产气荚膜梭菌α毒素C末端的二拷贝串联表达与免疫原性分析

中国兽医杂志　2019年(第55卷)第1期

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产气荚膜梭菌α毒素C末端的二拷贝

串联表达与免疫原性分析

杜吉革,王　磊,薛　麒,朱　真,李启红,印春生,姚文生,康　凯,陈小云

(中国兽医药品监察所,北京海淀100081)

　　摘要:本研究旨在获得产气荚膜梭菌α毒素(CPA)C末端(第247-370位氨基酸,CPAC)二拷贝串联融合蛋白,并评价

其免疫原性。对已知的A型产气荚膜梭菌CPAC编码基因进行优化设计,将其以同向串连的方式串联成二拷贝基因(GCPAC2),经人工合成获得基因片段GCPAC2。将GCPAC2克隆至原核表达载体pET-30a(+)中进行表达与纯化,获得重并检测一免及二免后兔血清的中和抗体效价。在二免21d后,经耳缘静脉注射1个家兔MLD的A型产气荚膜梭菌毒素,检每毫升的一免和二免抗血清分别可中和30个和80个小鼠MLD的A型产气荚膜梭菌毒素。1个兔MLD的A型产气荚膜梭菌毒素攻毒后,对照组4/4死亡,免疫组得到了100%(4/4)的保护。以上结果说明,rCPAC2具有良好的免疫原性,从而为A型产气荚膜梭菌病基因工程疫苗的研制提供了重要的实验数据。

关键词:产气荚膜梭菌α毒素;C末端;串联表达;抗原性

中图分类号:S852.616.3　　　　　文献标志码:A　　　　　文章编号:05296005(2019)01000704

组蛋白rCPAC2。利用WesternBlot方法检测rCPAC2与A型产气荚膜梭菌毒素抗血清的反应性。随后,用rCPAC2免疫家兔,测rCPAC2对家兔的免疫保护效果。结果表明,rCPAC2主要以包涵体的形式表达且能与A型产气荚膜梭菌毒素抗血清反应。

ExpressionandImmunogenicityofatandemfusionproteinoftwo

copiesofC-terminalofClostridiumperfringensαtoxin

DUJi-ge,WANGLei,XUEQi,ZHUZhen,LIQi-hong,YINChun-sheng,

(TheInstituteofVeterinaryDrugsControlofChina,Beijing100081,China)

YAOWen-sheng,KANGKai,CHENXiao-yun

theimmunogenicityofit.BasedontheknownCPAsequenceofClostridiumperfringenstypeA,geneofCPACwasoptimized.TwocopiesofCPACgenes,GCPAC2weretandemlylinkedinthesamedirectionandsynthesized.Then,GCPAC2wasclonedintoprokaryot-icexpressionvectorpET-30a(+)forexpressionandpurificationtogettherecombiantprotein,rGCPAC2.ReactivityofrGCPAC2withantiserumofClostridiumperfringenstypeAwasdetectedbyWesternblot.RabbitswereimmunizedwithrGCPAC2topreparean-tiserumanddetecttheneutralizingtiter.TheresultsshowedthatrGCPAC2waspresentedpredominantlyinaninsolubleform(inclu-sionbodies),anditcouldreactwiththeantiserumofClostridiumperfringenstypeA.Afterthefirstimmunization,serafromrabbitsimmunization.Moreover,rabbitsinrGCPAC2immunizedgroupfullysurvivedatthedoseof1rabbitMLDofClostridiumperfringenstypeAtoxinchallenge,whereasalloftherabbitsdied(4/4)inthecontrolgroups.ThesedatasuggestthatrGCPAC2isapotentialvaccinecandidateforgeneticengineeringsubunitvaccineofClostridiumperfringenstypeA.

