温光诱导甜菜当年抽薹过程中过氧化物酶的研究

２００２年第２期　２　０　０　２年６月　中　国　甜菜糖业　２ｏ０２　Ｎｏ．２　ＣＨＩＮＡ　ＢＥＥＴ＆ｓＵＧＡＲ　Ｊｕｎ．２００２　温光诱导甜菜当年抽薹过程中过氧化物酶的研究　常缨，戴建军，马凤鸣　（东北农业大学，黑龙江哈尔滨１５００３０）　摘要：通过温光条件诱导甜菜（Ｂｅｔａ　Ｖｕｌｇａｒｉ．ｓ　Ｌ．）当年抽薹的过程中，诱导株内部发生复杂的生理和生化　变化，在低温春化后过氧化物酶活性表现出较高水平，以后随着生育的进程而逐渐降低，与对照组比较差　异显著，并从过氧化物酶的同工酶酶谱、过氧化物酶的超微细胞化学定位的角度加以证明。　关键词：甜菜；抽薹；过氧化物酶；同工酶；酶定位　中图分类号：Ｓ５６６．３；Ｑ５５４．＊６　文献标识码：Ａ　文章编号：１００２—０５５１（２ｏ０２）０２—０００３—０３　１．２试验方法　１．２．１过氧化物酶（ＰＯＤ）活性测定参照刘祖琪　（１９９４）的方法。酶液制备：取甜菜鲜叶片２．０ｇ，加　入５．０ｍｌ、６２．５ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ７．８）的磷酸缓冲液（内含　适量ｅｖｅ），于冰浴上研磨，４℃离心２０ｍｉｎ（１２０００　ｒ／ｍｉｎ）。上清液为酶液，置冰箱内４℃保存备用。　在２０ｍｌ刻度试管中，分别加入ｐＨ７．０磷酸缓冲液　ｌｍｌ、０．１％邻甲氧基苯酚（愈创木酚）ｌｍｌ及酶液　ｌｍｌ，摇匀后，置于３０℃恒温水浴中５ｍｉｎ后，立即加　入０．０８％Ｈ２Ｏ２溶液ｌｍｌ并混匀，ｌｍｉｎ后生成红棕　色的４一邻甲氧基苯酚（相当于１单位的愈创木　酚）。酶的活性用愈创木酚・　・ｈ　表示。重复　３次，并设对照，用ｌｍｌ蒸馏水代替０．０８％Ｈ２０２。　１．２．２　过氧化物同工酶的分析　参照汤章城　（１９９９）的方法。提取液的制备：取甜菜叶片２ｇ，加　入ｐＨ５．０醋酸缓冲液１０ｍｌ，低温匀浆后，在４℃下　离心２０ｍｉｎ（８０００ｒ／ｍｉｎ），取上清液备用。　凝胶电泳：用聚丙烯酰胺制成板状。丙烯酰　胺：Ｎ．Ｎ．一亚甲基一双丙烯酰胺＝３０：０．８（ｗ／ｗ），　凝胶浓度为７．０％，加入催化加速剂Ｎ．Ｎ．Ｎ．Ｎ．一　四甲基乙二胺０．ｏ５％（Ｖ：Ｖ）和过硫酸铵０．５０％　（ｗ／ｖ），凝胶缓冲液为０．５０ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ—ＨＣ１系统，　ｐＨ８．９，电极缓冲液为　甘氨酸，ｐＨ８．０。所有　电泳均在冰箱中进行，保持（４℃）恒定温度。板状　电泳柱体长１０ｃｍ，宽１５ｃｍ，使用电流３０ｍＡ，电泳时　间为２—３ｈ。样品液是由ｌｍｌ提取缓冲液和　ｌｍ１４０％蔗糖溶液加适量的（０．０１ｍ１）溴酚蓝前沿指　示剂制成，样品量为３０　。　凝胶染色和酶谱扫描：电泳毕剥出胶板，用蒸　馏水漂洗３次，然后置于抗坏血酸——联苯胺染色　液中，染色１—５ｍｉｎ（室温），当酶带着色均匀后，取　出放入３％醋酸液中，再固定，漂洗。一般隔夜即　可达到底色清晰，用滤纸吸除浮水，扫描。　１．２．３过氧化物酶组织细胞化学定位参照戴大　林（１９９３）的方法。将甜研７号诱导材料与对照组　材料茎端组织切成０．５ｒａｍ３以下的小块，迅速投入　０．０５ｍｏｌ／Ｌ二甲胂酸钠缓冲（ｐＨ７．０）的２．