MTT法测定八种中草药体外抗肺癌细胞SPC-A1活性

２０１１年第５期　总第１０７期　《福建师范大学福清分校学报》　ＪＯＵＲＮＡＬ　ＯＦ　ＦＵＱＩＮＧ　ＢＲＡＮＣＨ　ＯＦ　ＦＵ￣ＡＮ　ＮＯＲＭＡＬ　ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ　Ｓｕｍ　Ｎｏ．１０７　ＭＴＴ法测定八种中草药体外抗肺癌细胞　ＳＰＣ—Ａ　１活性　林董　，何爱明・，吴祖建ｚ　（１　建师范大学福清分校生物与化学工程系，福建福清３５０３００；２．福建农林大学植物保护学院，福建福州３５０００１）　摘要：【目的］建立一套高效、快速的体外中草药抗肺癌活性物质筛选模型。【方法】采用ＭＴＩ＂法，对芸香　草、地榆、甘草、柴胡、莪术、蜜蒙花、半边莲和旱芹等８种中草药体外抗肺癌细胞ＳＰＣ—Ａ１的活性进行检测。　分析肿瘤细胞生长曲线，观察倒置显微镜下肺癌细胞在不同阶段的生长状况。【结果】在中草药活性物质作用　下细胞尽管仍然贴壁，但出现萎缩及边缘清晰化，与生长状况良好的细胞形态区别明显。浓度为１．５ｍ￣的　莪术乙醇浸提液（ＥｓＣｃ）和甘草乙醇浸提液（ＥｓｃＧ）对体外培养的肺癌细胞ＳＰＣ—Ａ１有较强的抑制增殖作用，抑　制率分别为：５２．９％和５１．６％，且抑制作用随着浓度的加大而加强。【结论］ＭＴＴ法筛选可作为８种中草药抗肺　癌细胞的一个基本筛选模型。　关键词：ＭＴＦ法；甘草乙醇浸提液；莪术乙醇浸提液；地榆乙醇浸提液；肺癌细胞ＳＰＥ—Ａ１；筛选；抑制率　中图分类号：Ｑ２５　文献标志码：Ｂ　文章编号：１００８—３４２１（２０１１）０５－－００３０．－０４　肺癌是目前最常见的肺原发性恶性肿瘤。近年来，世界各国特别是发达国家，肺癌的发病率和　病死率均迅速上升，死于癌病的男性病人中肺癌已居首位，而女性患肺癌的发生率也有上升的趋　势。目前肺癌的药物治疗方式主要采用化疗等，但化疗药物存在毒副作用反应大、缺乏选择性等缺　点，而探寻一种毒副作用小、高效的抗肿瘤活性物质则成为研究的热点［１１。　目前相对于化疗药物，中草药在抗癌方面具有安全、毒副作用小、遗传致突变率低以及服用方　便等优点，作为化疗的辅助用药，配合肺癌手术后或放、化疗治疗后，达到提高疗效、减轻副作用的　目的　。　中草药筛选必需采用合理及有效的方法。目前抗肿瘤药物的筛选方法可分为体内和体外两　种。采用体外细胞作为抗癌药物筛选具有用量少、周期短和费用省等优点，并且与体内实验相关性　较好，目前已经被很多研究所广泛采用【４】。Ｍ＇Ｉ＇Ｔ法又称Ｍ，ＩＴｒ比色法，是一种检测细胞生存和增殖状　态的方法。其检测原理为活细胞线粒体内的琥珀酸脱氢酶能够使外源性ＭＴＦ还原为水不溶性的蓝　紫色结晶甲瓒并且沉积在细胞中，而死细胞则无此功能。二甲基亚砜能够溶解细胞中的甲瓒，采用　酶联免疫检测仪在４９０ｎｍ波长处测定其吸光度，可间接反映活细胞数量，在一定细胞数范围内，　ＭＴｒ结晶形成的量与细胞数成正比，从而可作为检测活细胞数的指标圈。　我国是中草药的发源地，中草药来源广泛，采取方便、经济，性质较稳定，副反应小。本研究采　用ＭｒＩＴＩ’法，对芸香草、地榆、甘草、柴胡、莪术、蜜蒙花、半边莲和旱芹等８种中草药检测其体外抗肺　癌细胞的活性，试图建立一套全面、高效的抗肺癌活性物质筛选模型，为进一步探讨中草药抗肺癌　机理打下良好的基础。　１材料与方法　１．１材料　收稿日期：２０１１－－０７－２０　作者简介：林董（１９７９一），女，福建福州人，讲师，博士，主要从事天然产物与植物病毒学研究。　