乙烯受体基因LeETR1 在番茄突变体Epi 及其野生型中的表达

郑铁松󰀁应铁进

1

1*

󰀁何国庆󰀁曹家树

2

12

(1浙江大学食品科学与营养系,杭州310029;󰀁

浙江大学园艺系,杭州310029)

摘󰀁要:采用核酸酶保护分析(RPA)方法对番茄乙烯过表达单基因突变体Epi和野生型VFN8中LeETR1mRNA的表达特征进行了研究。结果表明,在正常番茄中LeETR1mRNA不受内源乙烯含量的影响,呈组成性表达。LeETR1mRNA在Epi部分组织中的表达强度发生了改变,并与Epi的形态特征变化相吻合,提示LeETR1在叶片的形态建成、果实成熟和顶钩发育中可能起着重要的作用。

关键词:番茄;乙烯受体;LeETR1;核酸酶保护分析;基因

中图分类号:S641.2;Q786󰀁文献标识码:A󰀁文章编号:0513󰀁353X(2001)02󰀁0128󰀁05

乙烯是调控植物生长发育、成熟衰老的重要激素,从种子萌发、叶片衰老、根茎伸长到果实成熟与软化等无不为乙烯所调节。随着植物体内乙烯生物合成途径的阐明和分子生物学的深入研究,通过分子生物学途径调控植物内源乙烯的合成已取得了显著的成绩。但相比而言,乙烯受体系统的研究则刚刚起步。在拟南芥乙烯受体基因研究的基础上,最近在番茄上也分别克隆到了与拟南芥乙烯受体基因ETRI、ERS和ETR2同源的LeETR1、

LeETR2、NR、LeETR4和LeERT5等5个乙烯受体基因󰀂1~4 。但目前尚不了解这些基因在整个乙烯受体系统中的确切功能,因而难以实现乙烯受体基因调控的实际应用。

Epinastic(Epi)是美国加州大学的Bradford于1984年在番茄品种VFN8群体中发现的一个乙烯过表达的单基因突变体,Epi的表现型与其野生型亲本有着极大的差异󰀂5 。我们拟通过研究Epi及其野生型中LeETR1基因的表达特性,对该基因在番茄乙烯受体系统中的功能进行初步探索。

1󰀁材料与方法

1.1󰀁供试植物材料

番茄(LycopersiconesculentumMill.)Epi和VFN8种子由美国加州大学番茄种子中心提供。按常规方法栽培于温室中。记录从花药开放到果实破色(BK,即果面出现第一丝转红)的平均天数(样本大于80个果实)。分别采集处于未成熟期(I)、绿熟期(M)、BK期、BK+3d、BK+5d、BK+7d和BK+10d的果实,处于幼叶期(a)、展开期(e)和

收稿日期:2000-07-24;修回日期:2000-10-08基金项目:国家自然科学基金资助项目(39870512)

部分工作在浙江大学国家蔬菜重点学科细胞与分子生物学实验室完成,特此致谢。*通讯联系人。

2期󰀁󰀁󰀁󰀁郑铁松等:乙烯受体基因LeETR1在番茄突变体Epi及其野生型中的表达󰀁󰀁󰀁󰀁129󰀁

成长期(m)的叶片作为代表各发育阶段的样品,进行指标测定。1.2󰀁果实有效货架寿命和乙烯含量的测定

参照Jackman󰀂6 的方法,果实有效货架寿命定义为果肉组织生物屈服点(bioyieldpoint)下降50%所需要的时间。内源乙烯生成量按文献󰀂7 方法测定。

1.3󰀁LeETR1cDNA部分序列的克隆与鉴定

依照Grierson等󰀂8 的方法从测试植物中抽提总RNA。用目的基因的3!-端序列为引物,以MMLV反转录酶从组织总RNA中反转录合成目的基因的cDNA第1链,以此为模板,用PCR法合成目的基因的cDNA部分序列,用OriginalTACloning󰀁克隆试剂盒(Invi󰀁trogenUK)将纯化的cDNA序列插入PCR󰀁2.1克隆载体中,转化大肠杆菌TOP10F!。以LacZ󰀁-互补法筛选阳性菌落,并以PCR󰀁2.1质粒中带有T7启动子序列和目的基因cDNA3!-部分序列为引物,用PCR法筛选正确方向插入的菌落,然后对克隆的cDNA序列进行测序鉴定。

1.4󰀁核酸酶保护分析(RPA)