５％戊二　０前言　温光诱导甜菜当年抽薹的过程，实际上是春化　作用与光周期的协同作用。目前仅知道茎生长点　是感受低温的中心部位，而感受光周期的诱导部位　是叶片，这种协同作用发生反应的部位在茎端，因　而甜菜植株在接受温光诱导后，会引起体内许多代　谢途径和代谢方式的改变，某些酶活性在低温作用　下增加或减弱及某些特异蛋白质的合成等等…。　本项研究通过甜菜抽薹过程中过氧化物酶活性等　的测定和分析，旨在探讨温光诱导甜菜当年抽薹过　程中过氧化物酶的变化。　１材料和方法　１．１试验材料　试验用甜菜品种为甜研７号和甜研８号。试　验土壤为黑土，基础肥力中等，种肥施Ｎ、Ｐ，０５和　Ｋ２０，施用量每公顷分别为９０ｋｇ、９０ｋｇ和６０ｋｇ。温　光诱导材料先于对照组诱导，分３个阶段进行：（１）　将试验材料在温室种植于小钵中（每钵１０株，每组　３次重复）；（２）温光诱导：待植株长到１—２对真叶　期，置于光照培养箱中：１６ｈ光照，４ｏｃ，７０ｄ；（３）温室　定植：将试验材料于温室中（１４　２０℃）定植。对照　组材料（正常当年不抽薹株）于４周后播种于温室　小钵中，以保持与诱导株形态一致。　每隔约１５ｄ左右剪取一次叶片样品。第一次　取样（因尚不能观察出是否当年抽薹），在每重复的　各处理中随机连续选取３０株，并挂牌，继后在该抽　薹或不抽薹的试验材料中再各筛选出５株，进行定　株取样。测定酶活性的样品取样后，直接测定。　收稿日期：２００２—０４—０４　基金项目：国家自然科学基金资助项目（３００７０４４０）　作者简介：常缨（１９７０一）。女．河北省乐亭县人．东北农业大学生　命科学学院植物教研室．讲师。农学博士。　４　中　国　甜菜糖业　第２期　醛中，于Ｏ一４ｃ【＝下固定ｌｈ；用０．０５ｔｏｏｌ／Ｉ　厂顺丁　测定的结果基本一致。　烯二酸（ｐＨ７．０）缓冲液将材料清洗４次，共历时　３ｈ；将材料转入孵育基质ＤＡＢ［（四盐酸３．３二氨基　联苯胺）５０ｍｌ、０．０５ｍｏｌ／Ｉｍｓ－Ｊｔ￣丁烯二酸缓冲液　（ｐＨ　７．０）８ｒｎｌ、０．１％Ｈ２　Ｏ２　２ｍｌ】中，于２３　ｃ【＝下孵育　１５ｍｉｎ；用０．０５ｍｏｌ／Ｌ二甲胂酸钠缓冲液（ｐＨ７．Ｏ）清　洗４—５次，每次２０ｍｉｎ；用０．０５ｍｏｌ／Ｌ二甲胂酸钠　缓冲（ｐＨ７．Ｏ）的２％四氧化锇液后固定，于Ｏ　４ｃ【＝　下过夜；用相同的缓冲液清洗３次，每次１５ｍｉｎ，后　按常规的程序用酒精逐级脱水（３Ｏ％一５Ｏ％一７Ｏ％　一８Ｏ％一９０％一１ｏｏ％）、环氧树脂６１８渗透、包埋。　试验用材料采用ＬＫＢ型超薄切片机切片，醋酸双　氧铀染色，Ｈ一６ＯＯ型透射电子显微镜观察、拍照。　２结果与分析　２．１甜菜抽薹过程中过氧化物酶酶活力的分析　由图１与图２可见，甜菜在温光诱导过程及以　后的抽薹、开花的生育过程中，呼吸酶有较大的变　化，过氧化物酶活力表现出逐渐降低的趋势。对照　组变化不显著。品种问的变化趋势一致。温光诱　导后到抽薹前（４月５日　４月１２日），过氧化物酶　活力急剧降低。这表现出低温使过氧化物酶在甜菜　幼苗中有较高的积累，环境温度升高时（移至室温　后），过氧化物酶量降低。　６　西兰５　落　４　３　鲁姜２　超磊ｌ　０　４‘５　４－ｌ　２　４・ｌ　７　５－２　５・ｌ　７　取样日期（月・日）　图１甜７ＰＯＤ酶活力变化　专　龉　垦羹　器嚣　４・５　４－ｌ　２　４・ｌ　７　５－２　５・ｌ　７　取样日期（月一日）　图２甜８ＰＯＤ酶活力变化　２．