Correspondingauthor:CHENXiao-yun

收稿日期:20180131

基金项目:科技部十三五“牛羊重要疫病免疫防控新技术研究”重点专项子课题(2017WFD0500903)

作者简介:杜吉革(1987),男,助理研究员,博士,研究方向为微生物与免疫,E-mail:du19371@163.com

通讯作者:陈小云,E-mail:caucxy@163.com

Abstract:ThisstudywasconductedtoobtainatandemfusionproteinoftwocopiesofCPAC-terminal(CPAC)andtoevaluate

immunizedwithrGCPAC2couldneutralize30miceMLDClostridiumperfringenstypeAtoxinperml,and80miceMLDaftertwice

Keywords:Clostridiumperfringensαtoxin;C-terminal;recombinantexpression;antigenicity

　　产气荚膜梭菌能引起人类以及多种家畜家禽发病,不仅威胁着人类的健康,而且对畜牧业造成了巨大的经济损失。根据4种主要致死性外毒素α(CPA)、β(CPB)、ε(ETX)和ι(CPI),可将该菌分为A、B、C、D、E5个毒素型[1]。其中,对养牛业危害最

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大的是A、C型和D型。在国外,牛的产气荚膜梭菌病主要由C、D型菌引起,而在国内,牛的产气荚膜梭菌病的病原主要是A型菌[8],病牛往往无任何前驱症状,而突然发病死亡[2-3]。为此,疫苗免疫是防制该病的有效手段。然而国内还没有商品化的疫苗,虽然灭活疫苗在预防羊的产气荚膜梭菌上,起到了一定的效果,但该类疫苗的制备过程冗杂,抗原成分复杂,有效抗原量较低。如大剂量的肌肉注1.2　基因合成及密码子优化　以C57-1的CPAC

购自碧云天生物技术有限公司。

(GenBank号:AY823400.1)基因为模版,按大肠杆菌偏爱密码子进行优化设计并二次重复,片段之间用氨基酸GGGS连接。同时,在基因C末端添加6×His标签蛋白的编码区,人工合成GCPAC2。

1.3　原核表达载体的构建　以GCPAC2为模板,采用引物对1F/1R进行PCR扩增。其中上游引物1F射会破坏牛肉的品质。因此,提供安全、纯净、有效的抗原对未来预防该菌感染具有重要意义。码

[4]

CPA分为,N-在末A是端型毒株中表达水平最高

由产气荚膜梭菌染色[5]

体。基成熟的因plcCPA

编370,CPAC)两个结构域(1-246,CPAN)和C-末端(247-

,而CPA。其中,CPAN是CPA发挥酶活性的主要区域[6]

。研究表明,重组C是毒素与细胞结合的主要区域力[7]

CPA仍存在一定的毒

低

[8-,10]

而通过甲醛灭活后的的意义。。已有的研究表明为此,无毒力的重组CPA,无毒力的CPA抗原性会明显降的研制具有重要

CPACPA起到一定的免疫保护作用[11-15]C能够对天然于CPA。然而CPA,由与GSTC蛋白分子量较小,研究者通常选择将等大分子量标签蛋白融合表达,从而引入了C无关的抗原成分。为了更好发挥CPA的抗原保护作用,本研究根据现行A型产气荚膜梭C对天然CPA菌标准株(C57-1株)CPAC的编码序列,按大肠杆菌偏爱的密码子进行优化设计,并将CPA,经原核系统表达、纯化和鉴定,并对重组蛋白C进行二次重复的免疫保护性进行研究。1　材料与方法

1.梭菌1　C57菌株-、1质粒株、C57、实验动物和试剂-1株天然毒素　A、C57型产气荚膜-1毒素抗血清及pET-30a(+)(以下简称pET)均为本实验室保存;1.5~2.0kg普通级健康日本大耳白兔和体重16~18gICR小鼠,购自北京维通利华实验动物技术有限公司;感受态细胞,购自北京全式金生物科技有限公司Seepic(M2)、Ni公司;佐剂MontanideISA201,购自法国生物科技有限公司-;IDA蛋白亲和层析介质试剂盒Marker(M1)、WesternBlotMarker;高保真PCR酶KOD,,购自金斯瑞购自东洋坊DNA;Premix公司;连接酶taq限制性内切酶、DNAversion凝胶回收试剂盒2.0,购自TaKaRaBamHⅠ和XhoⅠ,,购自公购自Promaga

