抗白色念珠菌中药小分子的发现及相关机制研究

抗白色念珠菌中药小分子的发现及相关机制研究

白色念珠菌是严重危害免疫缺陷人群的病原性真菌,其发病率呈上升趋势。当前临床上可用的抗真菌药物仅仅局限于多烯类（两性霉素B）,唑类（氟康唑等）,棘白菌素类（卡泊芬净等）等三类药物,抗真菌药物的靶点只有细胞膜的麦角固醇（ergosterol）代谢和细胞壁的β-1,3-葡聚糖（β-1,3-glucan）合成两个。

药物的毒副作用,耐药性,生物利用度低等问题都使得抗真菌药物治疗的效果不佳,而生物被膜的出现使这种情况更加恶化,因此,开发新的抗真菌药物成为一项迫在眉睫的使命。植物来源的小分子化合物一直是抗细菌,抗真菌和抗肿瘤药物的主来源之一。

中草药来源的天然小分子在抗真菌活性方面的研究越来越多,靶点也多种多样。因此,对源于中药的小分子化合物库进行筛选,不仅容易发现新的先导化合物,也可能找到新的抗真菌药物的靶点。

因此,本研究主要聚焦于中药来源的天然小分子的抗白色念珠菌活性。通过初步筛选,我们发现了9个具有抗真菌活性的小分子化合物/提取物,分别为血竭素高氯酸盐,盐酸石蒜碱,黄山药皂苷提取物,紫草素,土荆皮乙酸,补骨脂乙素,蓝雪醌,厚朴酚,和厚朴酚。

血竭素高氯酸盐和盐酸石蒜碱为首次发现具有抗白色念珠菌活性。由于其他化合物的抗白色念珠菌活性具有较详细报道,因此我们选择血竭素高氯酸盐,盐酸石蒜碱和黄山药皂苷提取物进行了初步研究。

所用菌株为白色念珠菌标准株SC5314。主要方法有时间杀伤曲线,形态转变,生物被膜的形成和发育（XTT实验）,黏附实验,磷脂酶产生,生物被膜中表多糖

（exopolysaccharide,EPS）测定,PI染色（流式细胞仪检测和共聚焦显微镜检测）,活性氧种类（reactive oxygen species,ROS）测定,cAMP补救实验,细胞毒性实验,线虫毒性试验,山梨醇补救实验等。

血竭素高氯酸盐的最小抑制浓度（MIC）为64μM,为抑制真菌活性。它能抑制白色念珠菌的生物被膜的形成,也能抑制已经形成的生物被膜的发育,以及白色念珠菌酵母型向菌丝型生长的转变。

血竭素高氯酸盐能降低细胞表面疏水性,白色念珠菌细胞对材料和培养细胞的黏附。它还能抑制细胞外磷脂酶的产生,以及成熟生物被膜中EPS的产生。

而其对哺乳动物细胞的毒性和对秀丽隐杆线虫的毒性都较小。其对菌丝型生长的抑制可能是通过降低细胞内cAMP来发挥作用的。

盐酸石蒜碱也为抑菌活性,MIC为64μM。它也能抑制酵母型向菌丝型的转变,抑制生物被膜的形成和发育,抑制白色念珠菌对材料表面的黏附。

细胞外磷脂酶的产生和EPS的产生也能被盐酸石蒜碱抑制,而cAMP也可能在其活性中发挥重要作用,而其对哺乳动物细胞的毒性也较小。黄山药皂苷提取物为杀菌活性,MIC与最小杀菌浓度（MFC）均为64μg/mL。

它也能抑制白色念珠菌的形态转变,抑制白色念珠菌生物被膜的形成和发育,抑制白色念珠菌的黏附,细胞外磷脂酶的产生以及成熟生物被膜中的EPS的产生。其对哺乳动物细胞的毒性较小,其抑制细胞增殖半数抑制浓度(IC₅₀)高于其抑制白色念珠菌的MIC。

黄山药皂苷提取物能够对细胞膜造成损伤,导致碘化丙啶（PI）进入细胞核并发出红色荧光。黄山药皂苷提取物还能显著提高细胞内ROS的产生,而加入N-乙酰-半胱氨酸（NAC）则能抑制其活性。

随后,我们对黄山药皂苷提取物的主要成分,薯蓣皂苷的抗真菌活性进行的初步评估。薯蓣皂苷具有很强的抗白色念珠菌活性,MIC和MFC均为4μg/mL,它同样能抑制生物被膜的形成和发育,抑制白色念珠菌的形态转变,细胞外磷脂酶的分泌等毒力因子。

它还能造成细胞膜通透性的升高,但是不能诱导细胞内ROS的产生。时间杀菌曲线也与黄山药皂苷提取物有所不同。

薯蓣皂苷和黄山药皂苷提取物,在时间杀菌曲线和ROS诱导产生方面的差异,使我们推测,在黄山药皂苷提取物中,还存在有其他抗念珠菌活性的化合物,或者能与薯蓣皂苷产生协同作用的化合物。通过对其中几种主要的皂苷成分进行抗真菌活性筛选,我们发现纤细薯蓣皂苷为另一抗真菌活性化合物。

纤细薯蓣皂苷的抗真菌活性为抑制真菌生长,其MIC为16μg/mL。纤细薯蓣皂苷同样能抑制生物被膜的形成和发育,抑制形态转变和黏附。

cAMP补救实验表明,其抗生物被膜的活性可能是通过降低细胞内cAMP实现的。PI染色试验证实,纤细薯蓣皂苷能提高细胞膜的通透性,而流式细胞仪检测表明,纤细薯蓣皂苷能造成白色念珠菌细胞内ROS产生增加,这与黄山药皂苷提取物的作用相一致。

山梨醇补救实验表明,它很可能是通过作用于细胞壁发挥抗真菌作用。另外,纤细薯蓣皂苷不仅能与薯蓣皂苷产生协同抗真菌活性,而且能与两性霉素B产生协同作用,而与氟康唑

和醋酸卡泊芬净均能产生相加作用。

本研究首次发现了血竭素高氯酸盐,盐酸石蒜碱和黄山药皂苷提取物的抗白色念珠菌活性,初步探索了它们对于白色念珠菌的黏附,形态转变,生物被膜形成以及细胞外磷脂酶分泌等毒力因子的抑制作用,以及对哺乳动物细胞的毒性。通过对比黄山药皂苷提取物和薯蓣皂苷抗真菌活性方面的差异,经过进一步筛选,本研究首次发现了纤细薯蓣皂苷具有抗真菌活性,并能通过细胞壁发挥抗真菌作用。

这些化合物为抗真菌药物的开发和结构优化提供重要的先导化合物。