２甜菜抽墓过程中过氧化物同工酶的分析　由图３、图４可见，在温光诱导以及以后的抽　薹、开花的生育过程中，呼吸酶有较大的变化：过氧　化物同工酶酶谱表现出逐渐降低的趋势。对照组　变化不显著。品种问的变化趋势一致。这种酶谱　的强弱和谱带的增减表现出与过氧化物酶的活力　熏　ｌ　２　３　４　１．温光诱导后２．抽薹前３．抽薹４．抽薹后５．开花期　图４甜８过氧化物同工酶酶谱　２．３甜菜抽墓过程中过氧化物酶的超微细胞化学　定位　由表１和版图Ｉ、版图Ⅱ可以看出：甜７抽薹　过程中过氧化物酶的超微细胞化学定位的结果表　现出在温光诱导过程中过氧化物酶在细胞壁上积　累较高，而随着生育的进展，逐渐降低，与对照组差　异明显。这与过氧化物酶的活力测定及同工酶分析　均表现出一致性。同时，观察到抽薹株中积累了较　多的过氧化物酶体。过氧化物酶体是微体的一种，　由单层膜包被，在电镜下颜色较深，其内多为方形　或多角形的结晶。　表１甜７抽墓过程中过氧化物酶　的超微细胞化学定位　第４期　常　缨，等：温光诱导甜菜当年抽薹过程中过氧化物酶的研究　ｃｖ．细胞壁，Ｖａ．液泡　５　１．４叶期，未见细胞壁上有明显的酶颗粒。２．６叶期，未见细胞壁上　有明显的酶颗粒，但在液泡膜上有酶颗粒存在。３．１Ｏ叶期，未见细　胞壁上有明显的酶颗粒，但在液泡膜上有酶颗粒存在。４．２０叶期，　未见细胞壁上有明显的酶颗粒，但在液泡膜上有酶颗粒存在。　图版Ⅱ：甜研７号非诱导株过氧化物酶的超微结构定位　３讨论　从甜菜茎端组织过氧化物酶活力的测定、过氧　化物同工酶分析及过氧化物酶的超微细胞化学定　一　位３个不同水平设计试验，结果均表现出相似的动　ｃｖ．细胞壁Ｐｅ．过氧化物酶体　态变化：在甜菜抽薹过程中，发生着复杂的生理和　１．诱导后未抽薹（４叶期），细胞壁上积累大量的酶颗粒。２．抽薹　前（６叶期）细胞壁上酶反应颗粒较少。３，４．抽薹期（１Ｏ叶期），细　胞壁上酶的颗粒少。５．抽薹后（１５叶期），细胞壁上未见酶颗粒，积　累较多的过氧化物酶体。６．开花期（２０叶期），细胞壁上酶颗粒少。　图版Ｉ：甜研７号诱导株过氧化物酶的超微结构定位　生化反应，低温春化使甜菜幼苗积累了大量的过氧　化物酶，而随着甜菜生育的进程，它可能直接或间　接地参与抽薹的发育过程，过氧化物酶如何参与抽　薹的调控有待于进一步的研究。　参考文献：　［１］谭克辉．春化过程中特异蛋白质的合成［Ｊ］．植物学集刊，１９９２，　（６）：１３～１６．　［２］杨肇驯，王文宏，谭克辉．冬小麦幼苗春化期间过氧化物酶的变　化［Ｊ］．植物生理学报，１９８１，７（４）：３１１～３１．　［３］汤章城．现代植物生理学实验指南［Ｍ］．科学出版社，１９９９．　［４］戴大林．生物医学电镜样品制备方法［Ｍ］．天津：天津大学出版　社．１９９３．　１５ｊＣｏｅｎ　Ｅ　Ｓ，Ｍｅｙｅｒｏｗｉｔｚ　Ｅ　Ｍ．　ｗａｒ　０ｆ　ｔｈｅ　ｗｈｏｒｌ８：Ｇｅｎｅｔｉｃ　ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ　ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ　ｆｌｏｗｅｒ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｎａｔｕｒｅ，１９９１，３５３，３１．　