分子生物学综合实验论文
题 目: 绿色荧光蛋白(GFP)的基因克隆及表达
中国·黄石 2010年12月
绿色荧光蛋白（GFP）基因的克隆与表达
胡丽丹
（湖北师范学院生命科学院0803班 湖北 黄石 43500）
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摘要：绿色荧光蛋白（GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物
体内的生物发光蛋白。用碱裂解法提取的的质粒pEGFP-N3和pET-28α经过BamH I和Not I双酶切连接后，得到pET-28α-pEGFP-N3重组质粒。取部分的重组质粒做酶切实验，验证重组质粒的存在性，剩下的重组质粒导入表达菌E. coLi BL-21大肠杆菌感受态细胞中。重组有GFP基因的E. coLi BL-21，在含有1 μL/mL的卡纳霉素的LB培养基上培养。当A600达到0.7时，用终浓度为0.8 mM的异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导培养3小时，离心得到下层绿蓝色沉淀物即可。
关键词：绿色荧光蛋白 GFP 基因的克隆 荧光蛋白 水母
CLoning and Expression of Green FLuorescent Protein Gene
HU Li-Dan
( Class three Grade eight, College of Life Sciences department,
Hubei Normal university ,Huangshi 435000)
Abstract：Green fluorescent protein（GFP）,one kind of bioluminenscent proteins ,has
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been found existing in the internal of Coelenterates,such as fellyfish,polyp and coral pEGFP-N3 and pET-28α was harvested by sodium dodecylsulfate(SDS) alkaline process extraction and Agarose Gel Electrophoresis.After treating the two targeted plasmids with BamH I and Not I, the recombinant plasmid,namely pET-28α-pEGFP-N3, can be retrieved by furthermore Agarose Gel Electrophoresis. Taking slight recombinant plasmid proves that recombinant plasmid does exist by dienzyme cutting(BamH I and Not I).The recombinant plasmid lefting would be transported to E. coLi BL-21 the competent cells. E. coLi BL-21 containing recombinant GFP gene was grown overnight in LB solid medium containing kanamycin (Final concentration: 1 μL/mL). When absorbance at 600 nm value was 0.7, isopropyL β-D-thiogalactopyranoside was added to 0.8 mM and the incubation was continued an addition 3 h.
Key words: Green fluorescent protein Fellyfish Genetic Cloning Fluorescin
目录
1.前言： ............................................................................................... 1 1.1绿色荧光蛋白（GREEN FLUORESCENT PROTEIN，GFP） ..................... 1 1.1.1 GFP研究背景 ............................................... 1 1.1.2 GFP研究应用 ............................................... 2 1.2基因的克隆与表达 .............................................. 3