３２　福建师范大学福清分校学报　在同一块９６孔板上将甘草等８种中草药活性物质乙醇浸提液按四种浓度作用于肺癌细胞　ＳＰＣ—Ａ１。板上培养细胞至可以使用浓度后，添加活性物质。图２中从上到下每行添加的活性物质依　次为：地榆、甘草、芸香草、柴胡、蜜蒙花、莪术、半边莲和旱芹；以每三列代表同一种浓度，依次为　０．１　ｍｇ／ｍｌ、０．５　ｍｇ／ｍ￣、１．０ｍｇ／ｍｌ和１．５　ｍｇ／ｍｌ四种浓度设置。结果表明（图２）：有些培养孔内液体颜　色较深，如第五行加入蜜蒙花的细胞；有些培养孔内液体颜色较浅且比较均匀，如第一行的加入地　榆的细胞、第二行加入甘草和第六行加人莪术的细胞；另外一些培养孔内液体颜色则深浅不一，如　第四行加入柴胡的细胞。在ＭＴＴ法作用下，细胞培养孔内的液体颜色越深代表孑Ｌ内活细胞越多，这　意味着活性物质对细胞的抑制率越低。故从培养孔内的颜色可以预测地榆、甘草和莪术和对细胞　的生长具有较明显的抑制作用。　２．３酶标仪定量测定培养孔内液体的吸光值（３．５×１０－３ｍｇ／ｍｌ姜黄阳性对照）　浓度为１．５ｍｇ／ｍｌ时，甘草、地榆和莪术对肺癌细胞ＳＰＣ—ＡＩ有较高抑制率，分别为：５１．６％、　５２．８％和５２．９％（表１　ｏ　定量检测中，地榆对肺癌细胞ＳＰＣ—Ａ１的抑制率也达到５２．８％，但由于其加在培养板的第一　行，考虑到边缘效应的影响，定量检测中不再对地榆抑制率进行检测。　表１　Ｍ丌法测定几种活性物质对癌细胞的作用　Ｔａｂ．１　Ｔｈｅ　ｄｅｔｅｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｓｅｖｅｒａｌ　ａｇｅｎｔｓ　ｏｎ　ｔｕｍｏｒ　ｃｅｌｌｓ　ｂｙ　Ｍ１－ｒ　以四种浓度的ＥＳＣＧ和ＥＳＣＣ来处理ＳＰＣ—ＡＩ细胞株，横坐标代表活性物质浓度，纵坐标代表　细胞生长抑制率（姜黄为对照，台盼蓝染色计数），绘制细胞生长抑制曲线图（图３）。抑制作用曲线　结果也表明了这两种物质对细胞生长有明显的抑制作用，并且抑制程度与浓度呈正相关，随着浓　度的增大，抑制率也加大。　３讨　论　在具有抗癌作用的活性物　质中，各类分子种类繁多，如：甾　类、生物碱、萜类以及各种蛋白。　它们通过不同的作用机理发挥　治疗或预防肿瘤的作用，使天然　产物的多样性发挥出抗癌作用　的多样性。采用乙醇浸提是抗癌　活性物质筛选中较常用的方法，　具有方便、快速、有效以及毒副　Ｆｉｇ．３　ｉｎｈｉｂｉｔａｄｏｎ　ｅｆｆｅｃｔ　ｔｏ　ＳＰＣ—Ａ１　ｂｙ　ｆｏｕｒ　ａｃｔｉｖｅ　ｓｕｂｔａｎｃｅ　第５期　林董，何爱明，吴祖建：Ｍ　怯测定八种中草药体外抗肺癌细胞ＳＰＣ—Ａ１活性　３３　作用小等优点。小分子物质在乙醇溶液中的溶解度较水中大。若采用水作为溶剂提取，会造成提取物　成分复杂，不利于进一步分离纯化分析，故本实验采用乙醇为溶剂对８种中草药进行浸提。　目前体外检测药物体外抗肿瘤细胞药物活性的方法很多，主要有：ＭＴＦ法、集落形成法、放射　性标记代谢物前体掺入法以及快速荧光分析法等。Ｍｏｓｍａｎｎ于１　９８３年将Ｍ１Ｔｒ法发展起来，用来检　测细胞生存和增殖状态，ＭＴｒ法以其简便、快速、易标准化、不使用同位素等优点被用于细胞毒性　和淋巴因子生长抑制的定量检测网。　Ｍｒｒｒ法用于肺癌细胞对中草药药物敏感性的检测的报道不多。本实验中，甘草、地榆和莪术对　肺癌细胞的生长具有较明显的抑制作用，通过酶标仪测定不同物质作用后培养孔内液体的吸光值　结果表明，甘草、地榆和莪术对肺癌细胞ＳＰＣ—Ａ１的抑制率分别为：５１．