Ｔｈｅ　Ｓｔｕｄｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｉｎ　Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ　ｏｆ　Ｆｉｒｓｔ　Ｙｅａｒ　Ｂｏｌｔｉｎｇ　Ｓｕｇａｒ　Ｂｅｅｔ　Ｉｎｄｕｃｅｄ　ｂｙ　Ｌｏｗ　Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｐｈｏｔｏｐｅｒｉｏｄ　Ｃｈａｎｇ　Ｙｉｎｇ，Ｄａｉ　Ｊｉｎ—ｊａｕｎ，Ｍａ　Ｆｅｎｇ—ｒｕｉｎｇ　（Ｎｏｒｔｈｅａｓｔ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｒｂｉｎ　１５００３０，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｎ　ｔｈｅ　ｃｏｕｒｓｅ　ｏｆ　ｉｎｄｕｃｉｎｇ　ｂｙ　ｌｏｗ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　ａｎｄ　ｐｈｏｔｏｐｅｒｉｏｄ，ｔｈｅｒｅ　ｈａｖｅ　ｂｅｅｎ　ｓｏｍｅ　ｃｏｍｐｌｅｘ　ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｎｄ　ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａａｌ　ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｐｌｎｔ．Ａｆｔｅｒ　ｖｅｒａｎａｌｉｚａｔｉｏｎ　ｂｙ　ｌｏｗ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，ｔｈｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ　ｉｎ—　ｃｒｅａｓｅｓ　ａ　ｌｏｔ，ａｎｄ　ｔｈｅｎ　ｇｒａｄｕａｌｌｙ　ｄｅｃｒｅａｓｅｓ，ｗｈｉｃｈ　ｗａｓ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｄｉｆｅｒｅｎｔ　ｗｉｔｈ　ｔｈａｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃｏｎｔｒｏ１．Ｆｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅ　ｔｈｅｓｅ　ｅｓｕｌｔｒｓ　ｏｂｔａｉｎｅｄ　ｉｎ　ｔｈｉｓ　ｅｘｐｅｒｉｍｍｉｔ　ｗｅｒｅ　ａｌｓｏ　ｓｈｏｗｎ　ｂｙ　ｔｈｅ　ｌｏｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ　ｉｎ　ｃｅｌｌ　ｓｕｐｅｒｍｉｃｒｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｓｕｇａｒ　ｂｅｅｔ；Ｂｏｌｔｉｎｇ；Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ；Ｉｓｏｚｙｍｅ；Ｌｏｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｅｎｚｙｍｅ