牛支原体检测方法研究进展

牛支原体检测方法研究进展　庄金秋，张颖，梅建国，刘吉山，姚春阳　（山东省滨州畜牧兽医研究院，山东滨州　２５６６００）　摘要：随着规模化养牛业的不断发展，牛支原体已经成为危害养牛业的一种重要致病性支原体。本文介绍了　牛支原体病原学、血清学及分子生物学方面实验室检测方法的研究进展，为我国牛支原体病的防治提供了参考。　关键词：牛支原体；检测方法：病原学；血清学；分子生物学；研究进展　中图分类号：￥８５２．６５　文献标识码：Ａ　文章编号：１００５—９４４Ｘ（２０１６）１１－００６６—０５　ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００５—９４４Ｘ．２０１６．１１．０１９　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｐｒｏｇｒｅｓｓ　ｏｎ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ　Ｂｏｖｉｓ　Ｚｈｕａｎｇ　Ｊｉｎｑｉｕ，Ｚｈａｎｇ　Ｙｉｎｇ，Ｍｅｉ　Ｊｉａｎｇｕｏ，Ｌｉｕ　Ｊｉｓｈａｎ，Ｙａｏ　Ｃｈｕｎｙａｎｇ　（Ｂｉｎｚｈｏｕ　Ａｎｉｍａｌ　Ｈｕｓｂａｎｄｒｙ　ａｎｄ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ａｃａｄｅｍｙ，Ｂｉｎｚｈｏｕ，Ｓｈａｎｄｏｎｇ　２５６６００）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｌａｒｇｅ　ｓｃａｌｅ　ｃａｔｔｌｅ　ｉｎｄｕｓｔｒｙ，Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ　ｂｏｖｉｓ　ｈａｓ　ｂｅｅｎ　ｂｅｃｏｍｉｎｇ　ｏｎｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｍｏｓｔ　ｉｍｐｏｒｔａｎｔ　ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ　Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ　ｓｐｅｃｉｅｓ　ｃａｕｓｉｎｇ　ｓｅｒｉｏｕｓ　ｄａｍａｇｅ．Ｉｎ　ｏｒｄｅｒ　ｔｏ　ｏｆｆｅｒ　ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　ｆｏｒ　ｉｔｓ　ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｉｎ　ｏｕｒ　ｃｏｕｎｔｒｙ，ｔｈｅ　ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｐｒｏｇｒｅｓｓ　ｏｆ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ　ｂｏｖｉｓ　ｗａｓ　ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ，　ｗｈｉｃｈ　ｉｎｃｌｕｄｅｄ　