６％、５２．８％和５２．９％，与ＭｒＩ］ｒ　法定性检测结果基本一致。本实验确定了甘草、地榆和莪术等中草药中具有较高抗肺癌活性成分　的物质，并检测其最佳作用浓度。而甘草、地榆和莪术等中草药体外抗肺癌的活性成分及其机制还　有待于进一步研究。　参考文献　［１１　Ｍｏｒ】ａｎ　Ｃ．Ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ　ｏｆｍｏｌｅｃｕｌａｒ￣ａｍｒｅｓ　ｏｆｎｏｎ—ｓｍａｌｌ　ｃｅｌｌ　ｌｕｎｇ　ｃａｎｃｅｒ　ｆｏｒ　ｃｈｏｉｃｅ　ｏｆｔｒｅａｔｍｅｎｔｊ［］．ＡｍＪ　Ｐａｔｈｏ１．２０１１，　１７８（５）：１９４０—８．　【２】ｕ　ＳＬ，Ｈｕａｎｇ　ＺＮ，Ｈｓｉｅｈ　ＨＨ，ｅｔ　ａ１．Ｔｈｅ　ａｕｇｍｅｎｔｅｄ　ａｎｔｉ—ｔｌｌｌＴＩＯｒ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆＡｎｔｒｏｄｉａ　ｃａｍｐｈｏｒａｍ　ＣＯ—ｆｅｒｍｅｎｔｅｄ　ｗｉｔｈ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　ｍｅｄｉｃｉｎｌａ　ｈｅｒｂ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ｈｅｐａｔｏｍａ　ｃｅｎｓ［Ｊ］．ＡｍＪ　Ｃｈｉｎ　Ｍｅｄ．２００９，３７（４）：７７１—８３．　［３】Ｗ　６ｊｃｉｋ　Ｒ，Ｓｉｗｉｃｋｉ　ＡＫ，Ｓｋｏｐｉ矗ｓｋａ—Ｉｋ　６　ｚｅｗｓｋａ　Ｅ，ｅｔ　ａ１．Ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　ｍｅｄｉｃｉｎａｌ　ｈｅｒｂ　Ｒｈｏｄｉｏｌａ　ｋｉｒｉｌｏｗｉｉ　ｅｘｔｒａｃｔｓ　ＯＨ　ｃｅｌｌｕｌａｒ　ｉｍｍｕｎｉｔｙ　ｉｎ　ｍｉｃｅ　ａｎｄ￣ｔｓＪ［１．ＰｏｌＪ　Ｖｅｔ　Ｓｃｉ．２００９，１２（３）：３９９—４０５．　［４】Ｄｅｎｕ＇ｎｙ　ＴＬ，Ｔｏｍａｓｚｅｗｓｋｉ　Ｇ，Ｄｙ　ＧＫ，ｅｔ　ａ１．Ｔｈｏｒａｃｏｓｃｏｐｉｃ　ｏｒｇａｎ　ｓｕｆｆｕｓｉｏｎ　ｆｏｒ　ｒｅｇｉｏｎａｌ　ｌｕｎｇ　ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ（ｐｒｅｌｉｍｉ—　ｎａｒｙ　ｒｅｓｕｌｔｓ）卟Ａｎｎ　Ｔｈｏｒａｃ　Ｓｕｒｇ．２００９，８８（２）：３８５～９０；ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ　３９０—１．　［５】ｖａｎ　Ｍｅｅｒｌｏｏ　Ｊ，Ｋ￣ｐｅｍ　ＧＪ，Ｃｌｏｏｓ　Ｊ．Ｃｅｌｌ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ　ａｓｓａｙｓ：ｔｈｅ　ＭＴＴ　ａＳｓ　Ⅱ】．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏ１．２０１　１，７３１：２３７—４５．　［６】Ｌａｚ　ａ　ｒ　Ｖ，Ｃｈｉｉｆｒｉｕｃ　ＭＣ，Ｓｔｅｗａｒｄ—Ｔｕｌｌ　ＤＥ，ｅｔ　ａＨｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ　ｏｆｔｈｅ　ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ　ｃａｐａｃｉｔｙ　ｏｆｓｏｍｅ　ａｄｈｅｒｅｎｔ　ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｓｉｔｃ　ｅｎｔｅｒ－　ｏｂａｃｔｅｒｉｌａ　ｓｃ池ｂｙｔｈｅＭＴＴａｓｓａｙａｎｄ缸ａＩ】ｓ【ｎ　ｎｅｌｅｃｔｒｏｎｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ［Ｊ］．