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2.实验试剂及实验仪器： ......................................................................... 5 2.1实验试剂与材料： .............................................. 6 2.2实验仪器： .................................................... 7 3.实验方法 ............................................................................................ 7 3.1质粒提取方法: ................................................. 7 3.2琼脂糖凝胶电泳及回收: ......................................... 9 3.3酶切及连接： ................................................. 11 3.4E. COLI DH5Α或E. COLI BL21感受态制备及转入： .................. 12 3.5酶切验证重组质粒： ........................................... 13 3.6GFP基因的表达 ................................................ 14 3.6.1活化菌种 .................................................. 14 3.6.2扩大培养 .................................................. 14 3.6.3 IPTG诱导GFP基因的表达 ................................... 14 4.结果与分析 ....................................................................................... 14 4.1质粒提取过程中现象与结果： ................................... 14 4.2琼脂糖凝胶电泳 ............................................... 15 4.3E. COLI DH5Α或E. COLI BL21感受态制备及转入结果 ： ............. 16 4.4酶切验证重组质粒 ............................................. 16 4.5 GFP基因的表达结果： ......................................... 17 5.讨论： ............................................................................................. 18 5.1提取质粒出现图六的原因是： ................................... 18 5.2琼脂糖凝胶电泳出现图七、图八原因： ........................... 18 5.3 E. COLI DH5Α或E. COLI BL21感受态制备及转入出现图九、十原因: .. 19 5.4酶切验证重组质粒出现图十一原因： ............................. 19 5.5 GFP基因的表达结果如图十二、十三原因： ....................... 19 6.参考文献 .......................................................................................... 20
IV
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前言：
1.1绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）
1.1.1 GFP研究背景
绿色荧光蛋白是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时，GFP 发射绿色荧光[1]。日本科学家下村修 1962年第一次从一种水母中发现了绿色荧光蛋白, 如图一所示。
这种蛋白在紫外线光中呈现绿色, 这种水母体内含有一种生物发光蛋白质——aequorin，但它本身发蓝光,通过对光谱的研究, 下村修提出了发光景水母所发的绿光是因激发的水母素向绿色荧光蛋白
图一：夜晚水母体内GFP显色[4] 发生的荧光能量转移所致。即水母素作为一种能量供体, 而绿
Figure1 Chromogenic GFP in
色荧光蛋白成为能量受体。水母素和绿色荧光蛋白都有重要的
Fellyfish at night[4]
应用, 但水母素是荧光酶的一种, 它需要有荧光素底物, 经过
酶促反应后发光。GFP能把这种光转变成绿色，也就是当水母容光焕发的时候我们实际看到的颜色。其在阳光下呈绿色、 钨丝下呈黄色、 紫外光下呈现强烈绿色[2]。
1987年，道格拉斯•普莱沙（Douglas Prasher）克隆出了GFP的基因序列。1993年，在普莱沙的基础上，马丁•沙尔菲（Martin Chalfie）成功地通过基因重组的方法使得除水母以外的其他生物（如大肠杆菌等）也能产生GFP，这不仅证实了GFP与活体生物的相容性，还建立了利用GFP研究基因表达的基本方法，而许多现代重大疾病都与基因表达的异常有关。至此，生物医学研究的一场“绿色革命”揭开了序幕。
此后，谢尔盖•路基亚诺夫（Sergey A. Lukyanov）又从一种珊瑚中分离出了与绿荧光蛋白类似，但能发出红色光的荧光蛋白，预示着荧光蛋白可以有不同的颜色。美籍华人钱永健（Roger Y. Tsien）系统地研究了绿荧光蛋白的工作原理，。钱永健还对绿色荧光蛋白进行了颜色突变。不同颜色可以同时在同一个细胞或组织内标记多种蛋白或结构。多种颜色的绿色荧光蛋白的出现, 为研究蛋白之间的
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相互作用、蛋白分解等提供了无限的可能性。现在世界各地实验室使用的 GFP , 都是经过改造优化了的, 而钱永健是这方面的先驱和领先人物[2]。
