氧化低密度脂蛋白检测及临床应用研究
姓名：孟扬申请学位级别：硕士
专业：生物学；生物化学及分子生物学
指导教师：汪俊军2009-05-26
南京师范大学硕士论文
氧化低密度脂蛋白检测及临床应用研究
摘 要
目的：(1)人血清中氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)自身抗体提取和鉴定。(2)分别采用自身抗体和多克隆抗体建立血清ox-LDL 酶联免疫吸附测定法(ELISA)并进行临床研究。(3)分析不同程度氧化、修饰低密度脂蛋白(LDL)特性变化，为ox-LDL检测标准化提供依据。(4)探讨ox-LDL水平在动脉粥样硬化(As)性心脑血管疾病中的变化，准确评价其临床价值。(5)采用自身抗体和多克隆抗体的ELISA法测定结果间比较。
方法：(1)采用溴化氰活化的琼脂糖凝胶sepharose 4B交联ox-LDL制备免疫吸附层析柱，从正常人血清中提取抗ox-LDL自身抗体。(2)分别建立以抗ox-LDL自身抗体、抗ox-LDL多克隆抗体为包被抗体，酶标抗载脂蛋白B (apoB)为检测抗体的ox-LDL ELISA检测法。(3)分别采用不同浓度的Cu2+和丙二醛(MDA)对LDL进行氧化、修饰，观察不同时相硫代巴比妥酸反应物质(TBARS)、共轭双烯(CD)和氧化位点等特性的改变。(4)采用ELISA法测定139例冠心病(CHD)组患者[急性冠状动脉综合征(ACS) 76例，非ACS组63例]血浆ox-LDL水平，根据冠状动脉造影结果将冠心病组分为多支病变组、双支病变组及单支病变组进行比较。
结果：(1) 经亲和层析提取正常人血清中存在的抗ox-LDL自身抗体，与ox-LDL具有良好的反应性；(2)氧化、修饰的LDL结构和生物特性发生改变，产生了新的氧化位点，同时部分原有位点被隐蔽；采用ox-LDL自身抗体建立的 ELISA法测定ox-LDL位点变化较多克隆抗体更为明显；(3)冠心病患者中，ACS组患者和非ACS组患者ox-LDL水平均显著高于正常对照组[ACS: (188.01±69.88) mg/L, 非ACS: (137.88±59.74) mg/L, 对照组: (82.68±29.06) mg/L; P均<0.001]；且ACS组患者ox-LDL水平显著高于非ACS组患者(P<0.001)。冠状动脉多支、双支、单支病变组间ox-LDL水平不同[(183.63±79.42) mg/L, (164.15±63.79) mg/L和(146.97±58.40) mg/L, P<0.05]，多支高于单支(P<0.01)。多因素分析显示冠状动脉病变程度仅与ox-LDL相关(R2=0.048, β=0.217, P=0.000)。(4) 两种ELISA方法
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所测结果相关性显著(r =0.502, P=0.000)；受试者工作特征(ROC)曲线显示，自身抗体和多克隆抗体法分析冠心病组的曲线下面积(AUC)分别为0.706和0.894，ACS组的AUC分别为0.741和0.948，非ACS组的AUC分别为0.661和0.826；两种方法差异显著(冠心病组：u =5.01, P<0.001；ACS组：u =5.47, P<0.001；非ACS组：u =3.52, P<0.001)。
结论：(1) 采用自身抗体建立的ox-LDL检测法能更真实、准确反映ox-LDL反应性的强弱。(2) 氧化、修饰可使LDL特性改变，为寻找稳定的、与体内ox-LDL特性相似的氧化脂蛋白作为参考物质提供理论和实验依据。(3) 冠心病患者ox-LDL水平升高，与病变程度相关，急性冠脉综合征患者变化尤为显著。(4) 两种ELISA法检测结果具相关性，均可作为冠心病的预测指标，多克隆抗体法预测价值优于自身抗体法。
关键词：低密度脂蛋白；动脉粥样硬化；自身抗体；酶联免疫吸附试验；氧化
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The Detection and Clinical Application of Oxidized Low Density Lipoprotein
Abstract
Objective: (1) To isolate and identify human autoantibodies against ox-LDL. (2) To develop new ELISA for ox-LDL by using isolated human autoantibodies and multiclonal antibodies against ox-LDL. (3) To compare the characteristics of oxidized LDL in different levels. (4) To study the significance of ox-LDL in the pathogenesis of acute coronary syndrome (ACS), and to evaluate the clinical value of detection of ox-LDL level. (5) To compare the results of two ELISAs for ox-LDL.
Methods: (1) To isolate and identify ox-LDL autoantibodies from healthy subjects by affinity chromatography, with the use of ox-LDL cross-linked to Sepharose 4B. (2) To develope two \"sandwich\" ELISAs for measuring plasma ox-LDL level, using human autoantibodies against ox-LDL or specific rabbit antiserum against human ox-LDL as the capture antibody and quantitating with monoclonal anti-apoB enzyme conjugate, respectively. (3) To oxidize LDL to different levels with different concentrations of Cu2+ or malondialdehyde (MDA), to observe the changed character of thiobarbituric acid-reactive substances (TBARS), conjugated dienes (CD) and oxidized site. (4) Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was used to measure the serum ox-LDL in 139 patients with coronary heart disease (76 ACS; 63 non-ACS) and 100 normal controls. The patients were divided by coronary angiography into a multi-vessel diseased group, an ambi-vessel diseased group and a mono-vessel diseased group. (5) Significant relation was showed between two ELISAs for ox-LDL,
Results: (1) Ox-LDL autoantibodies were isolated from healthy subjects, which were specific against ox-LDL. (2) The content of TBARS and CD and the oxidized site of ox-LDL were changed after oxidization. (3) The ox-LDL levels were significantly higher both in patients with ACS and non-ACS than that in normal
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controls [ACS: (188.01±69.88) mg/L, non-ACS: (137.88±59.74) mg/L, normal controls: (82.68±29.06) mg/L; P<0.001]; the ox-LDL level was significantly higher in patients with ACS than that in patients with non-ACS (P<0.001). Different plasma levels of ox-LDL were found in the multi-vessel diseased group, the ambi-vessel diseased group and the mono-vessel diseased group [(183.63±79.42) mg/L, (164.15±63.79) mg/L, and (146.97±58.40) mg/L, P<0.05]; the ox-LDL levels were significantly higher in multi-vessel diseased group than that in mono-vessel diseased group (P<0.01). Multiple linear regression analysis showed only ox-LDL levels were found significantly related with the extent of CAD (R2=0.100, β=0.316, P=0.000). (4) Receiver-operating characteristic curve (ROC) analysis confirmed that the performance of the assay in patients with CHD, ACS and non-ACS as shown by the area under the curve for ELISA using polyclonal antibody was superior to that for ELISA using autoantibody [CHD:(area: 0.894 vs. 0.706, respectively; u=5.01, P<0.001); ACS: (area: 0.948 vs. 0.741, respectively; u=5.47, P<0.001); non-ACS: (area: 0.826 vs. 0.661, respectively; u=3.52, P<0.001)].
Conclusion: (1) Ox-LDL autoantibodies against ox-LDL were isolated from healthy subjects. We developed a new ELISA for ox-LDL by using human antibodies, which accurately reflect the state of LDL oxidation in vivo. (2)The changes in structure and biological properties of LDL that caused by oxidative modification provided foundation for searching a stable reference material. (3) Elevated levels of ox-LDL were associated with the presence and extent of coronary heart disease, especially clinically expressed in ACS. (4) Both of ELISAs for ox-LDL may be useful for the identification of patients with CHD. ROC analysis confirmed performance of ELISA using polyclonal antibody was superior to that for ELISA using autoantibody.