采用RPA分析的方法测定LeETR1mRNA在植物组织中的表达丰度。采用专用的核酸酶RNaseONETM试剂盒(Promega,USA)并按其提供的方法󰀂9 进行。以含有目的基因的cDNA克隆质粒为模板,用T7RNA聚合酶合成的含有󰀁󰀁32P󰀁UTP的RNA为探针。

2󰀁结果与分析

2.1󰀁Epi和VFN8植株的形态特征

Epi是从VFN8群体中发现的天然乙烯过表达突变体󰀂5 。在正常生长条件下,Epi的幼苗从子叶展开到第3片真叶期与VFN8差别不大,至4~5片真叶时开始表现乙烯过表达的形态特征,叶片发生严重的偏上生长,导致极为紧凑的植株形态。遮光生长时,Epi的表现型仍呈严重的部分三重反应󰀁󰀁󰀁󰀁:遮光幼苗上胚轴显著变短变粗,根系略变短,但上胚轴顶钩角明显小于VFN8(Epi:50∀#42∀;VFN8:128∀#60∀)。Epi和VFN8果实生长发育速度无明显差异,但后熟特性差异较大,以果实生物屈服点下降50%为指标,在20∃下Epi成熟果实的有效货架寿命为4~5d,而VFN8则为10d以上。2.2󰀁Epi和VFN8果实中乙烯的合成Epi果实中乙烯的生成量始终高于其野生型VFN8(p%0.01),在绿熟期为VFN8的4倍以上,在BK+5d期为VFN8的1倍(图1)。在营养生长中也有类似现象,如Fujino的研究表明,在14、19、25、31日龄的植株中,组织乙烯含量Epi分别比VFN8高250%、80%、172%和󰀂5

图1󰀁Epi和VFN8番茄果实中乙烯生成量(n=5)

I:未熟期;M:绿熟期;BK:破色期;

3:BK+3d;5:BK+5d;7:BK+7d;10:BK+10d

Fig.1󰀁TheethyleneproductionofEpiandVFN8

intheirfruit(n=5)

TheendogenousethyleneproductionofEpiandVFN8fruitswasmeasuredatdifferentgrowthstages:immature(I);mature(M);breaker(BK);3,5,7,10days

afterbreaker(3,5,7,10)

130󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁园󰀁󰀁艺󰀁󰀁学󰀁󰀁报󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁28卷

307%。

2.3󰀁Epi和VFN8果实中LeETR1mRNA的表达特性

采用RPA方法对Epi和VFN8中LeETR1mRNA的表达丰度检测结果表明,LeETR1mRNA在二者果实发育的各个时期都有一定的表达,其表达丰度随着果实发育略有增加和波动,但在表达量上没有明显差别,即在Epi和VFN8果实中LeETR1mRNA基本呈组成性表达模式。将绿熟果用外源乙烯处理(10󰀂L&L-1,24h)后,Epi绿熟果中LeETR1mRNA的丰度明显高于同批处理的VFN8绿熟果,提示二者对外源乙烯的敏感性可能不同(图2)。

图2󰀁Epi和VFN8番茄果实中LeETR1mRNA的积累模式

左图为LeETR1mRNA的RPA分析放射自显影图,右图为相对表达强度图。

E:Epi;V:VFN8,I:未成熟期果实;M:成熟期果实;BK:破色期果实;3、5、7、10分别表示破色后3d、5d、7d、10d的果实;G:用外源乙烯处理(10󰀂L&L-1,24h)的绿熟果实;D:用酶水解后

的探针;U:未用酶处理的探针;VI和EI分别表示Epi和VFN8未成熟期果实,其余类推。

Fig.2󰀁LeETR1mRNAexpressioninfruitofEpiandVFN8

ThelevelsofLeETR1mRNAweremeasuredbyRPAanalysisanddetectedbyX󰀁rayradioautograph(left)andcomparedquantitativelytogivethepercentagerelativeexpression(right).RPAanalysiswasperformedontotalRNAfromfruitsofEpi(E)andVFN8(V)atdifferentgrowthstages:immature(I);mature(M);breaker(BK);3,5,7,10daysafterbreaker(3,5,7,10)andmaturegreenfruitstreatedwithethylene10󰀂L&L-1,24h(G).Digestedprobe(D);Undigestedprobe(U).