1996 年GFP 的晶体结构被解出，蛋白质中央是一个圆柱形水桶样结构，如图二. 长420 nm，宽240 nm，由11 个围绕中心α螺旋的反平行β折叠组成，荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的，桶的顶部由3 个短的垂直片段覆盖，底部由一个短的垂直片段覆盖，对荧光活性很重要的生色团则位于大空腔内。发色团是由其蛋白质内部第65-67位的Ser-Tyr-GLy自身环化和氧化形成[2]。
图二：GFP晶体结构 图三: 质粒pEGFP-N3[5] Figure2 Crystal structure of GFP Figure3 pEGFP-N3[5]
2001年1月11日，美国科学家宣布培育成世界上首只转基因猴, 这是世界上首次培育成功转基因灵长类动物. 添加在这只名为\"安迪\"的猴子体内的就是这种标志基因。
1.1.2 GFP研究应用
在生物学研究中，科学家们更多的是利用这种能自己发光的荧光分子来作为生物体的标记。将这种荧光分子通过化学方法挂在其他不可见的分子上，原来不可见的部分就变得可见了。生物学家一直利用这种标记方法，把原本透明的细胞或细胞器从黑暗的显微镜视场中“纠出来”。
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但传统的荧光标记在发光的同时，会产生具有毒性的氧自由基，导至被观察的细胞死亡，这叫做“光毒性”。因此，在GFP发现以前，科学家们只能通过荧光标记来研究死亡细胞静态结构。相反，绿色荧光蛋白对生物体无毒无害, 分子量小, 方便构建载体, 同时在多种非水母的生物体中均可稳定表达并易于检测, 所以, 作为一种生物分子标记, 具有广泛的应用前景[ 3]。由于GFP荧光是生物细胞的自主功能, 是一种现成的荧光蛋白质，荧光的产生不需要任何外源反应底物,因此GFP作为一种广泛应用的活体报告蛋白,其作用是任何其它酶类报告蛋白无法比拟的。
本实验是利用实验室提供的质粒pEGFP-N3,其结构如图三所示.其上有所用酶的酶切位点。
1.2基因的克隆与表达
基因克隆（分子克隆molecular cloning）----通过体外重组技术,将一段目的DNA经切割、连接插入适当载体，并导入受体细胞，扩增形成大量子代分子的过程。如下图四所示:
所需元件:限制性内切酶: BamH I和Not I（BamH I的切点为： 5’-G↓GACC-3’ Not I的切点为 5’-GC↓GGCCGC-3’ 3’-CCTAG↓G-5’ 3’-CGCCGG↓CG-5’
载体: E. coLi DH5a（1.易于接纳外源DNA。 2.无特异的内源性核酸内切酶 3.载体复制、扩增不受阻 4.与质粒有互补性)
受体细胞: E. coLi BL-21（1.易于接纳外源DNA。 2.无特异的内源性核酸内切酶 3.载体复制、扩增不受阻 4.与载体有互补性） 目的基因: pEGFP-N3
选择标记基因：pET-28α（同时含有抗kana的基因有助于后面选择，和β-半乳糖苷酶基因可被异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导表达目的基因GFP） 连接：平末端连接（相同酶切产生互补的粘性末端，再通过碱基互补配对连接）
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图四：基因克隆的过程
Figure4 Process of gene cloning
原核基因表达系统（Gene Expression）：
由于目前对原核生物基因结构了解的要透彻一些，所以一般将目的基因导入到原核生物中。将外源基因引入原核细胞，并使其在原核细胞中以发酵形式快速高效地表达、合成基因产物的体系。如图五所示。
为提高GFP表达的效率，我们一般可从以下三个方面考虑： 1.基因水平上:尽量选用受体细菌细胞的偏爱性密码子[6]
2.载体水平上:通过核外质粒构建合适的操纵子、增强子[6],如本实验的β-半乳糖苷酶操纵子基因,故通过异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导表达目的基因GFP表达
3.作为受体细胞上:根据DH5a和E. coLi BL-21结构特点不同,前者对外援质粒扩增阻碍作用很小,故作为克隆菌;后者易于外源基因表达,故选用表达菌。
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图五：基因克隆与表达
Figure5 Gene cloning & expression
本实验是应用已学过的分子知识和查阅一些参考文献，来设计老师给定的实验课题。第一，是学习运用科学理论知识指导设计实验使用方法；第二，学习科学严谨的实验操作；第三，查阅文献了解并学习了绿色荧光蛋白基因（GFP）相关特性和研究进展，巩固理论知识的同时也开拓了我们的视野。
本实验我们做了以下工作：将绿色荧光蛋白基因（GFP）插入pET-28α构建pET-28α- pEGFP-N3重组质粒，将重组质粒导入E. coLi DH5α扩增，用碱法提取质粒。核酸电泳检测质粒是否成功导入大肠杆菌，再酶切鉴定所提取质粒是否为重组质粒。将提取的质粒导入E. coLi BL-21感受态中，经IPTG诱导目的基因表达产生绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein,GFP ）。
本试验通过做实验过程中，王老师细心地指导及斧正以及同组同学的协商配合，最终实验结果大抵让人满意。在表达菌E. coLi BL-21中表达了我们期望的结果——绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein,GFP ）。但此试验在LB培养基平板上生长效果不是很好，酶切效果也不是那样完美，在以后的实验设计中要进一步完善这两部分的工作。
