流式细胞术步骤

1. 细胞按每孔4×10 个的密度接种于60 mm细胞培养皿内，培养过夜后，用相应药物处

理细胞。

(设置实验组和对照组，实验组依辛伐他汀浓度分为3组，2μmol/L、5μmol/L、10μmol/L辛伐他汀组

正常对照组(NC组)：胰岛素终浓度L

A组：辛伐他汀终浓度2μmol/L+胰岛素终浓度 L； B组：辛伐他汀终浓度5μmol/L+胰岛素终浓度L； C组：辛伐他汀终浓度10μmol/L+胰岛素终浓度L； 于37℃，5%CO2培养箱中孵育48h）

2. 胰酶消化收集细胞，并用1 mL PBS缓冲液清洗剩余细胞一次，全部加入15ML管中。 3. 800 rpm离心5分钟，去除上清，加5 mL PBS缓冲液重悬细胞，再次离心弃上清，重复

两次，最后重悬细胞于 PBS中。 4. 、

5.

5

用低速振荡器边震动边加入5 mL预冷的70%乙醇，固定，4℃过夜。

6. 次日将固定好的细胞以1000 rpm的转速离心5分钟，弃上清，加入4 mL PBS清洗一次，

用 mL PBS重悬细胞。

7. 加入5 μL RNaseA（10 mg/ml）37℃消化1小时，加入终浓度50 mg/mL碘化丙啶（propidium

iodide PI）4℃避光染色过夜（或者37℃避光染色1小时），在EPICS XL流式细胞仪上分析。

利用流式细胞抗体检测检测细胞膜表面蛋白的变化

1. 细胞按每孔4×10 个的密度接种于60 mm细胞培养皿内，培养过夜后，用相应药物处

理细胞。

2．胰酶消化收集细胞，并用1 mL PBS缓冲液清洗剩余细胞一次，全部加入15ML管中。 3 . 800 rpm离心5分钟，去除上清，加5 mL PBS缓冲液重悬细胞，再次离心弃上清，重复两次，最后重悬细胞于 PBS中，并转移到 mL离心管中。

4. 按照1:100加入1UL一抗（如下图对应），置于垂直混合液上室温孵育1-2小时。 5. 1500rpm，小型离心机离心5分钟，去除上清，加1 mL PBS缓冲液重悬细胞，再次离心

5

弃上清，重复3次，最后将洗好的细胞重悬于 PBS中。

6.分别将荧光二抗DyLight 488、DyLight 567按照1:100比例加入细胞悬液中，室温孵育1小时。

#

7. 1500rpm离心5分钟，去除上清，加1 mL PBS缓冲液重悬细胞，再次离心弃上清，重复3次，最后重悬细胞于 PBS中。

8. 用锡箔纸包住避光，将细胞加入流式管中，在EPICS XL流式细胞仪上分析。 IR检测 类型细胞 $NC组 无 NC组 IgG1 NC组 IR A组 IR B组 IR C组 IR 一抗 二抗 无 DyLight 488 DyLight 488 $ DyLight 488 DyLight 488 DyLight 488 目的

'

空白对照 同型对照 实验组对照 实验组1 实验组2 实验组3

GLUT4检测 类型细胞 一抗 NC组 无 NC组 IgG2a NC组 ]A组 GLUT4 B组 GLUT4 C组 GLUT4 GLUT4 二抗 #无 空白对照 DyLight 567 同型对照 DyLight 567 DyLight 567 DyLight 567 实验组对照 实验组1 实验组2 DyLight 567 实验组3 目的

（因为IR 和GLUT4同样为鼠源抗体，并且分开进行检测，二抗颜色可进行调试。尽可能选择效果好的同一种二抗。可能使用一绿一红，也可能使用两个同样颜色的二抗）