N_注入诱变黑曲霉选育单宁酶生产菌株

JournalofCentralSouthUniversityofForestry&TechnologyVo.l30No.9Sep.2010

N注入诱变黑曲霉选育单宁酶生产菌株

丁丽霞,黎继烈,钟海雁

(中南林业科技大学森林植物实验教学示范中心,湖南长沙 410004)

摘 要:

以黑曲霉为出发菌株,经多次N+注入诱变,得到突变高产单宁酶菌株黑曲霉ANO2。该突变菌株其产单宁

+

酶酶活为670.2U/mL,较出发菌株的单宁酶酶活442.3U/mL提高51.4%以上,突变菌株经传10代培养,产酶特性稳定,是一株比较理想的单宁酶生产菌株。关键词:

黑曲霉;N+注入;诱变育种;单宁酶

文献标志码:A

文章编号:1673923X(2010)09014104

!

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中图分类号:Q93-335

Breedingofhigh󰀁yieldtannasestrainfromAspergillusniger

+

byNimplantation

DINGLi󰀁xia,LIJi󰀁lie,ZHONGHai󰀁yan

(DemonstrationCenterforTeachingExperimentofForestPlant,CentralSouthUniversityof

ForestryandTechnology,Changsha410004,Hunan,China)

Abstract:UsingAspergillusnigerasoriginalstrain,mutatedstrainAspergillusnigerANO2wasobtainedbyN+implantation.Theresultsshowthattheactivityoftannaseraisedfrom442.3U/mLto670.2U/mL,whichwas51.4%higherthantheini󰀁

tialleve.lThrough10generationssuccessioncultivation,theenzymeproducingcapabilityofAspergillusnigerANO2tendedtobestable,soitisanidealtannasestrain.

Keywords:Aspergillusniger;N+implantation;mutationbreeding;tannase

黑曲霉是经美国FDA批准的允许直接添加到饲料中的益生菌之一。单宁酸等物质的存在,影响饲料的适口性,因此有必要降解饲料中的单宁酸。离子注入是我国学者首创的高新育种技术,具有能量沉积效应,动量传递、质量沉积及电荷的中和与交换效应。在低剂量注入轻的情况下,离子注入生物体后,由于电、能、质的综合作用,诱发强烈地影响生物细胞的生理、生化性能,造成遗传物质的基本单位!!!碱基的改变,诱发染色体结构变异。因此,利用离子注入诱变损伤轻、正突变率高和选育效果好等特点

[1-3]

方面的应用有着广阔的前景。本试验主要讨论低能氮离子注入对单宁酶生产菌株黑曲霉的诱变效应,确定最佳注入能量和剂量,同时通过筛选黑曲霉菌株来进一步提高单宁酶的产量。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

出发菌株的来源:黑曲霉系中南林业科技大学国家森林植物本科教学实验中心保存菌株。

试剂:单宁酸:98%,南京青泽医药科技开发有

,作为一种新型的诱变剂在微生物育种

收稿日期:2010-06-15

基金项目:中南林业科技大学大学生创新项目(2007-3D-GSX);国家󰀁十一五󰀂科技支撑项目(2009BADB1B10)作者简介:丁丽霞(1986-),女,硕士研究生,主要从事发酵工程方面的研究

通讯作者:黎继烈(1959-),女,湖南华容人,教授,博士生导师,主要研究方向农产品生物加工;E-mai:llijilie@163.com

142 中南林业科技大学学报第30卷

限公司提供;脱脂豆饼粉;其他试剂为国产常用AR级试剂。

1.2 主要仪器设备

LZD-900离子注入机;紫外分光光度仪;灭菌锅;超净工作台;生化培养箱等。1.3 主要培养基

斜面培养基:蔗糖3%,NaNO30.3%,MgSO4∀7H2O0.05%,FeSO40.001%,K2HPO40.1%,KCl0.05%,琼脂1.7%。

筛选培养基:蔗糖2%,0.5%单宁酸,NaNO3

0.3%,MgSO4∀7H2O0.05%,FeSO40󰀂001%,K2HPO40.1%,KCl0.05%,琼脂1.5%,pH自然。

发酵培养基:蔗糖2%,单宁酸0.5%,豆饼粉2%,蛋白胨0.5%,K2HPO40.5%,CaCl20.1%,Zn󰀁SO40.1%,MgSO4∀7H2O0.05%,每50mL分装于250mL三角瓶中。1.4 培养方法