Key words: low density lipoprotein; Arteriosclerosis; Autoantibody; ELISA; oxidation
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主要英文缩写词简表
英文缩写
全称
中文全称 动脉粥样硬化 乳糜微粒 极低密度脂蛋白 高密度脂蛋白
As Atherosclerosis CM chylomicron VLDL HDL
very low density lipoprotein high density lipoprotein
LDL low density lipoprotein 低密度脂蛋白 ox-LDL
oxidized low density lipoprotein
氧化低密度脂蛋白 载脂蛋白B 酶联免疫吸附测定
apoB apolipoprotein B ELISA
enzyme-linked immunosorbent assay
HRP horseradish peroxidase 辣根过氧化物酶 CHOL cholesterol TC total cholesterol TG triglyceride TBA thiobarbituric acid MDA malondialdehyde
胆固醇 总胆固醇 甘油三酯 硫代巴比妥酸 丙二醛
BHT butylated hydroxytoluene 二叔丁对甲酚 TBARS
thiobarbituric acid-reactive substances
硫代巴比妥酸反应物质 共轭双烯
急性冠状动脉综合征
CD conjugated dienes ACS
acute coronary syndrome
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学位论文独创性声明
本人郑重声明：
1、坚持以“求实、创新”的科学精神从事研究工作。
2、本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作和取得的研究成果。
3、本论文中除引文外，所有实验、数据和有关材料均是真实的。 4、本论文中除引文和致谢的内容外，不包含其他人或其它机构已经发表或撰写过的研究成果。
5、其他同志对本研究所做的贡献均已在论文中作了声明并表示了谢意。
作者签名： 日 期：
学位论文使用授权声明
本人完全了解南京师范大学有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电子版和纸质版；有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆被查阅；有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索；有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在解密后适用本规定。
作者签名： 日 期：
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材料和试剂
主要仪器设备
仪器名称 超速离心机 分光光度计 离心机 分析天平 热恒温水温箱 电泳槽 电泳仪 平板摇床 酶联免疫检测仪 自动生化分析仪 96孔酶标微孔板 自动部分收集器 电子分析天平
型号
Optima L90K 转头70Ti Model U-2001 Z160M
LIBROR EB-330H S648 DYCP-31D DYY 111 TY-80S Model-550 7600
生产厂家 BECKMAN HITACHI HERMLE SHIMADZU
上海电工医疗器械厂 北京市六一仪器厂 北京市六一仪器厂 南京大学 BIO-RAD 日立 Corning
上海琪特分析仪器有限公司中国轻工业机械总公司
BSZ-160-LCD DF-110
化学试剂
试剂名称 健康人血清 羊抗人IgG 新生牛血清 Sepharose 4B
1,1,3,3-tetramethoxypropane Thibarbituric Acid
Folin-Ciocalteu’s phenol reagent Butylated Hydroxytoluene(BHT)
产地
南京军区南京总医院门诊收集
南京军区南京总医院实验动物中心提供 杭州四季青生物工程材料有限公司 Sigma Sigma 上海试剂二厂 Sigma
上海凌峰化学试剂厂
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使用溶液配制 （1）NaCl洗脱液
NaCl 8.766g EDTA·2H2O 1.2737g NaN3 1g 蒸馏水 1000mL （2）PBS
NaCl 8.0 g KCl 0.2 g Na2HPO4·H2O 2.9 g KH2PO4 0. 2 g
倒入盛有蒸馏水的烧杯中，玻璃棒搅动，充分溶解，然后把溶液倒入容量瓶中准确定容至1000mL，摇匀即成新配制的PBS溶液。 （3）碱性磷酸钾缓冲液
K3PO4·3H2O 177.31g K2HPO4·3H2O 76.23g 蒸馏水 200mL
搅拌混匀，于56℃水浴中使之溶解。用浓磷酸(约11mL)调pH至11.2；4 ℃放置24h使其老化后使用。 （4）0.1mol/L，pH 8.5 NaHCO3溶液
NaHCO3 14.51g
NaCl 58.45g 蒸馏水 2000mL （5）1.0 mol/L，pH 8.0乙醇胺溶液
取乙醇胺30.24mL，加蒸馏水400mL。混匀后加入HCl(10－20mL)，调pH至8.0，补足蒸馏水至500mL。 （6）0.1mol/L，pH 4.0 醋酸盐缓冲液(含0.5mol/L NaCl)
NaAc·3H2O 1.225g 冰醋酸 2.349mL
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蒸馏水 500mL
（7）0.1mol/L，pH 8.0 硼酸盐缓冲液(含0.5mol/L NaCl)
硼砂 1.144g 硼酸 1.732g NaCl 5.85g 蒸馏水 200mL （8）3mol/L，pH 6.1 KCNS溶液
KCNS 291.54g 蒸馏水 1000mL （9）包被液：0.05mol/L pH 9.6 碳酸缓冲液，4℃保存。
Na2CO3 0.16g NaHCO3 0.29g 蒸馏水 100mL （10）洗涤液
NaCl 8.0 g KCl 0.2 g Na2HPO4·H2O 2.9 g KH2PO4 0. 2 g Tween-20 0.5mL
倒入盛有蒸馏水的烧杯中，玻璃棒搅动，充分溶解，然后把溶液倒入容量瓶中准确定容至1000mL，摇匀即成新配制的洗涤液。 （11）封闭液
含10%小牛血清的洗涤液。 （12）稀释液
含5%小牛血清的洗涤液。
（13）底物溶液：pH 5.0磷酸盐-柠檬酸缓冲液。
0.1M柠檬酸；柠檬酸19.2g加水至1000mL
0.2M Na2HPO4： 28.4g (Na2HPO4·12H2O 71.7g)加水至1000mL，取0.1M柠檬酸48.6mL，Na2HPO4 51.4g混合。
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3%H2O2；30% H2O2稀释10倍。
底物溶液；取邻苯二胺(OPD)2mg溶于5mLPBS液中，临用前加入3%H2O2 75ul。 （14）终止液
2mol/L H2SO4：取浓硫酸22.2mL加水至177.8mL。 （15）显色液
A液(1000mL)：Na2HPO4.12H2O 18.41g (无水7.3g)，柠檬酸5.1g ，加去离子水至1000mL，煮沸冷却后，加过氧化尿素0.6g(低浓度为0.6 g/L)，分装每小瓶5.5mL。
B液(1000mL)：EDTA Na2 0.146g，柠檬酸1.05g，加去离子水至1000mL，90℃溶解，自然冷却至室温后逐滴加入二甲亚砜溶解的TMB250mg(二甲亚砜5mL溶解)，分装每小瓶5.5mL。 （16）Lowry试剂
Lowry试剂A：Na2CO3100g溶于0.5mol/L NaOH至1000mL。 Lowry试剂B：称CuSO4·5H2O 1g溶于蒸馏水中至100mL 。 Lowry试剂C：称酒石酸钾2g溶于蒸馏水至100mL。 ABC混合液：取A 15mL+B 0.75mL+C 0.75mL混合均匀。 （17）0.67%硫代巴比妥酸
Na2SO4 蒸馏水
28.4 g
100mL
0.67g硫代巴比妥酸溶于100mL 2mol/L Na2SO4溶液中。
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综 述
氧化低密度脂蛋白检测
低密度脂蛋白
脂蛋白是由脂质和蛋白质组成的复合物。由于二者是由疏水键相互作用而结合在一起，因此脂蛋白的物理特性与其所含的脂质组成和蛋白质性质密切相关。根据脂蛋白颗粒的大小及其密度分类，可把血浆脂蛋白分成四大族：乳糜微粒(CM)、极低密度脂蛋白(VLDL)、低密度脂蛋白(LDL)以及高密度脂蛋白(HDL)。其中LDL起到胆固醇的携带和运输作用。
血浆LDL密度为1.019-1.063g/ml，由具不同的分子结构、理化特性、动力学行为及来源的颗粒组成。LDL内含apoB 20%~25%，磷脂约22%，胆固醇8%，甘油三酯8%。主要的磷脂为磷脂酰胆碱，占磷脂总量的65%，鞘磷脂占25%，其它磷脂占10%。它的主要载脂蛋白是apoB100。ApoB含有3%~4%的糖类，包括半乳糖、甘露糖、葡萄糖、葡萄糖胺和唾液酸，糖类分布在LDL颗粒表面。
氧化低密度脂蛋白
天然的LDL经氧化、修饰为氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein, ox-LDL)。脂肪酸位于LDL的核心，其中含有大量不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids, PUFAs)，约占LDL总脂肪酸含量的35%～70%，它在自由基或其他氧化剂的作用下，生成脂类自由基，并能产生更多的脂质氢过氧化物，引起连锁的自由基链式反应，最终生成多种反应性的醛。这些化学性质活泼的醛和apoB发生结合，产生新的抗原决定簇，形成ox-LDL。