１￣ｏｕｍＡｒｃｈＭｉｃｒｏｂｉｏｌＩｍｍｕｎｏ１．２０１０，６９（１）：３５—４０．　Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｏｆ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ａｎｔｉ　ｌｕｎｇ　ｃａｎｃｅｒ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅｓ　ＳＰＣ－Ａ１　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｆｒｏｍ　８　Ｃｈｉｎｅｓｅ　ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ　ｍｅｄｉｃｉｎｅ　ｂｙ　ＭＴＴ　ＬＩＮ　Ｄｏｎｇ　ＨＥ　Ａｉ－ｍｉｎｇ　ＷＵ　Ｚｈｕ－ｊｉａｎ　（７．Ｆｕｑｉｎｇ　Ｂｒａｎｃｈ　ｏｆ　Ｆ￣ｉａｎ　Ｎｏｒｍａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｆｕｑｉｎｇ　Ｆｕｊｉａｎ　３５０３００，　２．Ｆｕｊｉａｎ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｆｏｒｅｓｔｒｙ　Ｖｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｆｕｚｈｏｕ，Ｆｕｊｉａｎ　３ＳＯ００１）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：［ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ】Ｂｕｉｌｄ　ｕｐ　ｔｈｅ　ｍｏｒｅ　ｈｉｇｈｅｒ　ｅｆｆｅｃｔ　ａｎｄ　ｑｕｉｃｋｌｙ　ｍｅａｎｓ　ｔｏ　ｓｃｒｅｅｎｔｉｎｇ　ａｃｔｉｖｅ　ｓｕｂｓｔａｎｃｅ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｔｈｒｏｕｇｈ　ｏｕｒ　ｔｅｓｔ．［ｍｅｔｈｏｄ】Ｔｈｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｅｆｆｅｃｔ　ｔｏ　ＳＰＣ－Ａ　１　ｃｅｌｌｓ　ｏｆ　Ｃｙｍｂｏｐｏｇｏｎ　ｄｉｓｔａｎｓ，Ｓａｎ—　ｇｕｉｓｏｒｂａ　ｏｆｉｆｃｉｎａｌｉｓ，Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ　ｕｒａｌｅｎｓｉｓ　Ｂｕｐｌｅｕｒｕｍ　ｃｈｉｎｅｎｓｅ，Ｃｕｒｕｍａ　ｚｅｄｏａｒｉａ，Ｂｕｄｄｌｅｊａ　ｏｆｆｉｃｉ－　ｎａｌｉｓ，Ｌｏｂｅｌｉａ　ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ　ａｎｄ　Ａｐｉｕｍ　ｇｒａｖｅｏｌｅｎ　ａｎｄ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｏｆ　ｔｗｏ　ｃａｎｃｅｒ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅ　ｗｅｒｅ　ｔｅｓｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ＭＴＴ　ａｓｓａｙ．