斜面培养:30#,培养时间3~5d。

摇瓶发酵培养:30#,初始pH自然,250mL三角瓶装液量为50mL,摇床转速175r/min。1.5 诱变方法

1.5.1 单孢子悬液的制备

黑曲霉经固体斜面培养基活化培养3d后孢子成熟,加入10mL无菌水于斜面上洗下新鲜孢子,振荡,使孢子充分分散,制成一定浓度的孢子悬浮液,约10个/mL(血球计数板计数)备用。1.5.2 离子注入

用灭菌吸管吸取上述准备好的黑曲霉孢子悬浮液,滴于无菌的平皿中(液滴直径约4mm),涂布均匀,以无菌风吹至干燥,进行离子注入诱变。

离子注入机为LZD900多功能离子注入机,使

!

采用间歇脉冲注入,每个脉冲5s,间隔为25s,以消除大剂量下热效应产生的负作用。然后取出平皿,以0.5mL无菌水洗脱,涂分离平皿,于30#培养3~5d,计算单菌落的挑选和存活率。1.6 菌株筛选方法

初筛:利用单宁酸选择平板水解透明圈法进行初筛,在诱变后的筛选平板上挑取透明圈较大的菌落测定HE值(HE值=透明圈直径/菌落直径),选择HE值较大者移入斜面保存备用。

复筛:将初筛获得的菌株转入发酵培养基逐个发酵,于产酶高峰期40h时测定其单宁酶活力。1.7 酶活的测定方法

酶活的测定:取4mL0.35%单宁酸标准液和0.05mol/L的柠檬酸缓冲液0.5mL置于试管中,在40#恒温水浴中预热4~5min,然后加入预先稀释好的粗酶液0.5mL,充分摇匀,40#恒温水浴保温20min,加入5mL95%乙醇终止反应,40#恒温水浴保温10min,取该反应液进行紫外分光光度计分析,根据单宁酸标准曲线计算出单宁酸的含量。

单宁酶酶活定义:40#,pH6.0条件下每毫升酶液每分钟水解1󰀁g单宁酸的酶活力为1U。

2 结果与分析

2.1 氮离子注入诱变条件的选择

试验以黑曲霉为出发菌株,通过离子束诱变,在10、15、20keV注入能量下,存活率曲线如图1、图2和图3所示。

图1、图2和图3显示在同一能量下,小剂量离子注入时存活率较高,当剂量达到一定值后存活率下降明显,但随着剂量的增加,存活率有短暂回升后

6

用前进行紫外消毒。本试验将待处理的含菌培养皿放入离子注入机内进行连续式注入,靶室抽真空至10

-3

Pa,离子注入参数分别为:入能量为10keV

13

13

13

13

13

时,注入剂量为49∃10、198∃10、302∃10、396∃10、517∃10∃10

1313

2

ions/cm;注入能量15keV

13

13

13

2

时,注入剂量为31∃10、103∃10、192∃10、258

ions/cm;注入能量20keV时,注入剂量为28

13

13

13

13

2

图1 注入能量为10keV的N+离子注入存活率曲线Fig.1

Survivalrateofirradiatedwith10keVN+

∃10、58∃10、94∃10、140∃10、172∃10

ions/cm,并在靶室内放置不接受照射的对照样。

第9期

丁丽霞,等:N+注入诱变黑曲霉选育单宁酶生产菌株 143

果为F=34.22>F0.01=2.66,各菌株水解单宁酸能力的差异达到极显著水平。由于02、11、15号突变株与出发菌株水解单宁酸的能力差异极显著,故选

表1 不同突变株的HE值

Table1 TheHEofdifferentmutantstrains

菌株编号

平均HE值

2.352.412.342.372.392.392.362.38

菌株编号

0910111213141516

平均HE值

2.342.342.402.352.382.362.402.382.33

图2 注入能量为15keV的N+离子注入存活率曲线Fig.2 Survivalrateofirradiatedwith15keVN+

0102030405060708出发菌株

择02、11、15号突变株进行摇瓶复筛。

图3 注入能量为20keV的N+离子注入存活率曲线Fig.3 Survivalrateofirradiatedwith20keVN+

复筛对出发菌株及初筛中选育出来的02、11、15号突变株进行摇瓶培养,以40h发酵液酶活力作为评价菌株产酶能力的指标。结果发现02、11、15号菌株的平均酶活(U/mL)为673.6、648.9和662.1,比出发菌株分别提高了52.3%、46.7%和49.7%。其中02号突变株进行摇瓶复筛平均酶活提高最大,且初筛时透明圈直径最大,因此选择该菌株作为最佳产酶菌株进行后续研究。2.3 突变株的遗传稳定性