LDL经氧化修饰包括：与脂氧化酶、超氧阴离子、羟自由基、亚硝酸盐、血红蛋白、铜蓝蛋白、髓过氧化物酶和次氯酸盐发生的反应，以及过渡金属、细胞介导的作用等，可导致脂质过氧化程度增高及蛋白质成分的变化、负电荷增加、电泳迁移率加快，同时产生新的抗原决定簇，更易于被巨噬细胞摄取和降解，引起胆固醇酯的蓄积，转变为泡沫细胞。Ox-LDL除经清道夫受体途径被清除外，还可被巨噬细胞所吞噬摄取。Ox-LDL同时刺激单核细胞合成、分泌黏附分子，促进单核细胞聚集、黏附至血管内膜上，进而转化为巨噬细胞。Ox-LDL还可刺
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激氧自由基的产生，损伤血管内膜的通透性。上述因素均可促进As的发生和发展。
LDL的氧化过程是一种氧自由基的链式连锁反应，可以分为三个阶段，分别为迟滞阶段、增殖阶段和分解阶段：
(1) 迟滞阶段：氧自由基消耗LDL中的内源性抗氧化物(维生素E、β-胡萝卜素)，LDL抗氧化活性丧失。
(2) 增殖阶段：氧自由基攻击LDL中PUFAs上的双键，使之发生断裂，先形成不饱和脂肪酸自由基(R•)，再氧化成脂过氧基(ROO•)，最后生成脂质氢过氧化物(ROOH)。而脂质氢过氧化物还可以与另外不饱和脂肪酸自由基(R•)分子连锁循环反应下去，使脂质不断恶性循环氧化，生成大量的过氧化脂质。
(3) 分解阶段：过氧化脂质进一步分解的产物是活跃的反应性醛类物质，这些醛类包括丙二醛(malondialdehyde, MDA)、4-羟烯酸(4-HNE)等，MDA和4-HNE可以和apoB发生交联共价结合(主要和apoB的赖氨酸残基结合)，产生了新的抗原决定簇。
动脉粥样硬化
动脉粥样硬化(Atherosclerosis，As)是指动脉内膜的脂质、血液成分的沉积，平滑肌细胞及胶原纤维增生，伴有坏死及钙化等不同程度病变的一类慢性进行性病理过程。它是心脑血管系统中最常见的疾病之一，严重危害人类健康。As主要表现为：细胞内外脂类的积聚，单核细胞/吞噬细胞的浸润，泡沫细胞的形成，血管平滑肌细胞增生以及结缔组织成分积聚。As早期，单核细胞首先粘附于血管内皮，然后迁移至内皮下分化为巨噬细胞，后者主要通过清道夫受体无节制地吞噬大量脂质，形成泡沫细胞，进而堆积成As斑块[1]。病理上，内皮炎症、ox–LDL在血管内膜中堆积，对单核细胞的增生与泡沫细胞的形成起有一定的作用。
As性心脑血管疾病已逐渐成为我国城乡居民的第一位死因，脂代谢异常是最重要的致病因素之一[2]。在过去的50年中，流行病学研究发现，As的病因非常复杂，它是遗传、环境和年龄、性别等多种因素相互作用的结果，详细地发病机制至今未完全明确。目前学术界对As公认的观点是：As是一种慢性炎症疾病，是一种与基因相关的疾病，其表现是在动脉及其分支的动脉壁内膜及内膜下有脂质沉着(主要是胆固醇及胆固醇脂) [3-7]，同时伴有中层平滑肌移行至内膜下增殖，
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使内膜增厚，形成黄色或灰黄色如粥样物质的斑块。As是一种脂质与炎性细胞的聚积并伴随着平滑肌细胞增生于细胞外间液分泌所引起的细胞内膜纤维变性。虽然这种阻塞性的血管疾病存在是造成死亡及残废的主要原因，但我们对此疾病发生的原因仍然知道有限[8-13]。该种病变是多因素共同作用的结果，病变起始于平滑肌细胞、巨噬细胞及T淋巴细胞的聚集；其次是包括胶原、弹性纤维及蛋白质多糖等结缔组织基质和平滑肌细胞的增生；第三是脂质，其中主要含胆固醇结晶及游离胆固醇和结缔组织。粥样硬化斑块中脂质及结缔组织的含量决定斑块的稳定性以及是否易导致急性缺血事件发生。在As形成的多种病因中，脂蛋白代谢紊乱是一个极其重要的因素，氧化修饰脂蛋白起着关键作用，是当今国内外基础和临床医学研究的共同热点。
Ox-LDL在As中的作用
Ox-LDL是As发生的强危险指标，与冠心病发生、程度密切相关。ox-LDL可导致巨噬细胞转变为泡沫细胞；在As斑块中也发现ox-LDL存在。Ox-LDL免疫原性发生改变，在体内也能产生自身抗体，进而与ox-LDL结合形成IC。Ox-LDL通过清道夫受体途径被巨噬细胞摄入，促进胆固醇酯的堆积和泡沫细胞的形成，释放出多种细胞因子，如白细胞介素-1(IL-1)、肿瘤坏死因子(TNF)、基质金属蛋白酶-1(MMP-1)、氧自由基等，进而破坏血管内皮细胞，诱导平滑肌细胞增殖，进一步加速As进程。
1 促进单核细胞粘附和泡沫细胞的产生
单核细胞对动脉内皮粘附的增多是实验动物As的早期表现之一。ox-LDL可以通过刺激细胞间粘附分子-1(ICAM-1)表达，使单核细胞、中性白细胞和淋巴细胞与内皮结合的数量增多。还可以刺激内皮白细胞粘附分子-1(ECAM-1)表达，促进单核细胞核、T淋巴细胞相互作用；刺激血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)表达，导致单核细胞的粘附和移行，随后移行入内膜。
Ox-LDL可激活内皮细胞上一系列细胞因子的表达，促使单核细胞分化为巨噬细胞，并进而刺激巨噬细胞的增生和分化，同时诱导巨噬细胞表面清道夫受体的表达，使ox-LDL摄取增多，巨噬细胞泡沫化。
2 诱导产生平滑肌细胞源性泡沫细胞
Ox-LDL通过诱导巨噬细胞和平滑肌细胞产生血小板源生长因子，促**滑
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肌细胞移行。通过诱导内皮细胞产生碱性成纤维细胞生长因子，促**滑肌细胞增生。最终，ox-LDL诱导平滑肌细胞表面清道夫受体的表达，导致其内吞ox-LDL，继而产生平滑肌细胞源性泡沫细胞。
3 促进血栓形成
Ox-LDL损伤动脉壁正常的舒张功能，诱使血管收缩。它还可以使血小板聚集，引起血管痉挛和血栓形成。
4 损伤内皮细胞
内皮细胞是As危险因素作用的重要靶细胞，而内皮细胞功能障碍是As形成的早期病理改变，参与As发生发展的全过程。内皮下泡沫细胞的堆积在As发生中起关键作用。
LDL氧化过程中产生的脂质氢过氧化物可以直接损伤内皮细胞。LDL聚集于动脉内膜，也可损伤内皮细胞，使血管壁通透性增加，LDL经受体或非受体途径进入内皮细胞，抵达内皮下，与介质成分(如胶原、糖蛋白等)形成复合物，被巨噬细胞吞噬，并发生胆固醇酯化，形成泡沫细胞，导致As形成。
Ox-LDL与冠心病
冠心病的主要病理基础是As[14]，脂质紊乱是其发生发展的一个重要原因。近年来研究显示，ox-LDL促进As的发生发展，与冠心病发生、程度密切相关。有研究表明，冠心病患者血浆ox-LDL水平较健康对照组显著升高，且与疾病的临床程度相关；急性冠脉综合征(acute coronary syndrome, ACS)患者外周血ox-LDL水平升高，可能与As斑块的不稳定性有关。
LDL修饰的第一步最可能的是LDL进入内皮细胞下，推测少量修饰后的LDL返流回外周血，转移的特异位点可同LDL等脂蛋白接收体结合，因此，可在血循环中测出低浓度的修饰LDL。对不稳定冠心病患者血浆中分离的ox-LDL和As斑块中ox-LDL特性进行分析显示，两者电泳迁移率，赖氨酸残基和不饱和脂肪酸含量均一致，表明血浆中至少有少量ox-LDL(重度氧化)直接来源于不稳定硬化斑块的释放。Ox-LDL中特异位点可源于破裂的、或有渗透性的As斑块，以及缺血损伤的细胞膜的直接释放；甚至来源于非As的炎症反应。最终这些转移的特异位点同诸如LDL等脂蛋白接受体结合(主要为轻微氧化的LDL)。上述机制至少在ACS患者中都是可能存在的。另外，巨噬细胞、淋巴细胞、嗜
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中性粒细胞对LDL具氧化修饰作用，在急性心肌梗死患者的硬化斑块破裂、不稳定及坏死处大量聚集，也可导致血浆ox-LDL水平增加。在较稳定的患者中，高ox-LDL水平可能反映动脉中新形成的、或斑块进一步损伤处ox-LDL的更新代谢。冠心病患者动脉中含有大量的ox-LDL，LDL在此环境中更易氧化，同时也潜伏着As发生的高风险。血浆MM-LDL较重度氧化LDL清除速率较慢，可进一步转变为中度氧化的LDL。
Ox-LDL水平检测
目前ox-LDL水平测定的方法学没有标准化，限制了临床应用。临床上一般采用特异性单克隆或多克隆ox-LDL抗体建立的酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)检测。Ehara等[14]应用单克隆抗体建立ELISA法测定不同冠心病患者血浆ox-LDL水平，结果示冠心病患者血浆ox-LDL水平较健康对照组显著升高，且与疾病的临床程度相关；急性心梗患者(acute myocardial infarction, AMI) ox-LDL水平最高，不稳定冠心病患者ox-LDL水平较稳定冠心病患者高。因此认为尽管单独测定ox-LDL水平不足以用来衡量患者个体冠心病发生危险性，但结合其他的血脂、炎症指标可用于评估冠心病发生的危险性及As斑块稳定性。
Ox-LDL存在多种氧化位点，具体检测何种ox-LDL位点对临床更有价值尚不明确。有多种ox-LDL抗体可用于检测ox-LDL水平：如4E6针对MDA修饰LDL(MDA-LDL)，DLH3针对氧化磷酸卵磷酯(ox-PC)，E06针对氧化磷脂(ox-PLs)。采用针对不同抗原位点的抗体建立的ELISA检测法结果间差别很大，缺乏可比性。同时由于不同实验室所采用的参考品来源不一，氧化的程度不同等进一步导致结果间不一。鉴于从混合人血清中提取的自身抗体能准确、如实地反映体内ox-LDL存在的抗原位点，采用自身抗体建立的氧化脂蛋白检测方法可能更准确、真实地反映体内LDL的氧化状况，因此更具有临床应用价值。
展望
对于As的发病机制研究和临床治疗探讨，一直都是学术界的热门领域。脂质氧化理论的出现，极大地丰富和完善了As的理论体系。人体内存在ox-LDL，氧化修饰导致LDL结构和生物特性显著改变。Ox-LDL促进泡沫细胞的形成，
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对动脉粥硬化的发生发展起到重要作用。尽管有关LDL氧化的机理尚未完全明确，但已经为As的研究提供了新思路和新方向。