ｅｔｉｏｌｏｇｙ，ｓｅｒｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｂｉｏｌｏｇｙ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ　ｂｏｖｉｓ；ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ；ｅｔｉｏｌｏｇｙ；ｓｅｒｏｌｏｇｙ；ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｂｉｏｌｏｇｙ；ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｐｒｏｇｒｅｓｓ　牛支原体（　ｂｏｒｉｓ）属支原体科支原体属，　是一种介于细菌和病毒之间的无细胞壁的原核微生　物。　６ｏｖ　可引起犊牛肺炎、乳腺炎、关节炎、　年，辛九庆等　首次从患肺炎的犊牛肺脏中分离　到该病原。　６ｏｖ　是危害犊牛健康的重要致病性　病原体，具有较高的感染率和死亡率，即使是治疗　后症状缓解的牛，一般都发育迟缓甚至成为废牛，　严重影响了牛奶的产量和质量。近年来，ＭｂＡＤ　已经在世界范围内广泛传播，且　幻　可明显增　加其他病原的继发感染，给世界养牛业造成了巨大　的经济损失。牛支原体感染后无特殊症状，因此很　难对该病进行感官判断，需借助实验室诊断确诊。　本文综述了近年来　幻１，　感染的最新实验室检测　方法研究进展，以期对该病的预防和控制提供参考。　１　牛支原体分离鉴定　支原体分离鉴定方法应严格按照无菌操作规　角膜结膜炎、耳炎、生殖道炎，甚至流产与不孕等　多种疾病。这些疾病常统称为牛支原体相关疾病　（ＭｂＡＤ）。牛传染性胸膜肺炎（ＣＢＰＰ），简称　牛肺疫，就是由与　６Ｄｖ如同属的丝状支原体丝状　亚种ＳＣ型（ＭｍｍＳＣ）引起的烈性传染病，被世　界动物卫生组织（ＯＩＥ）列为须通报的动物疫病。　ＭｍｍＳＣ和　６Ｄ１，括都是对牛致病力较强的支原体，　可导致相似的临床症状和病理剖检变化，不易鉴别　诊断。１９６１年，Ｈａｌｅｌ１　在美国首次从一例患乳腺　炎的牛乳中分离出　ｂｏｖ￣；１９７６年，美国首次报　道由　６Ｄｖ　引起的肺炎；１９８３年，黎济申等［２１　首次从我国患乳腺炎的牛乳中分离到该病原；２００８　基金项目：山东省现代农业产业技术体系牛产业创新　团队项目（ＳＤＡＩＴ－０９．１２）；山东省重点研发计划项目　（２０１５ＧＳＦ１２１０２７）　程，将患病动物的组织病料接种于培养基中。支原　体培养的营养需求较高，通常要在培养基中加入　ｌ０％～２０％马血清，置于３７℃、５％ＣＯ，培养箱中　培养３～５　ｄ。在类胸膜肺炎微生物（ＰＰＬＯ）固体培　养基中进行分离培养时，在光学显微镜下，菌落呈　囝　２０１６年第３３卷第１１期　现典型的“煎蛋状”、边缘整齐、表面光滑、中　间厚周边薄的菌膜斑点。如若７　ｄ未发现生长迹象，　可判断为阴性。初步鉴定后，在含酚红的液体培　养基中培养，观察培养基颜色是否由红变黄，且　稍浑浊，之后根据配套的生化反应进行鉴定。鉴　定为支原体后，需应用聚合酶链式反应（ＰＣＲ）等　方法来鉴别诊断是否为　ｂｏｖｉｓ或者其他支原体。　常用的液体培养基包括Ｈａｙｆｉｉｃｋ、Ｅｄｗａｒｄ、Ｆｒｅｙ、　ＭＥＭ—ＫＭＺ、ＳＰ一４等。　