Ｃｕｒｖｅ　ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｅｌｌ　ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ　ｗａｓ　ｗａｔｃｈｅｄ　ｂｙ　ｉｎｖｅｒｔｅｄ　ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ［ｒｅ—　ｓｕｈ］ｃｅｌｌｓ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ａｃｔｉｖｅ　ｓｕｂｓｔａｎｃｅｒ　ｃｅｌｌｓ　ｗｏｕｌｄ　ｂｅ　ｃｏｎｄｅｎｓｉｎｇ、ｃｌｅａｒ　ｂｒｉｍ，ｗｈｉｃｈ　ｗｅｒｅ　ｍｕｃｈ　ｄｉｆｆｅｒ—　ｅｎｃｅ　ｆｒｏｍ　ｎｏｒｍａｌ　ＳＰＣ—Ａ　１　ｃｅｌｌｓ　ｔｈｏｕｇｈｔ　ｔｈｅｙ　ｓｔｉｌＩ　ａｄｈｅｒｅｎｔ．ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｕｇｇｅｓｔｅｄ　ｔｌｌａｔ．ｅｔｈａｎｏｌ　ｓｏｌｕｂｌｅ　ｃｏｎ—　ｓｔｉｔｕｅｎｔ　ｏｆ　Ｃ．ｚｅｄｏａｒｉａ（ＥＳＣＣ）ａｎｄ　Ｅｔｈａｎｏｌ　ｓｏｌｕｂｌｅ　ｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔ　ｏｆ　Ｇ．ｕｒａｌｅｎｓｉｓ　ｆＥＳＣＧ）ｃａｎ　ｉｎｈｉｂｉｔ　ｐｒｏ—　ｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＳＰＣ—Ａ１　ｃｅｌｌｓ　ａｔ　ｔｈｅ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　１．５ｍｇ／ｍｌ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｒａｔｅ　ｗａｓ：５２．９％ａｎｄ　５　１．６％，ｗｈｉｃｈ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ｗｉｈｔ　ｔｉｍｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｒａｎｇｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｔｅｓｔ．［ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ］Ｉｔ’Ｓ　ａ　ｇｏｏｄ　ｍｅｔｈｏｄ　ｔｏ　ｔｅｓｔ　ａｎｔｉ—　ｔｕｍｏｒ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｂｙ　ＭＴＩ＂．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ＭＴｒ，ＥＳＣＣ，ＥＳＣＧ，ＳＰＣ—Ａ１，ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，ｉｎｈｉｂｉｒｉｔｅ　ｒａｔｅ　（责任编辑：张沛）