在临床检测方面，目前的问题是检测何种ox-LDL位点对临床更有价值，有必要进行大规模的临床研究。在进行大规模的临床跟踪研究中，系统地分析针对不同ox-LDL位点的自身抗体，LDL循环免疫复合物，及ox-LDL本身不同位点；并同其它脂质过氧化、炎症反应指标进行对比研究，正确评价ox-LDL在As中的作用；血浆ox-LDL水平有望成为As危险性的新的预测指标，尤其是结合相关指标作为ACS的标志物。
同时，如何控制好测定中用的ox-LDL参考品的氧化形式、程度，一致性和稳定性等均是该领域急待解决的问题。因此，建立氧化脂蛋白水平检测的参考、常规测定方法，研制参考物质，并进行系列标准化研究尤为必要，目前国内外该领域还是空白，具有广阔的研究前景。
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第一部分 人体内氧化低密度脂蛋白自身抗
体提取及鉴定
氧化修饰脂蛋白在As发生、发展中起着重要作用。血浆ox-LDL及其自身抗体水平是预测As性心血管疾病发生的有力指标[16-18]。人体内的ox-LDL除经清道夫受体途径被巨噬细胞吞噬外，还可与其自身抗体结合，形成循环免疫复合物(IC)，诱导巨噬细胞内胆固醇酯堆积转化为泡沫细胞，同时释放多种细胞因子，如白细胞介素-1(IL-1)、肿瘤坏死因子(TNF)、基质金属蛋白酶-1(MMP-1)、氧自由基等，进而破坏血管内皮细胞，诱导平滑肌细胞增殖，进一步加速As进程[19,20]。有研究表明，人血管壁的As斑块和外周血中均存在ox-LDL；且体内同时存在氧化修饰LDL自身抗体，其水平高低亦是As发生的预测指标[21,22]。从混合人血清中提取的自身抗体能准确、如实地反映体内ox-LDL存在的抗原位点，采用自身抗体建立的氧化脂蛋白检测方法能更准确、真实地反映体内LDL的氧化状况，从而建立更特异、准确的ox-LDL测定方法。本文从人血清中提取ox-LDL自身抗体并对其特性进行鉴定。
1.1 实验方法
1.1.1 LDL的提取
本实验采取超速离心的方法从人混合血清中提取LDL。超速离心法是根据血浆中各种脂蛋白比重(密度)的差异，在强大离心力作用下进行分离纯化的一种方法。本实验操作方法是将血清置于给定不同密度盐溶媒介中，在离心力作用下，各脂蛋白依其自身密度分散于离心管中的相应的密度层，从而达到分离纯化的目的。
血浆LDL是密度为1.019-1.063g/mL，由具不同的分子结构、理化特性、动力学行为及来源的颗粒组成。为了使提取的LDL尽量纯，我们选取1.025~1.045g/mL密度范围。
(1) 取人空腹混合血清200mL，加入EDTA(终浓度1mmol/L)和BHT
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(butylated hydroxytoluene)(终浓度40μmol/L)。
(2) 测血清密度：用5mL移液管移取4mL水，称重共3次，求平均值D水(三
次称量数值误差应尽可能小)；用同一移液管移取4mL血清，称量3次，求其平均值D血清；计算血清密度Di=D血清/D水。
(3) 调血清密度：加入KBr，调整血清密度为1.025g/mL。加入的KBr量按
照以下公式计算：
KBr(g)=V(D目－D实)/(1-0.312×D目) 其中：V—血清体积 D目—目标密度
D实—实际测得的血清密度
(4) 超速离心，条件：4℃， 48000r/min，24h，离心后弃去顶层密度<1.025g/mL
部分。
(5) 剩余液体用KBr调密度至1.045g/mL，4℃， 48000r/min离心24h。小心
吸取顶层溶液，此液密度为1.025-1.045g/mL的富含LDL部分。 (6) 用PBS(含1 mmol/L EDTA，1 mg/mL NaN3)透析24h，离心去沉淀，上
液即为透明清晰的LDL提取液。
1.1.2 蛋白定量
采用Lowry蛋白质定量法(微量法)。蛋白标准为牛血清白蛋白，浓度是1mg/mL。本文中所用的的浓度均以蛋白浓度为准。
(1) 取待测样品和蛋白标准各0.05 mL，分别加去离子水0.45 mL、ABC混合
剂0.5 mL，空白对照取去离子水和ABC混合剂各0.5mL混合。上述溶液混合后放置室温15min，加酚试剂(Folin-Ciocalteu's phenol reagent)1.5 mL，然后置室温45min。
(2) 测波长660nm下的吸光度值，空白调零。 (3) 浓度计算
C＝C样品/C蛋白标准(mg/mL)
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1.1.3 脂蛋白氧化
(1) LDL经pH 7.4，0.01mol/L PBS充分透析，总蛋白浓度定量为0.5 mg/L。 (2) 加入CuSO4至终浓度40μmol/L，37℃孵育20h。
(3) 用pH 7.4，0.01mol/L PBS(含1mmol/L EDTA、40μmol/L BHT)充分透析
以终止其氧化。
1.1.4 亲和层析柱的制备[23]
(1) 取适量的琼脂糖凝胶Sepharose 4B置于烧杯内，用蒸馏水洗三次，置于
布氏漏斗内减压抽滤。抽干后Sepharose 4B的压积约30 mL，在冰块的环境下加入等体积的5mol/L. pH 11.2冷的碱性磷酸钾溶液。
(2) 在通风中，取2gCNBr，加入2 mL的二甲基亚砜进行溶解，将溶液加入
Sepharose 4B中，并在梯度混匀器上振荡7min。
(3) 活化完毕后，立即将溶液置于布氏漏斗内减压抽滤，并用10倍体积的
NaHCO3溶液(0.1mol/L pH 8.5 含0.5mol/L NaCL)洗，抽干后再用一倍体积的该溶液洗，抽干。
(4) 取适量的活化后的Sepharose 4B置于小烧杯内，并加入一定量的
ox-LDL，放在梯度混匀器上反应2h，后置4℃冰箱24h，以完成偶联。 (5) 将完成偶联的Sepharose 4B装入输液器的针筒内，柱的压积约10 mL，
用蒸馏水洗涤几次，再用甘氨酸(0.2mol/L pH 8.0)进行冲洗，冲洗量约为其压积，最后注入少量的甘氨酸，关闭流出口，室温下封闭2h，之后分别用NaHCO3缓冲液(0.1mol/L pH 8.3 含0.5mol/L NaCL)及醋酸盐缓冲液(0.5mol/L pH 4.0 含0.5mol/L NaCl)循环洗3次，之后用含有200umol/L EDTA-Na2的PBS缓冲液进行冲洗，最后用NaHCO3平衡液(0.01mol/L pH 8.3)冲洗，留取适量液体于柱上，用膜封住管口，放入4℃冰箱保存。
1.1.5 自身抗体的提取[24]
(1) 将健康人混合血清20 mL，循环冲洗ox-LDL层析柱，最后留取适量于
柱上，置于4℃冰箱内过夜。
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(2) 用NaHCO3平衡液(0.01mol/L pH 8.3)冲洗层析柱，直至流出液在280nm
波长下吸光度等于0为止。
(3) 充分洗涤后，依次用NaHCO3溶液(0.1mol/L，pH8.3，含0.5mol/L NaCl)、
醋酸盐溶液(0.5mol/L，pH 4.0，含0.5mol/L NaCl)和KCNS溶液(3mol/L pH 6.1)洗脱，收集洗脱峰。
(4) 在280nm波长下测量收集的洗脱液，记录吸光度。分别从缓冲液洗脱流
出液及KCNS溶液洗脱液中选取吸光度高的收集进透析袋，浓缩透析至1 mL左右，Lowry法测定蛋白量。
1.1.6 自身抗体的鉴定
(1) 包被：取1 mg/mL ox-LDL 100ul与10mL包被液充分混匀，酶标板每孔
加100ul，置37度水浴箱2h后取出置4度冰箱过夜。
(2) 封闭：取出，弃包被液，用PBS洗涤三次，每次1min，甩干。用10%
的小牛血清(含Tween-20)每孔加100ul，置于37度水浴箱1h，以完成封闭。
(3) 加样：取出，弃封闭液，洗涤，甩干。分别加入ox-LDL中和反应前、
后的待测抗体100µl (中和前：150µl蛋白浓度为0.12 mg/mL的待测抗体中加入15µl PBS；中和后：150µl待测抗体中加入15µl蛋白浓度为1mg/mL的氧化脂蛋白，37℃作用2h，3000r/min离心后取上清)，每管同时做一个复管，置37度水浴箱2h。
(4) 取出，洗涤，甩干。加入由5%小牛血清的稀释液3000倍稀释的HRP
羊抗人IgG，每孔100ul，置于37度水浴箱2h。
(5) 取出，弃酶标液，洗涤，甩干。分别依次加入显色剂A和B，每样加一
滴，显色10min，每孔加100ul终止液以终止反应，450nm波长测定吸光度值。以中和前、后吸光度值的下降百分比表示抗体的免疫反应性。采用散射免疫比浊法测定自身抗体种类。
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1.1.7 数据分析
数据以均数±标准差(x±s) 表示，变量间的比较用t检验，P<0.05为有统计学差异。
1.2 实验结果
1.2.1 Ox-LDL自身抗体的提取
NaHCO3溶液(0.1mol/L，pH 8.3，含0.5mol/L NaCl)、醋酸盐溶液(0.5mol/L，pH 4.0，含0.5mol/L NaCl)和KCNS溶液(3mol/L pH 6.1)洗脱后均有蛋白峰(分别为1、2、3峰，图1.1)，其中KCNS溶液洗脱峰A(280nm)值最高。
图1.1 解吸液的蛋白质洗脱峰
1.2.2 Ox-LDL自身抗体的鉴定
由于NaHCO3溶液和醋酸盐溶液的洗脱峰蛋白含量较低，将两峰合并，同KCNS溶液洗脱峰分别进行ox-LDL自身抗体的鉴定。8份正常人血清中均存在抗ox-LDL自身抗体，各收集峰与ox-LDL均具有良好的反应性，KCNS洗脱峰的反应性较强(表1.1)。免疫比浊法显示自身抗体以IgG为主，同时含有IgM，两者蛋白质构成比为10：3，未检测到IgA。
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表1.1 Ox-LDL自身抗体的免疫反应性
样本 第1、2峰A(450nm) 中和前