ｂｏｖｉｓ对外界环境要求较　高，采集的病料如未能及时送往实验室，极易导　致病原死亡。一般病料需冷藏运输，运输时间不　要超２４　ｈ，也可将其冻存于运输培养基中进行运　输。对于病料的采集，一般在下呼吸道比上呼吸　道分离出病原的概率大。虽然牛支原体分离鉴定　可以确诊是否有　ｂｏｖｉｓ的感染，但是分离难度大，　分离周期长，不能作为快速诊断　ｂｏｖｉｓ感染的　有效方法来使用。　２血清学方法　血清学方法是检测Ｍ．ｂｏｖｉｓ感染的可靠方法，　尤其对于经抗生素治疗或慢性的病例。血清抗体检　测方法比病原培养方法更敏感，包括酶联免疫吸附　试验、间接血凝试验、胶体金免疫层析试纸条和免　疫组化技术等。　２．１　酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）　利用全菌抗原或重组抗原建立的间接ＥＬＩＳＡ　方法是检测血清抗体的首选方法，应用最为广泛。　用处理过的Ｍ．ｂｏｖｉｓ全菌蛋白作为包被抗原的间　接ＥＬＩＳＡ方法，不仅能够检测血清抗体，还可以　检测患有乳腺炎奶牛的乳清抗体，被广泛应用于　Ｍ．ｂｏｖｉｓ感染的流行病学调查。但是由于建立该方　法的抗原为全菌蛋白，其特异性有待提高。鉴于　此，研究者先后建立了以Ｍ．ｂｏｖｉｓ的ＶＳＰ重组蛋白　和膜脂蛋白Ｐ４８作为包被抗原的间接ＥＬＩＳＡ方法，　用以检测对应抗体。２０１４年，Ｆｕ等［４１利用Ｐ４８　重组蛋白作为包被抗原，其相应的单克隆抗体用　ＨＲＰ进行标记，建立了直接竞争ＥＬＩＳＡ方法检测　Ｍ．ｂｏｖｉｓ抗体。以Ｐ４８蛋白作为包被抗原的ＥＬＩＳＡ　方法能检测Ｍ．ｂｏｖｉｓ的所有分离株，且不与感染牛　的其他六种支原体反应，对于检测Ｍ．ｂｏｖｉｓ感染有　很好的应用前景。２０１４年，Ｗａｗｅｇａｍａ等　鉴别　出一种可以具有脂肪酶活性的膜蛋白（ＭｉｌＡ）。　该蛋白氨基末端与　ｂｏｖｉｓ抗体有很强的免疫反　应。利用大肠杆菌诱导表达的该段蛋白建立了间　接ＥＬＩＳＡ方法，其敏感性达到９２．８６％，特异性高　达９８．７％。２０１４－－２０１５年，金云云等嘲、Ｈａｎ等【　］　以Ｍ．ｂｏｖｉｓ全菌蛋白作为包被用抗原，建立了检测　Ｍ．ｂｏｖｉｓ血清抗体的间接ＥＬＩＳＡ方法。该方法可以　区分出感染牛和免疫牛，从而可以判断牛感染程度　高低以及疫苗是否有效。国外商品化检测　ｂｏｖｉｓ　抗体的ＥＬＩＳＡ试剂盒有瑞士、加拿大和比利时等　国家研制的试剂盒。２０１１年，刘洋等［８　将纯化后　的Ｐ２８重组蛋白作为抗原建立了检测Ｍ．ｂｏｖｉｓ血清　抗体的间接ＥＬＩＳＡ方法，并组装成试剂盒，填补　了国内ＥＬＩＳＡ试剂盒的空白。该试剂盒具有良好　的敏感性、特异性和稳定性，能在一次反应中对　Ｍ．ｂｏｖｉｓ和ＭｍｍＳＣ作出鉴别诊断，与加拿大商品　化试剂盒Ｋｉｔ　１的检测结果符合率高达９２％，各种　技术指标相当，可作为进口试剂盒的替代品，用于　Ｍ，ｂｏｖｉｓ的临床诊断与流行病学调查。　２．２间接血凝试验（ＩＨＡ）　ＩＨＡ是一种经典的免疫学诊断技术，因具有操　作简单、稳定、成本低、敏感性和特异性较高，且　对试验条件要求低等优点，被广泛应用于兽医实验　室检测、田间血清学调查和基层兽医部门的辅助诊　断。２０１５年，简莹娜等『９　以纯化的Ｐ４８重组蛋白　致敏醛化一鞣酸化的绵羊红细胞并对其工艺进行优　化，建立了检测　ｂｏｖｉｓ抗体的ＩＨＡ方法。该方　法与国外商品化的ＥＬＩＳＡ试剂盒比较，平均符合　率为９６．１５％。对８３３份田间血清和１　０８４份乳清　进行检测，阳性率分别是１５．３７％和１９．５６％。该方　法敏感性高、特异性强重复性好，可用于　ｂｏｖｉｓ　抗体水平监测、牛支原体病的辅助诊断和流行病学　调查。　２．３胶体金免疫层析试纸条　２０１５年，简莹娜　０］利用牛支原体Ｐ４８重组蛋　白，建立了检测　ｂｏｖｉｓ抗体的胶体金免疫层析试　囫　纸条。应用该试纸条检测临床血清２００份和乳清　１０８份，阳性率分别是２１．５０％和１７．５９％，与ＩＨＡ　方法相比符合率为９６．５３％，表明该试纸条敏感、　特异、快速，适合于　ｂｏｖｉｓ抗体的快速检测。　２．４免疫组化技术　免疫组化技术是一门将免疫学与组织化学相　结合的技术，在组织细胞原位通过抗原．抗体特异　性结合反应和组织化学显色反应，借助可见的标记　物对相应抗原或抗体进行定位、定性和定量检测，　不仅能准确判断是否有病原感染，而且能清晰反映　病原在组织器官和细胞中的定位及分布。该方法操　作简便、不需要专门的仪器设备，适合于基层临床　的快速诊断，并且对于研究病原在机体内的致病　机制及分布规律也有一定的辅助作用。１９９５年，　Ａｄｅｇｂｏｙｅ等基于单克隆抗体建立了免疫组化方法，　检测犊牛肺组织中的Ｍ．ｂｏｖ＆。２００１年，Ｈａｉｎｅｓ等　建立的免疫组化技术，对牛场Ｍ．ｂｏｖ＆感染所致的　急、慢性呼吸道疾病、肺炎、乳腺炎等进行了病　原体检测。２００４年，Ｋｈｏｄａｋａｒａｍ—Ｔａｆｉｆ等采用免　疫组化方法进行Ｍ．ｂｏｖ＆的诊断，不仅能对福尔马　林固定的组织进行Ｍ．ｂｏｖ＆检测，还能清楚地显示　出Ｍ．ｂｏｖ＆在病灶内的具体位置，直观地观察病变　组织的病理变化以及Ｍ．ｂｏｖ＆侵袭机体后的分布情　况。２０１３年，金云云等　Ⅵ以鸡抗Ｍ．ｂｏｖ＆ＩｇＹ为　一抗，以ＨＲＰ标记的羊抗鸡ＩｇＧ为二抗，建立了　检测Ｍ．ｂｏｖ＆的间接免疫组化法。该方法可用于检　测临床病例组织样本及培养物中的Ｍ．ｂｏｖ＆，为探　究该病原在机体内的定位、动态分布规律及致病机　理提供了手段。　２．５其他血清学方法　如应用兔源高免疫血清鉴定Ｍ．ｂｏｖ＆的抗体检　测方法，其包括生长抑制试验（ＧＩ）、生物膜形　成抑制试验（ＦＩ）、荧光抗体试验（ＦＡ）和新陈　代谢抑制试验（ＭＩ）等。由于这些试验无商品化　抗血清，需在实验室自行制备，因此操作时较为费　时费力。　３分子生物学方法　由于牛在养殖场环境中停留２～４周后都存在可　固　检测滴度的Ｍ．ｂｏｖ＆抗体，所以血清学检测方法无　法准确诊断牛肺炎病例是否由Ｍ．ｂｏｖ＆引起。分子　生物学方法相对快捷方便，而且灵敏度高，己被广　泛应用于Ｍ．ｂｏｖ＆的实验室检测。分子生物学方法　包括ＰＣＲ技术、荧光定量ＰＣＲ技术、环介导等温　扩增技术（ＬＡＭＰ）和双向电泳技术等。　３．１　ＰＣＲ技术　早期国外研究者利用ＰＣＲ方法扩增１６Ｓ　ｒＲＮＡ　用来检测Ｍ　６Ｄｖ　的感染，但是由于其与无乳支　原体（　ａｇａｌａｃｔｉａｅ）的１６Ｓ　ｒＲＮＡ同源性高达　９９．８％，在不结合其他方法的情况下无法区分这两　种病原的感染。于是研究者又通过１６Ｓ　ｒＲＮＡ的　ＰＣＲ和酶切系统来鉴别这两种支原体。后来，研　究者先后选取ＤＮＡ修复基因ｕｖｒＣ、ＡＴＰ结合蛋白　ｏｐｐＤ／Ｆ基因、ｐ８１基因作为靶基因进行特异性扩增，　应用于临床患病牛的病原学检测，并对Ｍ．ｂｏｖ￣　和　ａｇａｌａｃｔｉａｅ作鉴别诊断。我国自２００８年开始　对Ｍ　ｂｏｖｉｓ进行深入研究，ｐ８１蛋白是Ｍ．ｂｏｖｉｓ和　ａｇａｌａｃｔｉａｅ共有的蛋白，但两者的同源性仅为　６７％。２００９年，李媛等　］根据Ｐ８１基因引物建立　了ＰＣＲ方法，可以从人工感染牛的鼻拭子和临床　发病牛肺中扩增出目的片段，与分离培养结果完全　符合，为国内首次建立的敏感、特异、快速的牛　支原体ＰＣＲ检测方法。同年李媛等利用ｏｐｐＤ／Ｆ为　靶基因设计引物，建立了套式ＰＣＲ方法，成功鉴　别了Ｍ．ｂｏｖ￣和　ａｇａｌａｃｔｉａｅ。２００９年，李彦芹ｆＪ　３＿　利用通用引物扩增１６Ｓ　ｒＲＮＡ建立了能够快速鉴别　诊断ＭｍｍＳＣ、Ｍ．ｂｏｖ￣、　ａｇａｌａｃｔｉａｅ和绵羊肺炎　支原体的多重ＰＣＲ方法。２０１０年，刘洋等ｌｌ　建　立了可以同时鉴别检测Ｍ．ｂｏｖ￣和ＭｍｍＳＣ的双重　ＰＣＲ方法。２０１１年，李大伟等ｌ１　５Ｊ建立了一种可一　次性区分上述三种支原体的三重ＰＣＲ方法，用于　临床诊断和流行病学调查。２０１５年，胡国明　卅根　据牛支原体Ｐ４８基因设计引物，建立了Ｍ．ｂｏｖ＆与　ａｇａｌａｃｔｉａｅ、ＭｍｍＳＣ、滑液支原体、鸡毒支原体　等病原的ＰＣＲ鉴别诊断方法，具有很高的特异性　和敏感性，对Ｍ．ｂｏｖｉｓ感染的临床快速、准确的诊　断具有较高的实用价值。　２０１６年第３３卷第１１期　３．２荧光定量ＰＣＲ技术　实时荧光定量ＰＣＲ技术也被用于Ｍ．ｂｏｖｉｓ检　测的研究。２００５年，Ｃａｉ等应用杂交探针和退火温　度建立了扩增１６Ｓ　ｒＲＮＡ基因序列的实时定量ＰＣＲ　方法，用以检测奶牛乳以及肺组织中的Ｍ．ｂｏｖ＆，　在检测牛乳时其敏感性达１００％，检测肺组织时其　敏感性达９６．６％。２０００年，Ｓａｃｈｓｅ等针对ＯｐｐＤ　基因，设计了实时定量ＰＣＲ引物及探针，在患乳　腺炎及呼吸道疾病的病牛中，能够灵敏特异地鉴别　出Ｍ．ｂｏｖｉｓ，检测限能够达到１００　ｃｆｕ／ｍＬ。２０１０年，　Ｒｏｓｓｅｔｔｉ等根据ｕｖｒＣ基因设计引物，建立了实时定　量ＰＣＲ方法。该方法不需要处理牛乳及组织样品　获取纯化的ＤＮＡ，可直接用于实时定量ＰＣＲ检测，　具有良好的特异性高度敏感性，方便用于Ｍ．ｂｏｖｉｓ　的检测。　３．３环介导等温扩增技术（ＬＡＭＰ）　ＬＡＭＰ方法具有操作简便、快速、高效、敏感、　特异、经济等特点，适于基层实验室的监测。２００５　年，Ｓａｉｔｏ等利用ＬＡＭＰ方法对肺炎支原体进行检　测，相同时间内ＬＡＭＰ检测法的灵敏度远高于实　时定量ＰＣＲ法，在对７０例患者及２５例正常人咽　试纸检测中的阳性率为１００％，无假阳性。２０１２年，　Ｃｈｕｒｃｈｗａｒｄ等同时用竞争性ＥＬＩＳＡ、套式ＰＣＲ及　ＬＡＭＰ对丝状支原体进行诊断，结果显示ＬＡＭＰ　法的敏感性远高于竞争性ＥＬＩＳＡ和套式ＰＣＲ。　２０１１—２０１２年，白智迪　】、侯轩等［１８１先后根据　Ｍ．ｂｏｖｉｓ的ｕｖｒＣ基因设计引物，建立了ＬＡＭＰ方法，　其敏感性较ＰＣＲ方法高１００倍。在对１６７个临床　鼻拭子样本的检测中，ＬＡＭＰ方法检测结果的阳性　率（２６．９５％）高于ＰＣＲ检测阳性率（１９．１６％）。　