2.实验试剂及实验仪器：
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2.1实验试剂与材料：
1.克隆菌株E．coLi DH5α(8311实验室提供) 2.表达菌株E．coLi BL21(8311实验室提供)
3.LB培养基：10 g胰蛋白胨、5 g酵母提取物、10 g氯化钠，溶于950 mL中，用NaOH调节pH至7.0，补加蒸馏水至总体积为1 L，分装后高压蒸汽灭菌。（对于固体培养基加入10-15 g琼脂粉后再加热灭菌）
4.溶液Ⅰ: 50 mM葡萄糖，25 mM Tris-HCL(pH 8.0)，10 mM EDTA(pH 8.0）。1 M Tris-HCL(pH 8.0）12.5 mL，0.5 M EDTA（pH 8.0）10 mL，葡萄糖4.730 g，加ddH2O至500 mL。在10 Lbf/in2高压灭菌15 min ，贮存于4 ℃。
5.溶液Ⅱ：0.2 M NaOH，1% SDS。2 M NaOH 1 mL，10%SDS 1 mL，加ddH2O至10 mL。使用前临时配置。
6.溶液Ⅲ：醋酸钾（KAc）缓冲液，pH 4.8。5M KAc 300 mL，冰醋酸 57.5 mL，加ddH2O至500 mL。4 ℃保存备用。
7.TE：10mM Tris-HCL(pH 8.0)，1 mM EDTA(pH 8.0)。1 M Tris-HCL（pH 8.0）1 mL，0.5 M EDTA（pH 8.0）0.2 mL，加ddH2O至100 mL。15 Lbf/in2高压湿热灭菌20 min，4 ℃保存备用。 8.氯仿（1:1）
9.乙醇（无水乙醇、70%乙醇）
10.50×TAE：Tris 碱54 g，硼酸27.5 g，EDTA-Na2·2H2O 4.65 g，加ddH2O 至1000 mL。15 Lbf/in2高压湿热灭菌20 min，4 ℃保存备用。 11.溴化乙锭（EB）：10 mg/mL
12.RNase A（RNA酶A）：不含DNA酶(DNase-free) RNase A的10 mg/mL，TE配制，沸水加热15 min，分装后贮存于-20℃。
13. 6×Loading buffer（上样缓冲液）：0.25% 溴酚蓝，0.25% 二甲苯青FF，40%（W/V）蔗糖水溶液。
14.0.8% 琼脂糖凝胶：称取0.4 g琼脂糖于三角烧瓶中，加50 mL 1×TAE，电热套加热至完全溶化，冷却至60 ℃左右，轻轻摇匀。缓缓倒入架有梳子的电泳胶板中，勿使有气泡，静置冷却30 min以上，轻轻拔出梳子，放入电泳槽中（电
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泳缓冲液1×TAE），即可上样。
15.双酶切体系：DNA sampLe 8 μL, BamHI 0.5mL（大连宝生物公司提供）, Not I 0.5mL（大连宝生物公司提供）,BufferH 2 mL,Triox-100(0.1%) 1uL,BSA(0.1%) 1 μL, ddH2O 6 μL
16.10×Buffer H：100 mM Tris-HCL PH7.5,100 mM MgCL2,10 mM Dithiothreiol 500 mM NaCL 17.0.1 M CacL2
18.IPTG，kana固体粉末
2.2实验仪器：
ORION pH计（上海公司）,HD-3紫外检测仪（日本有限公司） GL-2M型冷冻离心机（湖南星科仪器有限公司） 雪山制冰机（北京长洋科学仪器公司）
超纯水机AYJ1-0501-U（颐洋企业发展有限公司） 电泳仪DYY-5（北京市六一仪器厂）
电子天平TE412-L，TE2101-L，CP64（德国Satorins公司） BS-1E振荡培养箱(江苏省金坛市亿通电子仪器厂)
高压灭菌锅YXQ-LS-50S（上海博迅有限公司），手持式紫外灯 双面紫外超净工作台（苏州净化设备有限公司）,电热套 3.实验方法
3.1质粒提取方法:
方法分别有以下几种：碱裂解法；煮沸裂解；羟基磷灰石柱层析法，质粒DNA释放法；酸酚法等。概括起来主要是用非离子型或离子型去污剂、有机溶剂或碱进行处理及用加热处理。所有分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离质粒DNA(有时还要求纯化质粒DNA，根据实验所需)
• 选择哪一种方法主要取决于以下几个因素：质粒的大小、大肠杆菌菌株、裂
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解后用于纯化的技术和实验要求。对于本实验要求提出大量的质粒，且为使操作简便故选用SDS碱裂解法。其基本原理：
（1）当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不复性而呈絮状，离心时可沉淀下来。
（2）在一定电场强度下，DNA分子的迁移取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型(相对分子质量不同的DNA片段泳动速度不一样)，且DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。因此，凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的DNA，也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子：其中超螺旋结构泳动最快，其次为线性结构，最慢的可能是复制中间体（没有复制完的两个质粒连在一起），而不是开环结构（用EcoRI来线性化质粒后再进行琼脂糖电泳，就会看到线性质粒DNA的位置与这三条带的位置不一样） 其具体操作步骤如下：