中和后
下降(%)
第3峰A(450nm) 中和前
中和后
下降(%)
1 1.17 0.91 22.2 2 1.08 0.68 37.0 3 1.01 0.78 22.8 4 1.08 0.86 20.4 5 0.95 0.88 7.4 6 1.39 1.07 23.0 7 1.36 1.01 25.7 8 1.24 1.05 15.3 合计
1.16±0.16
0.91±0.14
21.7±8.5
1.30 0.98 24.6 1.20 0.57 52.5 1.23 1.01 17.9 1.08 0.63 41.7 1.04 0.62 40.4 1.12 0.67 40.2 0.92 0.59 35.9 0.99 0.72 27.3
1.11±0.13
0.72±0.17 35.0±11.1
*
*
*: 与第1、2峰比较, P<0.05
1.3 讨论
As性心脑血管疾病是危害人类健康最严重的疾病之一，流行病学和临床研究表明，LDL被氧化在As发生中起着重要作用。LDL最可能是进入血管内皮细胞下开始被氧化，推测少量修饰后的LDL返流回外周血；或转移的氧化特异位点可同LDL等脂蛋白接收体结合，因此，可在血循环中测出低浓度的修饰LDL；一般认为血循环中不存在“完全氧化的LDL”。 LDL被氧化后免疫原性发生改变，诱导机体产生自身抗体，与之结合形成LDL循环免疫复合物(LDL-IC)，其水平的高低是As发生的强预测指标。
本研究采用溴化氰活化的琼脂糖凝胶Sepharose 4B交联ox-LDL制备免疫吸附层析柱，经NaHCO3溶液、醋酸盐溶液和KCNS溶液解吸，从正常人血清中提取抗ox-LDL自身抗体。Marina等[25]首先采用低离子强度的NaHCO3溶液洗脱低亲和力的抗ox-LDL自身抗体，再采用含0.5mol/L NaCl的醋酸盐溶液解离高亲和力抗体，分别收集到两种自身抗体的洗脱峰。我们在此基础上进一步用KCNS溶液解离，其洗脱峰值最高，明显提高了效率。可见，人血清中ox-LDL
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自身抗体的亲和力大小不一。我们对自身抗体种类进行分析，结果示，以IgG为主，同时含有IgM，未检测到IgA。文献亦报道此自身抗体种类中以IgG为主，其次为IgM，部分人群中还含有IgA。而IgG抗体中又以IgG1和IgG3为主，这可能是此抗体亲和力大小不一的原因。
我们用包被的ox-LDL鉴定提取的自身抗体反应性，结果显示8份正常人血清中均存在ox-LDL的自身抗体，且各收集峰同ox-LDL均具有良好的反应性，其中KCNS洗脱峰的抗体反应性最强。
在人血清ox-LDL测定的临床研究中一般采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测，但不同来源抗体针对的氧化位点不同，导致结果间差异。本文提取的ox-LDL自身抗体初步实验显示可作为包被抗体，结合酶标记的抗apoB用于检测体内ox-LDL，也可与ox-LDL结合制备人源的LDL-IC。在确认人血清中存在ox-LDL自身抗体的同时，可用于今后进行相关研究。鉴于自身抗体能更准确、如实地反映体内ox-LDL存在的抗原位点，采用自身抗体建立的氧化脂蛋白检测方法可能更准确、真实地反映体内LDL的氧化状况。
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第二部分 氧化低密度脂蛋白ELISA检测法
临床研究证实ox-LDL水平高低是As发生的强危险指标，可评估冠心病发生的危险性、程度及As斑块稳定性，但目前方法学没有标准化，限制了临床应用。一般采用特异性单克隆或多克隆抗体建立的ELISA检测，但ox-LDL存在多个氧化位点，检测何种氧化位点对临床更有价值尚无定论。针对不同抗原位点的抗体建立的ELISA检测法间结果差别很大，缺乏可比性；如何控制好测定中用的ox-LDL参考品的氧化程度、来源的一致性、稳定性等均是该领域急待解决的问题。据此，本文分别制备了针对ox-LDL的自身抗体和多克隆抗体，并建立了ELISA检测法。
2.1 实验方法
2.1.1 Ox-LDL自身抗体、多克隆抗体的制备
自身抗体的制备：参照第一部分。
多克隆抗体的制备：采用ox-LDL常法免疫家兔，制备抗体。抗血清经交联天然LDL的琼脂糖凝胶Sepharose 4B层析柱充分吸附。
2.1.2 脂蛋白的氧化、修饰
Ox-LDL的制备：见第一部分。 MDA-LDL的制备：
(1) 取1,1,3,3-tetramethoxypropane 0.165ml与0.2ml浓盐酸混匀1分钟，加蒸
馏水至7ml左右，用1N NaOH约2ml调PH 7.0，终体积约为9.5ml，标记为MDA。
(2) 将2μl MDA稀释7000倍，取0.5ml加入1ml 10％的三氯乙酸和1ml 0.67
％硫代巴比妥酸，混合均匀，沸水浴10min，535nm波长下测定吸光度。 (3) MDA的浓度计算：
CMDA(mol/L)＝A×5×7000/149000
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(4) 经PBS充分透析的LDL，总蛋白浓度定量为0.5 mg/L。加入MDA至终
浓度30mmol/L，37℃孵育20h。用pH 7.4，0.01mol/L PBS(含1mmol/L EDTA、40μmol/L BHT)充分透析。
2.1.3 采用自身抗体和多克隆抗体建立ELISA法
(1) 包被
分别将自身抗体(浓度0.865 mg/mL)、多克隆抗体(浓度0.694 mg/mL)用包被液稀释后包被反应板，37℃水浴 2h后，放4℃冰箱过夜。 (2) 封闭
洗涤3次后(每次1min，下同)，反应板孔中分别加入10%小牛血清的PBS稀释液，37℃ 水浴1h，洗涤3次。 (3) 加入样本
每孔分别加入稀释(含5%小牛血清PBS)样品(Cu2+氧化的ox-LDL、MDA修饰的MDA-LDL)、空白各100ul，37℃ 水浴2h，洗涤3次。 (4) 加入酶标抗体
每孔加稀释后HRP标记的抗apoB酶标抗体(含5%小牛血清的PBS稀释液)100ul，37℃水浴2h，洗涤3次。抗apoB与天然LDL、ox-LDL、MDA-LDL均具有免疫反应性。 (5) 显色
37℃水浴10min，避光。 (6) 测定
2mol/L H2SO4每孔加100ul终止反应，最后用酶联仪(波长450nm)测值，记录。
2.1.4 数据分析
数据以均数±标准差(x±s) 表示，数据处理用Statistics软件。各变量间的差别用非参数Mann-Whitney U-test分析；变量间相关性用非参数Spearman rank coefficient test分析。
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2.2 实验结果
2.2.1 实验条件
上述包被抗体、酶标抗体浓度，稀释液及反应时间等均由方阵滴法确定。 Ox-LDL自身抗体ELISA法：包被浓度为1.04 mg/L，标准血清40倍起稀释，酶标抗体1：400倍稀释，显色时间为10min。
Ox-LDL多克隆抗体ELISA法：包被浓度为1.25 mg/L，标准血清40倍起稀释，酶标抗体1：600倍稀释，显色时间为10min。
2.2.2 方法评价
特异性：ox-LDL自身抗体和多克隆抗体的ELISA法的反应曲线显示：均同ox-LDL具有极强的免疫反应性，而同天然、MDA修饰的LDL具极低的免疫反应能力(图2.1, 图2.2)。
图 2.1 采用ox-LDL多克隆抗体的ELISA法反应曲线
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图 2.2 采用ox-LDL自身抗体的ELISA法反应曲线
精密度：取不同浓度4份样品，分别测定20次。自身抗体和多克隆抗体测定法平均批内变异(CV)分别为 6.5%和6.1%，平均批间变异分别为9.1%和 9.7%。
准确性：在已知浓度的血清样品中，加入高、中、低三种浓度的ox-LDL或MDA-LDL纯品，自身抗体和多克隆抗体测定法平均回收率分别为92.6%和95.1%。
检测范围：两法检测限均为：0.05～1.5mg/L；两种方法样本均稀释40倍，可检测2～60mg/L的血清ox-LDL水平。
2.3 讨论
氧化、修饰LDL水平结合其他血脂、炎症指标，可用于评估冠心病发生的危险性及As斑块稳定性。有多种抗体可用于检测ox-LDL水平，结果也不一致。Ehara等[14]报道AMI患者ox-LDL水平约占总LDL的0.25%。类似的研究报道体内ox-LDL水平从正常人的占总LDL的0.001%(DLH3单抗)[26]到AMI患者约5%(针对MDA-LDL，铜离子氧化LDL不同单抗)不等[27,28]。Holveot等[29]采用4E6单抗建立的竞争抑制ELISA法同时检测血浆中MDA-LDL和ox-LDL。4E6单抗不仅与ox-LDL反应，与MDA-LDL(每分子apoB含有大于120个赖氨酸残基)
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也发生反应。他们采用1H11单抗检测MDA-LDL，该单抗结合MDA-LDL能力较ox-LDL强100倍。结果示前者所测的ox-LDL水平较后者测出的MDA-LDL约高3倍[30]。LDL氧化产生的过氧化产物均可同apoB发生反应，因此ox-LDL颗粒上同时存在多种特异的抗原位点。我们从人体内提取了ox-LDL自身抗体，可同时识别ox-LDL上的多种抗原位点，且具强的反应性，作为包被抗体，结合酶标记的抗apoB用于检测体内ox-LDL。制备的多克隆抗体也可同时识别ox-LDL上的多种抗原位点。据此本文分别建立了ox-LDL自身抗体和多克隆抗体的ELISA检测法，方法特异、灵敏、准确，适于临床检测，同时为氧化LDL测定的标准化奠定了基础。具体检测何种ox-LDL位点对临床更有价值；同时控制好测定中用的ox-LDL参考品的氧化程度，来源的稳定性、一致性等是下一个有待解决的问题。
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第三部分 不同程度氧化、修饰对低密度脂
蛋白特性、氧化位点水平的影响
脂代谢异常是As性心脑血管疾病最重要的致病因素之一，其中氧化修饰脂蛋白起着关键作用，是当今国内外基础和临床医学研究的共同热点。临床研究证实，ox-LDL水平高低是As发生的强危险指标，可评估冠心病发生的危险性及As斑块稳定性，但目前方法学没有标准化，限制了临床应用[31-34]。Ox-LDL存在多种氧化位点，具体检测何种ox-LDL位点对临床更有价值尚不明确，因此采用针对不同抗原位点的抗体建立的ELISA检测法结果间差别很大，缺乏可比性。如何控制好测定中用的ox-LDL参考品的氧化形式、程度，一致性和稳定性等均是该领域急待解决的问题。本文采用铜离子和MDA分别对LDL进行不同程度氧化、修饰，观察硫代巴比妥酸反应物质(TBARS)、共轭双烯 (CD)、氧化位点等特性的改变，为参考品的寻找提供理论和实验依据。
3.1 实验方法
3.1.1 LDL的提取
LDL采用超速离心分离1.025~1.045 g/ml的人血浆脂蛋白组分(见 1.1.1)。
3.1.2 脂蛋白的氧化、修饰
(1) LDL经pH 7.4、0.01mol/L PBS充分透析，总蛋白浓度定量为0.5mg/L。 (2) a：LDL中分别加入0.05mol/LCuSO4溶液至Cu2+的终浓度分别为
10μmol/L、30μmol/L和60μmol/L
b：LDL中分别加入制备的MDA溶液(见2.1.2)至MDA的终浓度分别为 10mmol/L、30mmol/L和60mmol/L
(3) 37℃分别孵育3h 、5h 、6h 、7h 、8h 、9h 、10h 、12h 、14h 和18h，
3h以内每20min测定一次。
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(4) 用含1mmol/L EDTA、40μmol/L BHT，pH 7.4，0.01mol/L PBS充分透析
以终止其氧化。
3.1.3 脂蛋白氧化、修饰程度分析
(1) 取已氧化的脂蛋白0.5ml，MDA溶液1ml，沸水浴20min，于535nm波
长下测定其吸光度。
(2) 234nm波长下测定CD吸光度。
(3) 分别采用针对ox-LDL自身抗体为包被抗体，酶标记抗apoB为检测抗体
建立ELISA测定法检测氧化位点的改变。
(4) TC、TG测定用Randox公司试剂盒，BM公司cfas校准物校准；LDL-C
测定用日本一化试剂及脂蛋白校准品。
3.1.4 数据分析
数据以均数±标准差(x±s) 表示，数据处理用Statistics软件。各变量间的差别用非参数Mann-Whitney U-test分析；变量间相关性用非参数Spearman rank coefficient test分析。
3.2 实验结果
3.2.1 氧化、修饰对TBARS值的影响
MDA修饰、Cu2+氧化均导致LDL的TBARS值升高，随着反应时间的延长，TBARS值达到峰值后进入降解阶段。相同的反应时间，TBARS值随着MDA浓度的增大而增大；且MDA的浓度越大，最终的TBARS峰值越高。Cu2+浓度对LDL的TBARS值变化不明显，提示所选的Cu2+水平均足以引起LDL充分氧化。TBARS出现峰值以后，ox-LDL进入降解阶段(图 3.1)。
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图3.1 不同浓度MDA修饰LDL的TBARS变化
3.2.2 氧化、修饰对CD值的影响
脂蛋白颗粒中含有大量多聚不饱和脂肪酸(PUFAS)，脂蛋白氧化修饰时，PUFAS被氧化形成共轭双烯(CD)，在234nm处有最大吸收峰。因此，可用分光光度计检测不同时间脂蛋白氧化产生的CD量变化，以测定脂蛋白的氧化程度。 Cu2+氧化LDL导致CD吸光度值发生改变，随着氧化时间的延长，CD量不断增大直致峰值水平(图3.2)。MDA修饰过程不引起CD吸光度值的变化。
图3.2 不同浓度Cu2+氧化LDL CD值变化
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3.2.3 ELISA法检测ox-LDL水平的改变
Cu2+氧化导致ox-LDL水平升高(建立的ELISA法测定)，且随着氧化时间的增加，变化增大。采用ox-LDL自身抗体建立的 ELISA法较多克隆抗体的变化更为明显(图 3.3, 3.4)。
图3.3 采用自身抗体检测Cu氧化的LDL
2+
图3.4 采用多克隆抗体检测Cu氧化的LDL
2+
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3.2.4 脂蛋白及脂质含量的变化
Cu2+氧化时间和TG、LDL-C、apoB均呈良好的负相关性(表 3.1)；天然LDL经Cu2+氧化后各项指标均减小(表 3.2)。MDA修饰时间和LDL-C、apoB亦呈良好的负相关性 (r = -0.391, P<0.05; r = -0.457, P<0.05)；经MDA修饰反应后，LDL-C、apoB浓度均减小(图 3.5、3.6)。
表3.1 Cu氧化时间与脂蛋白、脂质水平间相关分析
变量 时间 P
TG LDL-C apoB
2+
-0.916 -0.957 -0.961
0.000 0.000 0.000
表3.2 不同浓度Cu氧化LDL后的脂蛋白及脂质水平
time
1h 0.15 0.75 0.18 0.12
10(μmol/L) 30(μmol/L) 60(μmol/L) TG LDL-C apoB TG LDL-C
0.63 0.19 0.12
0.59 0.17
apoB TG LDL-C apoB
2+
3h 0.11 0.58 0.15 0.1 0.56 0.14 0.1 0.54 0.14 6h 0.1 0.44 0.14 0.1 0.49 0.14 0.099h 0.1 0.43 0.13 0.0912h 0.08 0.36 0.1 0.0715h 0.08 0.33 0.08 0.0718h 0.08 0.28 0.04 0.0721h 0.07 0.26 0.02 0.0724h 0.07 0.23 0.02 0.06
天然LDL
0.48 0.12 0.43 0.11 0.33 0.07 0.3
0.06
0.44 0.12 0.090.32 0.08 0.070.29 0.07 0.080.27 0.04 0.070.26 0.04 0.070.27 0.04 0.071 0.21 0.16
0.29 0.05 0.31 0.05 0.29 0.05 1 0.21
0.16 1 0.21 0.16
单位：TC (mmol/L)、TG (mmol/L)、LDL-C (mmol/L)、apoB (mg/L)
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图3.5 LDL-C的浓度与MDA修饰时间的线性相关性
图3.6 apoB的浓度与MDA修饰时间的线性相关性
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3.3 讨论
LDL发生氧化有多种机制，包括细胞介导的氧化修饰、金属离子介导的氧化修饰、过氧化物酶类导致的氧化修饰等。LDL的氧化过程是一种氧自由基的链式连锁反应，可以分为三个阶段，分别为滞缓阶段、增值阶段和分解阶段。LDL氧化的滞缓阶段抗氧化剂开始消耗，当抗氧化剂耗尽以后，LDL中含有的大量不饱和脂肪酸迅速氧化为脂质氢过氧化物。随后脂质氢过氧化物分解，形成丙二醛(MDA)、羟烯酸等其他活性产物，对apoB起修饰作用，从而改变了LDL的特性，产生新的抗原位点[35]。
LDL的氧化修饰引起自身的结构和生物性质发生明显变化。Itabe[36]研究表明，氧化LDL内维生素E含量下降，游离氨基减少，琼脂糖凝胶电泳时迁移率增大，其中所含的卵磷脂转变为溶血卵磷脂。丙二醛修饰也可共价结合LDL分子中赖氨酸残基，使分子中的正电荷减少，负电荷增加，导致LDL在琼脂糖凝胶电泳时迁移率增大。氧化、修饰LDL易被巨噬细胞－清道夫受体识别和摄取， 导致细胞内胆固醇酯的蓄积和泡沫细胞的形成参与As的病理过程。通常LDL受体途经是通分子中的赖氨酸残基识别并摄取LDL，但当LDL中的赖氨酸残基被丙二醛共价结合后，LDL产生新的被巨噬细胞－清道夫受体识别的位点，同时此位点仍可被LDL受体识别。
采用体外Cu2+和MDA分别介导LDL的氧化、修饰，发现LDL特性发生了变化。Cu2氧化LDL的CD值随着氧化时间的延长而不断增大，到达峰值后减小；而MDA修饰LDL因未发生消耗内源性抗氧化剂而启动的链式氧化反应过程，CD值不发生变化，但TBARS值随着MDA修饰时间的延长而增加。
LDL经氧化后，一方面产生新的氧化位点，同时部分原有位点被隐蔽。相关分析显示，Cu2+氧化时间和TC、TG、LDL-C、apoB均呈良好的负相关性；MDA修饰时间和LDL-C、apoB亦呈良好的负相关性；提示apoB上的抗原位点被隐蔽，apoB同脂质的结合也受到影响。另外，采用ox-LDL自身抗体建立的 ELISA法测定ox-LDL位点变化较多克隆抗体更为明显，提示ox-LDL自身抗体能更准确、真实地反映ox–LDL位点的变化，基于自身抗体建立的 ELISA法可能更好地反映体内ox-LDL反应性的强弱。本实验为寻找稳定的、与体内ox-LDL特性相似的氧化脂蛋白作为参考物质提供理论和实验依据。
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第四部分 冠状动脉病变患者血浆氧化低密
度脂蛋白的检测
研究证实ox-LDL水平高低是As发生的强危险指标，与冠心病发生、程度密切相关。急性冠状动脉综合征(acute coronary syndrome，ACS)是心肌急性缺血的一组临床表现，主要是由于不稳定As斑块糜烂、破裂而形成局部血栓，导致部分或全部血管堵塞[37]。近年研究显示ACS患者外周血ox-LDL水平升高[38]，可能与As斑块的不稳定性有关，但结果不一，国内未见报道。本研究旨在分析ACS、非ACS患者ox-LDL水平变化及机制，评估ox-LDL水平检测的临床价值。
4.1 材料和方法
4.1.1 研究对象