将复筛得到的02号菌株在麦芽汁斜面上连续传代10次,每次传代后同出发菌株一起在发酵培养基中进行摇瓶发酵培养,每代做三个重复,分别测定其在40h的发酵液酶活,其平均值结果记录于表2。

表2 菌株的遗传稳定性测定试验

Table2 Resultsofgeneticstabilityverification

传代次数12345 出发菌株

平均酶活/(U∀mL-1)673.9673.5673.0672.6672.2

较出发菌

株提高/%

52.452.352.252.052.0

传代

次数678910

平均酶活/较出发菌(U∀mL-1)株提高/%971.9671.6671.5971.2670.2442.3

51.951.851.851.851.40.0

逐渐下降,整个过程基本呈马鞍形曲线。原因分析为:离子注入细胞低剂量时离子对细胞表面进行损伤和刻蚀,因而存活率较高。随着剂量的增加,细胞表面刻蚀严重,离子损及细胞内部并产生大量自由基和软射线等,致使存活率急剧下降;继续加大剂量,细胞某种修复机制和修复酶被激活,存活率又有所回升。

根据经验,致死率达到70%~80%时,产生正突变的几率较高,有利于进一步筛选

2

[6]

。从图1~图3

13

可以看出:在注入能量为15keV,剂量为192∃10keV,94∃10

13

2

ions/cm剂量下存活率为21.0%,注入能量为20

ions/cm剂量下存活率为20.5%,这

两个对应的能量、剂量范围附近可继续进行诱变。本试验中采用在注入能量为15keV,剂量为192∃10

13

ions/cm剂量范围附近继续进行重复诱变3

2

次,来选育单宁酶生产菌株。2.2 氮离子注入诱变的初筛和复筛

采用点植法在选择平板上培养经过紫外线诱变的单菌落,4d后测量菌落透明圈的直径,并计算其HE值(结果见表1)。

结果表明,有16株突变株HE值大于出发菌株。为进一步探讨突变株与原始菌株水解单宁酸的能力是否存在差异,对表1数据进行了方差分析,结 结果表明,02号菌株具有较好的遗传稳定性,其酶活较出发菌株提高51.4%以上,是一株比较理想的单宁酶生产菌株,命名为黑曲霉ANO2(Asper󰀁gillusnigerANO2)。 144 中南林业科技大学学报第30卷

社,1998.

3 讨 论

离子注入诱变技术已发展成为一种新型的生物诱变手段,应用于作物育种、工业微生物菌种改良效应研究

[7-9]

[3] 汪杏莉.低能N+注入L󰀁Ile产生菌诱变选育及发酵条件研究

[D].郑州:郑州大学硕士学位论文,2007.

[4] YuZeng󰀁liang.IonbeamApplicationinGenenticModification

[J].IEEETransactionsonPlasmaScience,2000,28(1):128-132.[5]

YuZeng󰀁liang,DengJian󰀁guo,HeJian󰀁jun,

etal.Mutation

。由于单宁酶的研究开发迄今为止并未

引起人们应有的重视,目前有关筛选产酶菌株的报道较少,仅有的几篇也只局限于从天然源获得的产酶菌株,酶活性较低,因此有必要对单宁酶产生菌进行诱变选育,以提高产酶水平

[10]

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[9] 虞 龙,余增亮.一种新型诱变技术在Vc前体(2-KLG)产生

菌遗传改良中的作用[J].高技术通讯,2002,(11):41-46.[10] 郭鲁宏,杨顺楷.黑曲霉单宁酶高活性菌株的诱变选育[J].

。本研究应用低

能氮离子注入诱变黑曲霉进行单宁酶高产菌株的选育,获得的优良菌株黑曲霉ANO2,酶活高达673󰀂9U/mL,且传代稳定性好,进一步开展试验将有很好的生产和应用价值。离子注入诱变技术可调节参数多,在不同的参数组合下对结果有不同影响。对黑曲霉所作的离子注入诱变,突变幅度较大,遗传稳定性较好,诱变效果较为理想,为黑曲霉应用于饼粕饲料、饮料等研究奠定实验基础。参考文献:

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[本文编校:吴 彬]