细胞增殖MTT测定法标准操作规程
一、适用范围
适用于实验室从事MTT实验的实验技术人员和研究生。
二、操作规程
1、收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100ul 铺板，使待测细胞密度达到1000- 10000 孔，（边缘孔用无菌PBS填充）
2、 5% CO2，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板），培养一定时间（根据实验要求确定）后加入浓度梯度的药物，加药一般5-7个梯度，每孔100ul，设3-5个复孔
3、5%CO2，37℃孵育12-48小时，倒置显微镜下观察。
4、每孔加入20ul MTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h。若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液。
5、 终止培养，小心吸去孔内培养液。
6、每孔加入150ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm（贴壁细胞）或OD570nm（悬浮细胞）处测量各孔的吸光值。
7、同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）。
注意事项：
(1) MTT具有致癌性，操作时须带手套。
(2) 避免血清干扰：一般选小于10％的胎牛血清的培养液进行试验。在呈色后尽量吸尽孔内残余培养液。
(3) 设空白对照：与试验平行不加细胞只加培养液的空白对照。其他试验步骤保持一致，最后比色以空白调零。
(4) MTT实验吸光度最后要在0-0.7之间，超出这个范围就不是直线关系。
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