司。T4NEB公司;抗His标签单抗、Bradford蛋白浓度测定试剂盒,

序列为:5′-GGCGGATCCGTTGGTAAGAAC-3′,其5′端引入限制性内切酶BamHⅠ位点(下划线部分);下游GATGGT,引物其1R5′序端引入限制性内切酶列为:5′-GGCCTCGAGTTAGTGGT-划线部分)。PCR体系为50μL,反应条件为XhoⅠ位点:94(℃下

预变性4min;98℃变性10s,56℃退火30s,68℃延伸90s,共33个循环;最后68℃延伸7min。

回收DNA条带,采用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后,与pET连接。将连接好的质粒转化Top10感受态细胞,挑取单克隆,37℃振荡培养过夜后,提取质粒。对所提质粒进行PCR鉴定后送测序,将测序正1.确的质粒命名为pCPAC2。

转化至4　重组蛋白的表达与纯化BL21感受态细胞中,分别在　将pCPA15C2以及pET℃和37℃条件下用IPTG诱导表达,并检测重组蛋白的表达情况及其可溶性以及与以抗His抗体的反应性。包涵体采用洗涤液洗涤后IDA,以缓冲液溶解。平衡Ni-平衡缓冲液洗脱目标蛋白柱后,与可溶蛋白孵育,,并收集每个洗脱组分检最后用不同浓度咪唑的测。收集纯度较高的洗液,用透析袋进行透析和复性后,上清用0.22μm滤器过滤分装,最终得到重组蛋白rCPA备用1.5　。

C2。最后测定蛋白浓度后保存于-80℃rCPAC2与A型产气荚膜梭菌毒素抗血清的反应　以A型产气荚膜梭菌毒素抗血清为一抗,HRP标记的山羊抗兔IgG二抗,检测rCPA型产气荚膜梭菌毒素抗血清的反应1.。

C2与A1.6　6.1　抗原性分析

1∶免疫程序1(v/v)的比例配制成终浓度为　将rCPAC2与MontanideISA201

佐剂以50μg/mL的疫苗1∶1(v/,v)另取灭菌的比例制备对照疫苗PBS与Montanide,置ISA4℃201保存备用佐剂以选用体重1.5~2.0kg健康家兔,取8只对A型产。

气荚膜梭菌毒素的中和效价为0的家兔,其中4只颈部皮下注射疫苗,2.0mL/只,免疫后14d,以相同剂量、相同途径进行二免。另外4只以免疫对照疫苗。

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1.6.2　血清中和效价测定　分别在一免后14d以及二免后21d,对试验组及对照组所有家兔经耳缘静脉采血,分离血清备用。按照《中华人民共和国兽药典》1.6.3　攻毒试验　二免后21d,通过耳缘静脉各注射1个家兔MLD剂量的A型产气荚膜梭菌毒素,观察5d,记录家兔的死亡情况,判定试验疫苗的免疫保护效力。2　结果

2.1　CPAC2串联基因的原核表达载体的成功构建获得的重组质粒酶切后出现大小约5kb的载体(2015年版)三部中规定的方法测定血清中和效价[16]。

DNA片段,以及大小约765bp的基因片段,与预期2.2　CPAC2串联基因的原核表达与纯化　将此质粒命名为pCPAC2。

相符。测序结果表明,插入的外源基因序列正确,

将

pCPAC2以及pET转化BL21并诱导表达。结果显示,在15℃诱导16h和37℃诱导4h两种条件下重组蛋白的表达形式均以包涵体为主,且能与抗His抗体发生反应,分子量约为40kDa,大小与预期相符(图1)。综合考虑蛋白表达量和诱导时间,选择37℃诱导4h的诱导条件。如图2所示,收集纯度较高的Lane7~9洗脱液进行透析和复性,最终获得了的蛋白rCPAC2浓度为0.771mg/mL。

图1　rCPAC2的原核表达与鉴定

a.重组蛋白表达的SDS-PAGE鉴定;b.重组蛋白与抗His单抗反应的WesternBlot

M1:蛋白Marker;M2:WesternBlotMarker;PC1:BSA(1μg);PC2:BSA(2μg);pET.pET37℃、4h诱导的细胞裂解物;1:pCPAC2,15℃、16h诱导的细胞裂解物;2:pCPAC2,37℃、4h诱导的细胞裂解物;pET1.pET,37℃、4h诱导的细胞裂解上清;pET2.pET,37℃、4h诱导的细胞裂解沉淀;3:pCPAC2,15℃、16h诱导的细胞裂解上清;4:pCPAC2,15℃、16h诱导的细胞裂解沉淀;5:pCPAC2,37℃、4h诱导的细胞裂解上清;6:pCPAC2,37℃、4h诱导的细胞裂解沉淀

图2　rCPAC2的纯化

M:蛋白Marker;1:包涵体溶解离心后上清;2:上清同Ni-IDA孵育后流出液;3~6:50mmol/LImidazole的洗脱液;7~9:100mmol/LImidazole的洗脱液;10~11:300mmol/LImidazole的洗脱液

图3　rCPAC2与A型产气荚膜梭菌抗毒素血清的反应

M:蛋白质相对分子质量标准;1:pET37℃、4h诱导的细胞裂解物;2:纯化后的rCPAC3

2.3　rCPAC2与A型产气荚膜梭菌毒素抗血清的鉴定　结果如图3所示,rCPAC2与A型产气荚膜梭菌毒素抗血清发生反应。2.4　rCPAC2　的免疫原性分析

80个小鼠MLD的A型产气荚膜梭菌梭菌毒素。

毫升的一免和二免抗血清分别可中和30个小鼠和

2.4.2　rCPAC2免疫对兔的免疫保护结果　在第2

2.4.1　抗rCPAC2兔血清的毒素中和抗体效价测定

经血清中和法测定,以rCPAC2免疫兔子后,每

次免疫后21d,耳缘静脉注射1MLD剂量的A型产气荚膜梭菌天然毒素进行攻毒,结果发现,对照的家兔在5d内全部死亡,rCPAC2免疫组的家兔在5d

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VeterinaryRecord,2010,167(1):1322.

内全部键活。3　讨论

随着研究的深入,与产气荚膜梭菌密切相关的主要致死性外毒素的结构和致病机理越来越清晰,致死性外毒素的部分无毒区域(CPA[11-13]、CPB以及CPI的C末端[17])或者无毒突变体(ETX)[18]和θ毒素(PFO)[19]作为亚单位疫苗抗原已经被证实能够有效地中和相应的毒血症。作为A型产气荚[4]　CanardB,ColeS.Genomeorganizationoftheanaerobicpathogen

66766680.

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膜梭菌的主要致死性毒素,CPA的减毒乃至无毒研究工作成为了众多研究者的方向。虽然对CPA发挥功能的关键氨基酸位点进行单点突变能够实现减毒的目的

[20]

到充分的研究。,但这些突变体的免疫原性还没有得

此外,单个氨基酸突变的CPA在未来基因工程疫苗大规模生产中存在一定的生物安全隐患CPA。已有研究表明,CPA分子主要由CPAN和C构成。其中,具有细胞毒性的CPACPAN是CPA酶活性的中心,而无细胞毒性的胞受体相结合的功能。对CPA的两个区域免疫保

C主要发挥着与细护性分析的结果表明,单独的CPA保护作用,而单独的CPAC具有一定的免疫N却无免疫保护作用。然而,由于单独的CPA从而造成C分子量过小,需要与GST等标签蛋白串联表达,CPAC实际的抗原量不足,而且对难以对该蛋白的免疫保护性进行准确定量。为此,本研究将CPAC进行2次重复后进行串联表达,不仅增加了有效抗原量,也增加抗原蛋白整体的分子量,更有利于增强分子的抗原性。rCPA本研究发现在15℃的条件下诱导16h后,

条件下C2可溶性表达比例可达15%,明显高于37℃

。但综合考虑蛋白表达量和诱导时间,我们选择选择37℃诱导4h。试验结果证明以非可溶形式表达的rCPA性。在实际生产中C2经纯化复性后具有较好的免疫原,以包涵体形式表达的重组蛋白在纯化中可显著产物中内毒素的含量。然而,在前期的研究中我们发现可溶性重组ETX免疫原性明显高于非可溶性的重组蛋白rCPA。为此,探讨如何提高C2的可溶性表达及其免疫原具有重要意义。参考文献:

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