２０１４年，金云云等［１　９］根据Ｐ８１基因设计引物建立　了　ＬＡＭＰ方法，其最低检出限为１．１　ｎｇ／Ｌ。ＬＡＭＰ　方法方便快速，成本低廉，可被大范围推广使用。　３．４双向电泳技术　２０１２年，陈维等【２伽成功建立了Ｍ．ｂｏｖ＆蛋　白质组学双向电泳技术。由于国际上目前尚无　Ｍ．ｂｏｖ￣蛋白组学的相关报道，所以该方法可以鉴　定出相应的致病性蛋白，为Ｍ．ｂｏｖ￣致病机理的研　究提供蛋白质组信息。　４小结　随着养牛业的不断发展，牛支原体病的流行范　围越来越广，发生频率也越来越高，严重威胁了我　国养牛业的发展。我国对于本病的研究起步较晚，　国内外对该病原的研究不透彻，特别是对牛支原体　疫苗及其遗传稳定性的研究资料非常缺乏，国际上　也尚无公认的特异性诊断方法，对于该病致病机制　的研究尚未达成共识，从而给该病的预防控制带来　了不便。因此，建立快速、准确的检测方法，开发　新型疫苗等防控产品，具有十分重要的意义。上述　各种检测方法各有优点和实用性，实际中需根据不　同的场合、条件等选择使用其中的一种或者多种方　法。随着人们对Ｍ．ｂｏｖ￣的深入研究，相信该病的　检测方法将不断得到改进，更加简便化、快速化和　准确化。　参考文献：　［１］Ｈａｌｅ　Ｈ　Ｈ，Ｈｅｌｍｂｏｌｄｔ　Ｃ　Ｆ，Ｐｌａｓｔｒｉｄｇｅ　Ｗ　Ｎ，ｅｔ　ａ１．　Ｂｏｖｉｎｅ　ｍａｓｔｉｔｉｓ　ｃａｕｓｅｄ　ｂｙ　Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ　ｓｐｅｃｉｅｓ［Ｊ］．Ｃｏｒｎｅｌｌ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｉａｎ，１９６２（５２）：５８２．５９１．　［２】黎济中．牛的霉形体性乳房炎［．『］．上海畜牧兽医通讯，　１９８３（４）：４６．　［３］辛九庆，李媛，郭丹，等．国内首次从患肺炎的犊牛肺　脏中分离到牛支原体［Ｊ】．中国预防兽医学报，２００８，３０（９）：　６６１—６６４．　［４】Ｆｕ　Ｐ，Ｓｕｎ　Ｚ，Ｚｈａｎｇ　Ｙ，ｅｔ　ａ１．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　ａ　ｄｉｒｅｃｔ　ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ　ＥＬＩＳＡ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ　ｂｏｖｉｓ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ａ　ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｏｆ　Ｐ４８　ｐｒｏｔｅｉｎ［Ｊ］．　ＢＭＣ　ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１４（１０）：４２．　［５］Ｗａｗｅｇａｍａ　Ｎ　Ｋ，Ｂｒｏｗｎｉｎｇ　Ｇ　Ｆ，Ｋａｎｃｉ　Ａ，ｅｔ　ａ１．　