1. 挑取LB固体培养基上生长的单菌落，接种于20 mL LB（含Kana1μL /mL）液体培养基中，37 ℃、200rmp振荡培养过夜（约14h）。
2. 取1.5mL培养液倒入1.5 mL eppendorf管中，10000rmp离心1min。弃上清，将离心管倒置于卫生纸上，使液体尽可能流尽。
3、菌体沉淀重悬浮于200 μL溶液Ⅰ中, (需剧烈振荡，使菌体分散混匀。)室温下放置3 min。
4、加入新配制的溶液Ⅱ300 μL，盖紧管口，快速温和颠倒eppendorf管数次，以混匀内容物(千万不要振荡)，冰浴3 min。
5、加入200 μL预冷的溶液Ⅲ，盖紧管口，将管温和颠倒数次混匀，见白色絮状沉淀，可在冰上放置3min。 12000rmp离心3min。溶液Ⅲ为中和溶液，此时质粒DNA复性，染色体和蛋白质不可逆变性，形成不可溶复合物，同时K+使SDS-蛋白复合物沉淀。
6、上清液500 μL移入干净eppendorf管中，加入等体积的酚/氯仿，振荡混匀, 12000rmp离心10min。（500 μL的苯酚/氯仿/异戊醇。）
7、小心移出上清于一新微量离心管中，加入2倍体积预冷的无水乙醇，混匀，室温放置 2-5min，离心10000rmp×2min。
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8、弃上清，将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出，加入1mL 70％乙醇洗沉淀一次，10000rmp离心10 min。
9、 吸除上清液，将管倒置于卫生纸上使液体流尽，室温干燥。 10、将沉淀溶于20 μL TE缓冲液(pH8.0储于-20℃冰箱中。) •
3.2琼脂糖凝胶电泳及回收:
实验原理：琼脂糖凝胶电泳的原理概述 琼脂糖是由琼脂分离制备的链状多糖。其结构单元是d-半乳糖和3，6-脱水-L-半乳糖。许多琼脂糖链依氢键及其它力的作用使其互相盘绕形成绳状琼脂糖束，构成大网孔型凝胶。影响DNA在琼脂糖凝胶中迁移速率的因素主要有：（1）DNA分子的大小 双链DNA分子在凝胶基质中迁移的速率与其碱基对数的常用对数成反比。分子越大，迁移的越慢，因为摩擦阻力越大，也因为大分子通过凝胶孔径的效率低于较小的分子。（2）琼脂糖浓度 给定大小的线状DNA片段在不同浓度的琼脂糖凝胶中迁移速率不同。在DNA电泳迁移速率的对数和凝胶浓度之间存在线性相关。（3）DNA的构象 超螺旋环状（Ⅰ型）、切口环状（Ⅱ型）和线状（Ⅲ型）DNA在琼脂糖凝胶中以不同速率迁移。其相对迁移速率主要取决于琼脂糖凝胶的浓度和类型，其次是电流强度、缓冲液离子强度和Ⅰ型超螺旋绞紧的程度或密度。一些条件下，Ⅰ型DNA比Ⅲ型迁移得快；在另一些条件下，顺序可能相反。（4）所用的电压 低电压时，DNA片段迁移率与所用的电压成正比。电场强度升高时，高分子量片段的迁移率遂不成比例的增加。所以，当电压增大时琼脂糖凝胶分离的有效范围反而减小。要获得大于2kb DNA片段的良好分辨率，所用电压不应高于5-8V/cm。（5）电泳缓冲液 DNA的泳动受电泳缓冲液的组成和离子强度的影响。缺乏离子则电导率降低，DNA或者不动或者迁移很慢。高离子强度时（如10×buffer），电导率升高，使得应用适中的电压也会产生大量的热能，最严重时凝胶会熔化，DNA变性。
具体操作步骤：
1. 1.0.8%琼脂糖凝胶的配制：精确称取0.4 g琼脂糖加到三角瓶中，加50 mL
1×TAE缓冲液于三角瓶中，于微波炉中加热至完全熔化，冷却至60 ℃左右，
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2. 用蒸馏水将制胶模具和梳子冲洗干净，放在制胶平板上，封闭模具边缘，架
好梳子；
3. 轻轻旋转琼脂糖凝胶以充分混匀凝胶溶液，倒入电泳槽中，待其凝固； 4. 室温下45分钟后凝胶完全凝结，小心拔出梳子，将凝胶安放在电泳槽内； 5. 向电泳槽中倒入电泳缓冲液，其量以没过胶面1mm为宜，如样品孔内有气
泡，应设法除去；
6. 在DNA样品中加入10×体积的载样缓冲液（Loading buffer），混匀后，用枪
将样品混合液缓慢加入被浸没的凝胶加样孔内；
7. 接通电源，红色为正极，黑色为负极，切记DNA样品由负极往正极泳动 (靠
近加样孔的一端为负)。一般100V电压，电泳40min即可； 8. 根据指示剂泳动的位置，判断是否终止电泳；
9. 电泳完毕，关上电源，在凝胶成像仪上观察电泳带及其位置，并与核酸分子
量标准Marker比较被扩增产物的大小。
10. 同原质粒一起琼脂糖凝胶电泳鉴定回收片段。根据亮度可以估计回收的量。 11. 待回收的DNA段经电泳分离后，从琼脂糖凝胶上切下所需DNA段，放在
1.5 mL EP管中；
12. 加入3 倍（请准确估量凝胶的体积）体积的溶胶液（以100 μL 体积胶加入
300 μL溶胶液为一次标准反应），室温下放置5分钟或50℃ 保温3分钟，其间轻摇EP管几次使胶完全融化；
13. 加入10 μL玻璃奶（玻璃奶使用前请充分摇匀），颠倒混匀，冰浴下放置10
分钟。每隔2~3分钟混匀一次，12000rpm离心30秒，吸弃上清； 14. 加250 μL漂洗液（浓缩漂洗液使用前，按浓缩漂洗液：无水乙醇= 3：7配
制成工作浓度），用加样器吹打漂洗液，轻柔地将玻璃奶悬浮混匀，12000rpm离心30 秒，吸弃上清；
15. 重复步骤4（尽量吸尽漂洗液）。吸取完漂洗液后再离心10秒钟，用Tip头
将最后一点儿漂洗液吸干净。然后，放置于37℃烘箱干燥直至沉淀呈白色，约15~20分钟；
16. 加适量洗脱缓冲液即无菌水（20 μL为一次标准反应），混匀，60 ℃水浴5分钟，12000rpm离心1分钟，回收上清备用。重复步骤6，能提高回收率。