选择2004年1月至2004年12月在我院心血管内科住院确诊的冠心病患者139例，男75例，女64例，平均年龄为(58.0±9.6)岁，均行冠状动脉造影检查。其中ACS组76例，男41例，女35例，平均年龄为(59.1±6.6)岁；非急性冠状动脉综合征(non-ACS，NACS)组63例，男34例，女29例，平均年龄为(56.5±7.0)岁。正常对照组100例，其中男61例，女39例，平均年龄为(56.3±8.4)岁，均经病史询问、常规体检、常规检查如心电图(ECG)和x线胸片等排除心血管疾病(包括部分冠状动脉造影结果正常者)。各组之间进行性别、年龄配对，均具有可比性。入选病例中有下列情况者予以剔除：肾脏病，合并感染性疾病如严重的上呼吸道、肺部、肝胆道等感染，高热以及应用炎症抑制药物如非固醇类消炎镇痛药、类固醇和阿片类药物及降脂药物等。
4.1.2 标本收集
血液标本为禁食12h以上采集的EDTA-Na2抗凝血浆，-70℃保存。
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4.1.3 ox-LDL的测定
ox-LDL采用自制ox-LDL多克隆抗体包被抗体，酶标抗apoB为检测抗体建立的ELISA法测定(方法见第三部分)。使用的ox-LDL多抗与天然LDL之间无交叉免疫性；抗apoB与天然、氧化LDL均具有免疫反应性。
4.1.4 血脂及载脂蛋白测定
总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)用ELISA测定，使用BM公司试剂；载脂蛋白A I (apolipoprotein AI，apo AI)、apoB采用日本第一化学免疫比浊试剂测定。测定仪器为Hitachi 7600生化分析仪。脂蛋白(a)[lipoprotein (a), Lp(a)]用ELISA法检测[39]。
4.1.5 根据冠状动脉造影结果进行分组
冠心病组患者采用Judkins法常规体位投照，分别对左、右冠状动脉进行造影，对阻塞病变进行评价。冠状动脉的病变程度按狭窄累及左冠状动脉前室间支、旋支或右冠状动脉的支数，分为单支病变组(1支病变)、双支病变组(2支病变)和多支病变组(病变>2支)。其中显著累及左主干者算作2支。
4.1.6 数据分析
数据以均数±标准差(x±s)表示，数据处理采用Statistics11.0软件。多组间比较采用单因素方差分析，方差齐时两两组间比较采用LSD检验，方差不齐时采用Tamhane’s T2检验。变量间相关性采用非参数Spearman 秩相关分析和多元线性回归分析。P≤0.05为差异有显著性统计学意义。
4.2 实验结果
4.2.1 ACS患者ox-LDL、血脂及载脂蛋白水平
与正常对照组相比，ACS和非ACS患者ox-LDL水平均显著升高；且ACS
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患者ox-LDL水平高于非ACS患者。在不同ox-LDL水平下(对照组：均数+1或2标准差)，预测ACS的OR值分别为85.6和74.5；非ACS的OR值分别为12.8和21.3 (P均<0.001，表 4.2)。ACS和非ACS患者的TC、TG、Apo B、LDL-C和Lp(a)水平均显著高于正常对照组；而HDL-C水平显著低于正常对照组。ACS患者的TC、Apo B、LDL-C水平显著高于非ACS患者(表 4.1)。
表4.1 ACS、非ACS患者ox-LDL、血脂及载脂蛋白水平
变量
TC* (mmol/L) TG* (mmol/L) HDL-C* (mmol/L) Apo AⅠ* (g/L) Apo B* (g/L) LDL-C* (mmol/L) Lp(a)* (mg/L) ox-LDL* (mg/L)
*
ACS组 (n=76) 非ACS组 (n=63) 正常对照组 (n=100)
b
4.57±0.80 5.84±1.39 c, d 5.06±0.98
b
1.45±0.72 2.05±1.02 c 1.85±0.92
1.27±0.26 b 1.28±0.31 a 1.39±0.30
a
1.32±0.24 1.29±0.30 1.40±0.27 c
0.97±0.18 1.35±0.29 c, d 1.20±0.21
b
2.52±0.64 3.62±1.34 c, d 2.92±0.84
293.56±161.04c 258.01±130.82 213.88±135.30 188.01±69.88 c, d 137.88±59.74 c 82.68±29.06
a bcd
组间比较：P<0.05；与对照组比较：P<0.05； P<0.01； P<0.001；与非ACS比较：P<0.001。
表4.2 不同ox-LDL水平下ACS、非ACS的OR值
ACS组
变量
例数 检出率(%)
Ox-LDL 111.74 mg/L (对照x±1s) 140.80 mg/L (对照x±2s)
OR (95%可信限)
P值 0.000
非ACS组
例数检出率(%)
OR (95%可信限)
12.8 (5.8-28.2)21.3 (6.1-74.6)
P值
对照组
例数 检出率(%)
85.6
76 70 (92)
(30.6-239.4)74.5
76 53 (70)
(21.4-259.8)
63 40 (63)0.000 100 12 (12)
0.00063 25 (40)0.000 100 3 (3)
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4.2.2 不同动脉病变程度冠心病患者ox-LDL水平
冠状动脉多支、双支、单支病变组间ox-LDL水平不同，分别为(183.63±79.42) mg/L, (164.15±63.79) mg/L和(146.97±58.40) mg/L，且多支高于单支(P<0.01)。(图4.1)
图4.1 不同动脉病变程度冠心病患者ox-LDL水平
4.2.3 动脉病变程度与ox-LDL、血脂、载脂蛋白间相关分析
单因素分析显示冠状动脉病变程度分别与TC、ox-LDL、和LDL-C水平呈正相关(表4.3)；多因素分析显示冠状动脉病变程度仅与ox-LDL相关(R2=0.048, β=0.217, P=0.000)。
变量 病变程度
a
表4.3 Ox-LDL水平与动脉病变程度、血脂、载脂蛋白间相关分析 例数 Ox-LDL TC TG HDL-C139 0.220 b 0.214a 0.111
-0.03
LDL-C0.195a
Lp(a)Apo AⅠ 0.127
Apo B
-0.07 0.151
P<0.05；b P<0.01
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4.3 讨论
Ox-LDL在As发生、发展中起着重要作用，在血管壁As斑块部位及外周血中均存在ox-LDL。国外文献报道ox-LDL是As发生的强危险指标，与冠心病发生、程度密切相关；近年研究显示ACS患者外周血ox-LDL水平升高，可反映As斑块的不稳定性，有益于鉴别ACS和非ACS。本研究显示，冠心病患者的ox-LDL水平显著升高，且与病变的严重程度相关，而急性冠脉综合征患者变化尤为显著。
体内ox-LDL存在多种位点，不同来源的抗体检测的位点不同，以及参考标准不一，上述差异引起不同方法间测定结果不同，临床研究结果出现差异。目前国外主要采用三种单抗分别建立ELISA法检测ox-LDL：E6针对丙二醛修饰LDL(MDA-LDL)[29]，DLH3针对氧化磷酸卵磷酯(ox-PC) [40,41]，E06针对氧化磷脂(ox-PLs) [42]。Holvoet等[27]研究表明CAD患者ox-LDL (ox-PC) 和MDA-LDL水平显著升高；ACS患者仅MDA-LDL水平高于非ACS患者，认为MDA-LDL水平可反应斑块的不稳定性，有益于鉴别ACS。Tsimikas等[43]发现高ox-PLs水平与As的存在、程度密切相关，且急性冠状动脉综合征、经皮冠状动脉干预患者ox-PLs水平快速升高。本文采用抗人ox-LDL多克隆抗体检测ox-LDL，可识别多种氧化位点，但与MDA-LDL无交叉反应。本文结果显示冠心病患者的ox-LDL水平显著升高，且ACS患者变化尤为显著，ox-LDL在ACS中异常检测率和OR值均高于非ACS；不同病变组间ox-LDL水平不同，动脉病变程度分别与ox-LDL、和LDL-C水平呈正相关，多因素分析显示冠状动脉病变程度仅与ox-LDL相关。上述结果进一步表明ox-LDL水平与冠心病发生、程度密切相关，高ox-LDL水平有助于ACS的鉴别诊断。
体内有多种机制导致脂蛋白发生氧化，血浆中ox-LDL的来源尚不明确。对冠心病患者血浆中分离的ox-LDL特性进行分析显示，不是来源于金属离子的氧化，可能是由动脉内膜中与细胞相连的活性氧化酶引起；动物实验也证实LDL的氧化过程发生在动脉壁而不是血液中。一般认为LDL进入血管内皮细胞下，开始被氧化。少量氧化LDL可返流回外周血；或转移的氧化位点与外周血中LDL等脂蛋白接受体相结合。如As斑块不稳定患者血浆中的部分氧化LDL可直接来源于不稳定斑块的释放。在较稳定的患者中，高水平氧化LDL可能反映动脉中
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新形成的、或斑块进一步损伤处氧化LDL的更新代谢。动脉中含有大量的氧化LDL，周围的LDL也更易被氧化，因此也潜伏着As发生的高风险。本研究中ACS组ox-LDL水平增加程度高于非ACS组，且ox-LDL与冠状动脉病变的程度相关，均提示外周血中ox-LDL直接来源于动脉血管壁不稳定斑块的破裂。其他研究也发现急性冠状动脉综合征、经皮冠状动脉干预患者ox-PLs水平快速升高。
作为As性疾病的理想标志物应具备以下条件，测定方法准确、可靠，能定量、反映病变程度，为无症状的个体提供灵敏度高、特异性强的疾病预测价值，并能够得到广泛应用。尽管已证实ox-LDL是As发生的强危险指标，与冠心病发生、程度密切相关，并能反应As斑块的不稳定性，但成为临床常规检测的标志物尚有一段距离，有关ox-LDL水平高低与疾病的发展、预后的关系，以及具体检测何种位点更具临床价值，测定方法标准化等均是有待研究的课题。
