficiency of Brucella gene library insertion

Vol. 28 No. 1

Mar. 2019

YU Lingjiao,ZHANG Lvbing ,WANG Kuopeng , LIU Qianhong(l)

Abstract ： Brucellosis is a zoonosis caused by Brucella spp. , which is characterized by abortion and fever. It seriously threatens the life and health of human beings and many animals, resulting in huge economic losses and serious public health hazards. The Brucella melitensis 16M strain genomic library has been established by phage display technique to screen diagnostic agtigens with good antigenicity. To detect the randomness and diversity of the library, Touch-down PCR was used to evaluate the phage-displayed library. The results show that the library has good randomicity and diversity, and lays the foundation for subsequent experiments.Key words： Brucella；Touch-down PCR；Phage display gene library

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