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3.3酶切及连接：
实验原理：迄今已发现了3000多种限制性内切酶。传统上将限制性内切酶按照亚基组成、酶切位置、识别位点、辅助因子等因素划分为三大类。II型酶在其识别位点之中或临近的确定位点特异地切开DNA链。它们产生确定的限制片段，因此是三类限制性内切酶中唯一用于DNA分析和克隆的一类。
II型限制性内切酶中最普遍的是象EcoR I、Hind III、BamH I和Not I这样在识别序列中进行切割的酶。这一类酶是构成商业化酶的主要部分。大部分这类酶都以同二聚体的形式结合到DNA上，因而识别的是对称序列；但有极少的酶作为单聚体结合到DNA上，识别非对称序列。一些酶识别连续的序列（如EcoR I识别GAATTC；Hind III识别AAGCTT;Bam HI识别G↓GATCC; Not I识别GC↓GGCCGC）；而另一些识别不连续的序列（如BgL I识别GCCNNNNNGGC）。限制性内切酶酶条链断裂的位置酶切后产生末端；构
的中心，产生平末端，如Hae III酶切后产
5’-GG↓CC-3’
3’-CC↓GG-5’。
5’-G↓AATTC-3’ 3’-CTTAA↓G-5’
切DNA后形成两种类型的末端：(i)两是交错地，产生粘性末端，如EcoR I(ii)两条链的断裂位置处在一个对称结
生
DNA连接酶能够催化在两条DNA链之间形成磷酸二酯键，这种酶需要在一条DNA链的3’-末端具有一个游离的羟基（-OH），和在另一条DNA链的5’-末端具有一个磷酸基团（-P）。
反应体系选平衡液，依据查阅内切酶供应商在目录后的附录中提供的各种酶在不同buffer中的活力表，如果有一种buffer能同时使2种酶的活力都超过70%的话，就可以用这种buffer作为反应buffer。对于本实验所用的酶为BamH I和Not I在bufferH均有最高酶活性。
5’ 3’
Ligase 3’ 5’
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具体操作步骤：
按如下双酶切体系（30 μL）混合 ：
反应物（μL） 质粒 BamH I Not I 10×bufferH
pEGFP-N3 pET-28a 18 2 2 3
18 2 2 3 3
0.1%BSA缓冲液 3
1.离心10s，混匀。 2.37℃水浴酶切3h。
3.配制1.0%（M/V）普通琼脂糖凝胶30mL。
4.适当放置冷却，45℃左右倒于电泳胶板上，插好梳子。 5.待凝胶凝固好以后，拨下梳子。
6.酶切样品中加入5 μL溴酚蓝-GeneFinder混合液混匀，上样。 7.在1×TAE Buffer，80V(3-4V/cm)下电泳30min
8.回收连接好的目的基因，依次加入5 μL回收纯化的pET-28a质粒,GFP基因片段12 μL，T4连接酶1μL，缓冲液（10×）2 μL
3.4E. coLi DH5α或E. coLi BL21感受态制备及转入：
实验原理:感受态就是细菌吸收转化因子的生理状态，只有发展为感受态的细胞才能稳定摄取外来的DNA分子。受体细胞经过一些特殊方法（如：电击法，CaCL2等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许带有外源DNA的载体分子进入的感受态细胞。
目前常用的感受态细胞制备方法有CaCL2 法，简便易行，且其转化效率完全可以满足一般实验的要求，制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15％的无菌甘油于-70℃保存(半年)，因此CaCL2法为使用更广泛。
将正在生长的大肠杆菌细胞在0℃下加入到低渗的CaCL2溶液中，便会使细胞膜的透性发生改变，此时的细胞即呈现为感受态。这一方法可以用于批量制备感受态细胞，其转化效率可达到5×106-2×107个转化克隆子/μg超螺旋质粒DNA。
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制备好的大肠杆菌感受态细胞可在-70℃冻存。
在0℃下外源DNA可吸附到感受态细胞表面，短时间的热刺激（42℃，90s）诱导细胞吸收DNA。
转化了质粒DNA的大肠杆菌随后在培养基中37℃培养1h，可使质粒DNA中编码抗生素抗性的基因得以表达，因此，转化了质粒DNA的大肠杆菌细胞可在含有相应抗生素的培养基上生长，而没有转化的细胞则无法生长。 具体实验操作步骤：
用枪头挑一大肠杆菌E.coLi DH5α或BL21单菌落放入2 mL LB液体培养基（含Kana 1 μL/mL），37 ℃培养过夜。
（1） 活化大肠杆菌：取4mL新鲜的LB液体培养基加入80 μL的过夜菌，培养3
个小时。
（2） 将昨夜摇出来的E.coLi DH5α或BL21培养液转入离心管中,冰上放置10min,
然后于4 ℃下4000rpm离心5min。
（3） 弃去上清,用预冷的0.1mol/L 的CaCL2溶液600μL轻轻悬浮细胞,冰上放置
20 min, 4℃下4000rpm离心5min。
（4） 弃去上清,加入300 μL预冷的0.1mol/L的CaCL2 溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放
置5min,即成感受态细胞悬液，可-80℃长期保存。
（6） 取2个无菌离心管，分别加入100 μLDH5α感受态细胞悬液，第1管加5 μL
无菌水，第2管加入质粒DNA溶液5 μL,轻轻摇匀,冰上放置30min。 （7） 42℃水浴中热激90s,热激后迅速置于冰上冷却5min。