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第五部分 采用氧化低密度脂蛋白自身抗体和多克隆抗体的ELISA检测法结果比较
Ox-LDL水平高低是As发生的强危险指标，测定ox-LDL结合测定其他血脂、炎症指标，可用于评估冠心病发生的危险性及As斑块稳定性。人血清中ox-LDL的测定一般采用特异性单克隆或多克隆抗体建立的ELISA法检测，因不同来源抗体针对的ox-LDL氧化位点不同，导致结果间差异。我们从人混合血清中提取了ox-LDL自身抗体，并制备了兔抗人ox-LDL多克隆抗体，分别建立了采用两种抗体的ox-LDL ELISA检测法。初步实验证明两种方法均特异、灵敏、准确，适于临床检测。本文对两种ELISA法的临床价值进行分析。
5.1 材料和方法
5.1.1 研究对象 (见 4.1.1) 5.1.2 标本收集 (见 4.1.1) 5.1.3 ox-LDL的测定
采用自制ox-LDL多克隆抗体和提取的自身抗体作包被抗体，酶标抗apoB为检测抗体建立的ELISA法测定(方法见第三部分)。
5.1.4 数据分析
数据以均数±标准差(x±s)表示，数据处理采用Statistics11.0软件。多组间比较采用单因素方差分析，方差齐时两两组间比较采用LSD检验，方差不齐时采用Tamhane’s T2检验。P≤0.05为差异有显著性统计学意义。受试者工作特征(receiver operating characteristic, ROC)曲线分析方法的预测价值。
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5.2 实验结果
使用多克隆抗体和自身抗体测定ox-LDL水平，均发现ACS患者ox-LDL水平高于正常对照组，且ACS患者水平高于非ACS患者，两种方法结果相关性显著(r =0.502, P=0.000)。但仅多克隆抗体法测定结果显示非ACS患者水平相比正常对照组显著升高(表 5.1)。ROC曲线显示，自身抗体和多克隆抗体法分析冠心病组的曲线下面积(area under the curve, AUC)分别为0.706和0.894，ACS组的AUC分别为0.741和0.948，非ACS组的AUC分别为0.661和0.826；两种方法差异显著(冠心病组：u =5.01, P<0.001；ACS组：u =5.47, P<0.001；非ACS组：u =3.52, P<0.001)(图 5.1, 5.2, 5.3)。
表5.1 多克隆抗体和自身抗体法测定ACS、非ACS患者ox-LDL水平 ox-LDL(mg/L) 自身抗体 * 多克隆抗体 *
*
ACS组
(n=76)
134.58 ± 76.56 a, b
非ACS组 (n=63)
110.36 ± 46.94
正常对照组 (n=100)
91.69 ± 70.17 82.68 ± 29.06
188.01 ± 69.88 a, c 137.88 ± 59.74 a
组间比较：P<0.05；与对照组比较：a P<0.001；与非ACS比较：b P<0.05；c P<0.001。
图 5.1 两种方法测定冠心病患者ox-LDL水平的ROC曲线分析
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图 5.2 两种方法测定ACS组患者ox-LDL水平的ROC曲线分析
图 5.3 两种方法测定非ACS组患者ox-LDL水平的ROC曲线分析
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5.3 讨论
近年来大量文献报道，高水平的ox-LDL与As性疾病相关[44,45]。血浆ox-LDL同样是预测As性心血管疾病发生的有力指标，临床上一般采用特异性单克隆或多克隆ox-LDL抗体建立的ELISA法检测。但ox-LDL存在多种氧化位点，具体检测何种ox-LDL位点对临床更有价值尚不明确。针对不同抗原位点的抗体建立的ELISA检测法间结果差别很大，缺乏可比性。鉴于从混合人血清中提取的自身抗体能准确、如实地反映体内ox-LDL存在的抗原位点，采用自身抗体建立的氧化脂蛋白检测方法能更准确、真实地反映体内LDL的氧化状况。我们制备的ox-LDL自身抗体和多克隆抗体均同ox-LDL具有极强的免疫反应性，而同天然、MDA修饰的LDL具极低的免疫反应能力。
近年研究显示ACS患者外周血ox-LDL水平升高可反映As斑块的不稳定性，有益于鉴别ACS和非ACS。Holvoet等[28,29]发现冠心病、心脏移植后冠心病、ACS患者等ox-LDL或MDA-LDL水平升高。Ehara等[14]的研究显示急性心肌梗死患者中的ox-LDL较稳定型心绞痛组及正常对照组明显增高。本实验中，我们建立的两种ELISA法均显示ACS患者ox-LDL水平高于正常对照组，且ACS患者水平高于非ACS患者；但仅多克隆抗体法测定结果显示非ACS患者水平相比正常对照组显著升高，提示采用多克隆法对非ACS患者预测价值优于自身抗体ELISA法。ROC曲线表明，两种方法均有较高的诊断准确度。进一步比较曲线下面积，发现两种方法间有显著性差异；多克隆抗体法对冠心病组、ACS组和非ACS组的测定效果均优于自身抗体法。两种ELISA法检测结果具相关性，可作为冠心病的预测指标，但采用多克隆抗体的ELISA法相比自身抗体ELISA法更准确和灵敏，可能的原因是多克隆抗体相比自身抗体能识别ox-LDL上更多的抗原位点。尽管自身抗体比多克隆抗体灵敏度弱，影响其预测价值，但因其能更准确、真实地反映体内LDL的氧化状态，故可能在氧化脂蛋白检测方法学的标准化方面有独特的作用。
本实验结果显示了采用ox-LDL多克隆抗体和自身抗体建立的ELISA法均具有作为临床检测用方法的可能性，从而为临床应用提供了重要的依据。
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全文小结
As性心脑血管疾病是危害人类健康最严重的疾病之一。临床研究表明，ox-LDL在As发生中起着重要作用。大量证据表明ox-LDL存在于人血管壁的As斑块中，外周血ox-LDL水平可能与冠心病发生的危险性及严重程度相关[46]。对于LDL氧化机理的研究仍在进行中，还未完全明确。本文探讨了LDL氧化、修饰后特性的变化，及冠心病患者水平变化，以期为As性疾病的诊断、防治提供理论依据和新的方法手段。对此，本文得出了如下结论：
本研究从人血清中成功提取了ox-LDL自身抗体，抗体的特异性、反应性良好；
经Cu2+、MDA的氧化、修饰，LDL的TBARS、CD及氧化位点等特性发生了改变，为进一步研究寻找稳定的、与体内ox-LDL特性相似的氧化脂蛋白作为参考物质打下基础；
建立了分别采用两种抗体的ox-LDL ELISA检测法。实验证明两种方法均特异、灵敏、准确，适于用作临床检测。多克隆抗体法预测价值优于自身抗体法；但由于自身抗体来源于混合人血清，因此用它建立的方法应能够更真实、准确地反应LDL在体内的氧化状态；
研究发现冠心病患者ox-LDL水平较正常人显著升高；多支血管病变组患者ox-LDL水平明显高于单支血管病变组。冠心病患者ox-LDL水平与冠心病程度密切相关。
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研究生期间论文发表情况
急性、非急性冠状动脉病变患者血浆氧化低密度脂蛋白的变化。临床检验杂志（第一作者）
瘦素与儿童肥胖研究进展。医学研究生学报（第一作者）
The level of malondialdehyde-modified LDL and LDL immune complexes in patients with rheumatoid arthritis. Clinical Biochemistry （第三作者）
Plasma oxidized Lipoprotein(a) and its immune complexes are present in newborns and children. Clinica Chimica Acta （第三作者）
类风湿关节炎患者天然、氧化脂蛋白(a)水平。临床检验杂志（第二作者）
γ干扰素增强LDL免疫复合物诱导的U937细胞MMP-1表达。医学研究生学报（第二作者）
脂蛋白(a)免疫复合物对U937细胞基质金属蛋白酶1及其抑制物的作用。中国动脉硬化杂志（第三作者）
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南京师范大学硕士论文
致 谢
衷心感谢导师汪俊军教授在研究生期间给予我的指导与关心，在我课题研究的完成过程中给予了我莫大的支持和帮助。导师高尚的人格、严谨的治学态度、丰富渊博的知识、敏锐的学术思维以及勤奋的敬业精神都是我将来做人做事的榜样，也是我努力追求的目标，使我在科研水平和实验技能得到长足进步的同时，更是令我领悟到了更为深刻和重要的为人处世的道理。
我还要真诚感谢南京军区南京总医院检验科的李克主任、张春妮主任、刘小传老师、陈大宁老师、时永辉老师，以及检验科的其他工作人员对我的研究所给予的指导和帮助。同时感谢解放军临床检验医学研究所的各位主任和老师提供了如此优秀的科研环境和科研平台。
同时，还要感谢师兄师姐王相栋、孙庆宝、蒋超、黄祝、张蕾、韩艳玲、滕文荟、史薇薇、冯耀、蒋春霞等；同学孔令涛、田迎、牛冬梅、刘清珍、杨滨、高建、曹晶、韩雪峰、张艳梅、卢坤刚、卢洪涌、房国祥、蒯守刚、王书侠等；师弟师妹韩爱忠、王成、陆艳、严其容、魏莉、陶晓倩、柳海燕、时姗姗等平时给我的帮助与支持。
感谢母校——南京师范大学生命科学学院对我的培养。
最后，我要由衷地感谢我的父母，他们20多年来对我的养育之恩，我无以回报。他们对我的教导和鼓励是我战胜一切困难的动力和源泉。
孟扬 2009年5月
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氧化低密度脂蛋白检测及临床应用研究
作者：
学位授予单位：
孟扬
南京师范大学
引用本文格式：孟扬 氧化低密度脂蛋白检测及临床应用研究[学位论文]硕士 2009
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