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　ａ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ－—ｂａｓｅｄ　ｅｎｚｙｍｅ－・ｌｉｎｋｅｄ　ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ　ａｓｓａｙ　ｆｏｒ　ｄｉａｇｎｏｓｉｓ　ｏｆ　Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ　ｂｏｖｉｓ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ｎｉ　ｃａｔｔｌｅ［Ｊ］．Ｃｌｉｎｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｖａｃｃｉｎｅ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０１４，　２１（２）：１９６．２０２．　［６］金云云，剡根强，王静梅，等．牛支原体间接ＥＬＩＳＡ检　测方法的建立［Ｊ】．畜牧与兽医，２０１４，４６（２）：１０．１４．　［７］Ｈａｎ　Ｘ　Ｘ，Ｋｈａｎ　Ｆ　Ａ，Ｚｈｕ　Ｘ　Ｆ，ｅｔ　ａ１．Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ　ｏｆ　ａｎ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ａｖｉｄｉｔｙ　ｔｅｓｔ　ｔｏ　ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ　ｖａｃｃｉｎａｔｅｄ　ｃａｔｔｌｅ　ｆｒｏｍ　ｔｈｏｓｅ　ｎａｔｕｒａｌｌｙ　ｉｎｆｅｃｔｅｄ　ｗｉｔｈ　Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ　ｂｏｒｉｓ［Ｊ］．Ｖｅｔｅｉｒｎａｒｙ　Ｊｏｕｒｎａｌ，２０１５，２０３（１）：７９—８４．　［８］刘洋，陈维，宋志强，等．３种ＥＬＩＳＡ试剂盒检测抗牛　支原体抗体的比较［Ｊ］．中国预防兽医学报，２０１１，３３（６）：　固　国勃物ｊ１｝瘦　４４８—４５１．　和丝状支原体丝状亚种小克隆三重ＰＣＲ检测方法的建立及　初步应用［Ｊ］．畜牧兽医学报，２０１１，４２（２）：３０６—３１０．　［９］简莹娜，储岳峰，赵萍，等．牛支原体Ｐ４８蛋白的表　达及间接血凝检测方法的建立与应用ｆＪ］＿中国兽医科学，　２０１５，４５（３）：２４１．２４６．　［１６］胡国明．基于脂蛋白Ｐ４８的牛支原体快速检测方法的建　立［Ｄ】．兰州：甘肃农业大学，２０１５．　［１７］白智迪，牛支原体ＬＡＭＰ检测方法的建立及体外传代致　弱菌株的特性鉴定［Ｄ］．武汉：华中农业大学，２０１１．　［１０】简莹娜．基于Ｐ４８重组蛋白的牛支原体抗体检测技术研　究［Ｄ］．北京：中国农业科学院，２０１５．　［１１】金云云，剡根强，王静梅，等．牛支原体间接免疫酶标　组织化学检测方法的建立【Ｊ】．中国畜牧兽医，２０１３，４０（５）：　２６．３０．　［１８］侯轩，付萍，张海燕，等．牛支原体的环介导等温扩增　快速检测技术研究［Ｊ］．农业生物技术学报，２０１２，２０（２）：　２ｌ８—２２４．　［１２］李媛，董惠，张美晶，等．牛支原体套式ＰＣＲ检测方　法的建立［Ｊ】．