（8） 分别向管中加入400 μL LB液体培养基,混匀后在37℃振荡培养60min。 （9） 从管1中取100 μL涂布于含抗生素,从管2中取100 μL涂布于含抗生素的平板上。正面向上放置约10分钟,待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿,37℃培养14小时。 3.5酶切验证重组质粒：
原理：经同种酶切后（BamH I和Not I），重组质粒从新被切开，经琼脂糖凝胶电泳后，在紫外分析仪下看其跑过的胶图，进行分析。 实验步骤：
按如下双酶切体系（20 μL）混合 ：
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提取E.coLi DH5α中的重组质粒，在下列体系下反应
反应物（μL） 质粒 BamH I Not I 10×bufferH 0.1%BSA缓冲液 Triox-100(0.1%) BSA(0.1%) ddH2O pET-28α-pEGFP-N3 8 500 500 2000 3 1 1 6 水浴2h后，经过琼脂糖凝胶电泳。
3.6GFP基因的表达 3.6.1活化菌种
用黄色枪头蘸取表达菌E.coLi BL21种单菌落，连同枪头一起垂直放入装有2 mL的LB液体培养基的试管（含有卡那青霉素，其工作浓度为1μL /mL）中。于37 ℃摇床振荡培养14小时。 3.6.2扩大培养
将试管中活化的80µL菌液接种到4 mL LB培养基，同时加入卡那青霉素（终浓度1μL /mL）培养基于37 ℃恒温培养箱中培养3小时。 3.6.3 IPTG诱导GFP基因的表达
实验中在不同的培养时间（用OD值表征菌体密度）加入IPTG诱导表达发现，当OD=0.8时，加的 IPTG至终浓度为0.8mM时GFP的表达量达到最大
4.结果与分析
4.1质粒提取过程中现象与结果：
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阶段 溶 液I 溶 液Ⅱ 溶 液Ⅲ: 氯 仿 现象EP管中溶EP管中出EP管中溶加入氯仿液为混浊现上层变液溶液有离心后溶液。 澄清，下层絮状物产液分层 沉淀 生 图表六 3-1碱法提质粒过程中的现象 Figure6 sodium dodecylsulfate(SDS) alkaline process extraction 结果分析:
加入溶液Ⅰ的作用是维持细胞渗透压，使细胞悬浮在溶液中，故呈现浑浊；加入溶液Ⅱ作用使细胞裂解，释放内涵物，内含物溶于溶液，故上层变澄清； 加入溶液Ⅲ作用是时变性的质粒在酸盐环境下从新复性，但大量基因组DNA不能复性，在PDS作用下产生絮状沉淀。 加入氯仿破坏了蛋白质，使其变性沉淀。
4.2琼脂糖凝胶电泳
如图七所示电泳结果图可以看到，第一孔道和第九孔道跑的带在紫外分析仪下,明显跑带量少,效果不如其余七条带。中间几条带总共出现五条带如图八，条带1 最为明亮，说明第一条带出所含的核酸物质最多。大肠杆菌中RNA的拷贝数远大于质粒DNA的拷贝数，而核酸电泳分析过程的实验操作过程中没有加入RNase降解所制样品中含有较多的RNA，所以判断该条带一定为RNA。提取的质粒多数以超螺旋型存在，超螺旋的质粒DNA中一个螺旋由10个碱基组成，当分子上有一个缺刻时，分子会立即松弛，形成开环分子。如果质粒的双链配对处都断裂则形成线性质粒。分子量相同的情况下，可以判定：条带2为超螺旋DNA，条带3为线性DNA，条带4为开环DNA，条带5可能为线性DNA，超螺旋DNA，开环DNA中的两者或是三者缠在一起未得到分离。
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图七：琼脂糖凝胶电泳九条孔道电泳 Figure7 All channels in Agarose Gel El
ectrophoresis
图八：琼脂糖凝胶电泳中间七条孔道电泳图
Figure8 Seven channels amid Agarose
Gel Electrophoresis
4.3E. coLi DH5α或E. coLi BL21感受态制备及转入结果 ：
管1中取100 μL无菌水涂布于含抗生素LB平板结果如图九为：LB平板未生长任何菌落;管2中取100 μL重组质粒涂布于含抗生素的平板上结果如图十为：生长少量菌落; 分析：管1做空白对照，表明在含抗生素的培养基上无法生存任何自然条件菌落； 管2实验组，表明重组质粒能表达某种蛋白物质，使重组均在此环境能生存。
图九：空白对照管 1 Figure 9 Negative contrast 4.4酶切验证重组质粒
图十：实验组管2
Figure 10 Experimental group
如图十一所示所有孔道，其中第七八孔道是浓度不同的Maker蛋白。其余九条孔道为实验酶切的带。两条Maker蛋白明显可见六条带，而实验组的带型都很模糊。已知pEGFP-N3的分子量为4700bp,而pET-28a分子量为5369 bp，故在相
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绿色荧光蛋白（GFP）基因的克隆与表达
同的构型下，pEGFP-N3应比pET-28a跑的快一些。图中所示的六条带，有上述原理可以判断为：条带1 pEGFP-N3超螺旋DNA，条带6pET-28α开环DNA，剩下带2、3、4、5难以准确判断，但线性pEGFP-N3肯定在环形 pEGFP-N3之前，超螺旋pET-28α也肯定在线性pET-28α之前的。
图十一：酶切验证质粒
Figure11 Validate plasmid via enzyme-cutting
4.5 GFP基因的表达结果：
加入IPTG诱导后，可观察到菌体细胞呈现绿色如图十二所示，说明目的基因在表达菌E. coLi BL21中表达。如图十三所示在紫外光下可以观察到菌体细胞发绿色荧光。