图3󰀁LeETR1mRNA在Epi和VFN8叶片中的累积模式

左图为LeETR1mRNA的RPA分析放射自显影图,右图为相对表达强度图。V:VFN8;E:Epi;a:幼叶期;e:展开期;m:成长期;U:未用酶处理的探针;D:用酶水解后的探针;Va、Ea分别表示处于幼苗期的VFN8和Epi叶子,其余类推。

Fig.3󰀁LeETR1mRNAexpressioninleavesofEpiandVFN8

ThelevelsofLeETR1mRNAweremeasuredbyRPAanalysisanddetectedbyX󰀁rayradioautograph(left)andcomparedquantitativelytogivethepercentagerelativeexpression(right).RPAanalysiswasperformedontotalRNAfromleaves

ofEpi(E)andVFN8(V)atdifferentgrowthstages:apical(a),expanding(e),mature(m).2期󰀁󰀁󰀁󰀁郑铁松等:乙烯受体基因LeETR1在番茄突变体Epi及其野生型中的表达󰀁󰀁󰀁󰀁131󰀁

2.4󰀁Epi和VFN8叶片中LeETR1mRNA的表达特性

与果实中的表现不同,在Epi和VFN8的叶片中LeETR1mRNA的表达丰度随着叶片的发育表现出明显不同的表达模式。在VFN8中LeETR1mRNA的表达随叶片的成长虽然略有下降,但基本恒定;而Epi中的表达丰度变化剧烈,在叶片成长期LeETR1mRNA表达

丰度明显高于叶片展开期(图3)。

3󰀁讨论

无论在果实还是在叶片的发育中,Epi中的乙烯合成量均明显高于VFN8,但LeETR1mRNA的表达丰度在所检测的大部分组织样品中,Epi均与VFN8无明显差异,说明LeETR1mRNA在正常番茄发育中呈组成性表达模式,基本不受内源乙烯含量的影响。这与NR基因的诱导型表达模式明显不同,说明LeETR1和NR可能分属不同的乙烯受体系统,它们在番茄乙烯信号的传导中起着不同的作用。

在生长期的叶片和外源乙烯处理的绿熟期果实中LeETR1mRNA的表达丰度,突变体Epi明显高于野生型VFN8。试验结果表明,在营养生长时期,Epi与VFN8的差异主要体现在成熟叶片的形态上;而在果实发育上,则主要体现在Epi果实成熟的明显加快。发育中的这些异常特征刚好与其LeETR1mRNA丰度的异常表达相吻合。由此可以推测,乙烯受体基因LeETR1可能在番茄的这些形态建成过程起着特殊的作用。这一研究结果为确定LeETR1的功能提供了新的依据。而Epi和VFN8绿熟果中LeETR1mRNA表达丰度在自然状态下基本相当,但在外源乙烯处理后则明显不同,提示Epi位点的突变可能影响到乙烯对LeETR1表达的调节作用,具体原因还有待于进一步探讨。另外部分营养组织中LeETR1的表达丰度也发生了变化(图3),这可能与Epi幼苗顶钩形成上丧失乙烯敏感性有关。

目前在拟南芥和番茄上均已经发现了多达5种以上的乙烯受体,它们在分子结构和表达特性上都具有明显差异󰀂1~4 。已有证据表明,乙烯对植物三重反应、植株发育和果实成熟的影响是通过不同的信号通道实现的󰀂10 。如拟南芥突变体只是在顶钩形成时对乙烯失去敏感性,而其它乙烯反应则正常;番茄NR突变体则表现为多效性,除果实成熟受阻外,还表现为叶柄偏向生长反应下降,叶片衰老和脱落延迟等󰀂12 ;LeETR4在番茄果实中表达丰富而LeETR5则极少表达󰀂1 。总之,植物体内乙烯的感受和传导系统是极其复杂的,各种乙烯受体在植物发育过程中表达特性不同,可能起着完全不同的作用。参考文献:

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󰀂2

132󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁园󰀁󰀁艺󰀁󰀁学󰀁󰀁报󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁28卷

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ExpressionofEthyleneReceptorGeneLeETR1inTomatoMutantEpiandItsWildType

ZhengTiesong,YingTiejin,HeGuoqing,andCaoJiashu

ZhejiangUniversity,Hangzhou310029)

1

1

1

2

2

(1DepartmentofFoodScienceandNutriology,ZhejiangUniversity,Hangzhou310029;󰀁

DepartmentofHorticulture,

Abstract:TheexpressivecharacteristicsofLeETR1mRNAintomatomutantEpianditswildtypeVFN8havebeenstudiedwithRNaseprotectassay(RPA).TheresultsshowedthatLeETR1mRNAexpressedconstitutionallyinVFN8.Anditsexpressionwasnotaffectedbytheendogenouspro󰀁ductionofethylene.However,thehighexpressionofLeETR1insometissuesofEpisuggestedthatLeETR1genemayhaveanimportantroleinthemorphogenesisofleaves,apicalhooksandfruitripeningintomato.

Keywords:Tomato;Ethylenereceptor;LeETR1;RPA;Gene

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