中国畜牧兽医学报，２００９，３１（９）：７０９．７１１．　【１３］李彦芹．牛支原体ＰＣＲ检测方法的建立及临床应用［Ｄ］．　泰安：山东农业大学，２００９．　［１９］金云云，王静梅，剡根强．基于牛支原体Ｐ８１基因环介　导等温扩增方法的建立及应用［ＪＪ．中国兽医学报，２０１４，３４　（４）：５７１－５７７．　［１４］刘洋，李媛，董惠，等．牛支原体双重ＰＣＲ检测方法　的建立［Ｊ１．中国预防兽医学报，２０１０，３２（８）：５９９．６０２．　［１５］李大伟，黄灿平，张彦明，等．牛支原体、无乳支原体　［２０］陈维，李媛，辛九庆，等．牛支原体蛋白质纽学双向电　泳技术的建立及初步分析『Ｊ］．东北农业大学学报，２０１２（３）：　４２—４７．　（责任编辑：杜宪）　（上接第５５页）　实习效果进行全面考核验收，具体方式可以采用不　同岗位学生集体汇报的形式。　通过安排动物医学专业学生在库车县动物疫控　２．７实习团队的后勤岗位　该岗位主要负责打理实习学生的生活和饮食，　丰富实习期间的业余文化生活，举办相关的实习交　流和实习汇报工作。　３实习的轮岗流程　每个岗位安排两名学生，不同岗位交叉进行，　中心轮岗实习，该轮岗实习模式仍处于摸索研究阶　段，有待于进一步的完善并全面付诸实施，实现派　出单位和实习接收单位双赢的局面。　参考文献：　［１］计红，王春仁，张旭，等．动物医学专业校内实践基地　建设的实践［Ｊ１．黑龙江畜牧兽医，２０１０（２）：１５０—１５１．　［２】张秀峰，李国江．动物医学专业校内实训基地建设的模　式研究【Ｊ］．黑龙江畜牧兽医，２０１３（１２）：１８７一ｌ８９．　其中，一名学生为前一轮实习过的学生，另外一名　学生为新进实习生，这样既方便学习又不会对实习　单位的日常工作造成较大的影响。每个岗位一周进　行一次轮换，保证每个学生在３个月内能在不同的　实习岗位轮换２～３遍，对每个实习岗位的具体工作　能够做到得心应手。　［３］华彦，肖向红．新形势下的动物医学人才培养【Ｊ］．畜牧兽　医杂志，２０１０，２９（３）：４２—４４．　【４］王静．畜牧兽医专业学生实践能力培养研究［ＪＪ．畜牧与饲　料科学，２０１２，３３（１）：６２—６３．　４轮岗实习的日常管理　实习学生的日常管理主要由实习带队老师负　责，不同岗位由实习单位的管理人员具体负责，实　习期间遇到的具体业务问题，由实习带队老师和岗　位管理人员当场协调解决。实习结束时可以安排学　［５】严芬，黄志坚．动物医学和动物科学专业学生毕业实习　管理的思考和对策［Ｊ］．中国林业教育，２０１２（３）：１５　１７．　［６】农业部．《动物检疫管理办法》［ＥＢ／ＯＬ］．（２０１６—０４—　０６）［２０１６—１０—１０】．ｈｔｔｐ：￣ｌｈｚ．ｙｕｅｌｕ．ｇｏｖ．ｃｎ／ｙｕｅｌｕｇｏｖ／ｙｌ—ｘｘｇｋ／　ｂｍｘｘｇｋｍｌ／ｑｎｌｃｍｊ／ｚｃｗｊ／１　０２３９９３／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍ１．　生进行基本的业务技能考核，了解学生对基本业务　技能的掌握情况，作为轮岗实习考核的主要依据。　实习结束后，学院会同实习单位对本届实习学生的　［７］李怀旺．谈对动物产地检疫如何进行定位【Ｊ］．中国动物检　疫，２０１０，２７（２）：８－１０．　（责任编辑：孙荣钊）　囫