基因在表达菌内表达 Figure12 GFP gene expression in E. coLi BL21
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图十二：GFP
图十三：GFP在紫外光照射下
Figure13 GFP exhibites green fluorescent under ultraviolet light
绿色荧光蛋白（GFP）基因的克隆与表达
5.讨论：
5.1提取质粒出现图六的原因是：
1. 加入溶液Ⅰ的作用是制备菌悬液，加入葡萄糖的作用是使悬浮后的大肠杆菌
不会快速沉积到管子的底部，所以观察到得溶液呈乳白浑浊状；
2. 加入溶液Ⅱ的作用是使细胞破裂，蛋白质和细胞壁沉淀，质粒溶出，NaOH
是最佳的溶解细胞的试剂，它使细胞膜发生了从biLayer（双层膜）结构向miceLLe（微囊）结构的相变化导致细胞溶解，因此观察到有大量白色絮状沉淀；
3. 加入溶液Ⅲ的作用是使大肠杆菌基因组DNA沉淀，SDS遇到钾离子后变
成 PDS，而PDS是水不溶的，基因组DNA较长因此发生了沉淀，因此观察溶液较为澄清；
4. 氯仿为有机溶剂可以使蛋白质变性，进一步除去初提质粒中的蛋白质沉淀，
氯仿不溶于水，所以观察到分层现象 5.2琼脂糖凝胶电泳出现图七、图八原因：
1. 核酸电泳图谱中凝胶的最前端条带较亮，说明该处有较多的核酸物质，而在
质粒提取分析过程的实验操作过程中没有加入RNase降解所制样品中含有较多的RNA（由E. coLi DH5a转录产生），所以判断该条带一定为RNA，但是由于电泳的时间不够，导致不同大小的RNA未分开。
2. 第一孔道和第九孔道条带没有其他孔道的核酸物质得多，条带不明显。分析
可能的原因是，第一孔道最先上样，而总共有九个道操作时间过长导致开始电泳时孔道中的样品已经发生扩散，所以导致电泳时条带不明显，而第九孔道上样是样品还未来得及在重力作用下进入孔道，电源就一接通，致使部分质粒样品在缓冲液分子的作用下，扩散到缓冲液中，所以导致电泳时条带不明显
3. 第一孔道由于样品时间放置过长后扩散，仅仅观察1条带，且为条带2，为
超螺旋型质粒，因为一般提取的超螺旋质粒占总量的70%以上，所以在样品量较少的情况下仅可观察到超螺旋质粒条带。第九孔道由于样品还未进孔道，在缓冲液的作用下，可观察到条带4、5，可能为环形或是混合构型的质粒，已知相同环境下，超螺旋型质粒和环形质粒运动的阻力要小一些，故很容易在电源接通条件下被扩散出去，所以观察到仅为条带4、5
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绿色荧光蛋白（GFP）基因的克隆与表达
5.3 E. coLi DH5α或E. coLi BL21感受态制备及转入出现图九、十原因: 管1中取100 μL无菌水涂布于含抗生素平板未长菌的原因是：抗生素kana能够抑制自然条件下一般细菌的生长,结果未长菌正好对照管2长菌是目地菌。 从管2中取100 μL涂布于含抗生素的平板上长少量菌的原因可能是： 1.目地基因在表达菌EcoLi BL21中得到，故其能在抗生素kana平板上生长 2.少量菌的原因为感受态制备过程中，由于时间和温度把握不充分，一些重组质粒未进入细胞中，故细菌未得到重组质粒，或是部分质粒被E. coLi BL21体内的酶机制降解了，故都无法在目地菌中表达抗Kana的蛋白故无法生长。 3.在加入氯仿后，按照预计现象应该是透明的水层在上，浑浊稠密的有机层在下方，且目的质粒在上层中。但实际操作中可能由于氯仿的比重或是溶液放置时间过长，致使有机层密度小于水层，故质粒分布在上层有机层中。但我们组操作时因不慎震动摇晃了。
5.4酶切验证重组质粒出现图十一原因： 实验组的九条孔道跑带都不清晰的原因可能是：
1. 用于酶切的重组质粒DNA含量太少或者是浓度低，所以没有maker蛋白显
带那么亮。
2. 电泳时间太短，致使已经酶切分离的质粒，在实验时间内还未来得及分开。 3. 提取的质粒含有一些杂质，而这些杂质可以堵塞孔道，致使质粒无法在电泳
胶上顺利跑开，所以看到的质粒未分开。
4. 水浴酶切反应时间不足，质粒还没在酶的作用下充分反应，故看到的重组质
粒没切开。
5.5 GFP基因的表达结果如图十二、十三原因：
重组质粒pET-28a-pEGFP-N3在IPTG的诱导下，GFP 基因没有物种特异性，在原核细胞中能获得了成功表达，大量表达对细胞没有毒性成功在E. coLi BL21体内得到表达，故使E. coLi BL21呈现出黄绿光，在紫光光照射下，呈现强烈绿色。
对于本次综合性实验，所运用的实验条件并没有硬搬一般文献上给定的数据，如再进一步提纯质粒浓度时（文献中是酚氯仿[7]，而实验室用的是酚氯），离心的转速（文献是8000rpm[7]，而试验中统一为10000rpm）、而使用仅有离心机
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绿色荧光蛋白（GFP）基因的克隆与表达
不具有是温度保持在要求范围内）等,我们以实验室的现有条件为基础,成功的构建出了含有绿色荧光蛋白的报告基因。
实验中得到的结果，也存在与理论不一致的地方，如在加入酚氯仿之后，应该是上层为水层，但实验观察到的下层为水层，此处为避免出错，实验中本小组上下液层各取了一eppendorf管，并分别进行了后续试验，图七证明了结果质粒的确在上层的有机层，而不是课本所说在上层水层。由此说明对于参考文献，我们应该怀有一种批判的心里对待，在实验室要有严谨的科研素养，以实验为中心，相信实验结果。
6.参考文献
[1]吴世康. 2009. 绿色荧光蛋白质 ( GFP) 的发现、 表达和发展. 影像科学与光化学, 27 ( 1) : 69~ 78
[2]朱昀 李朝炜(河北科技大学生物科学与工程学院 石家庄) .绿色荧光蛋白 [3]崔志芳, 邹玉红, 季爱云. 2008 . 绿色荧光蛋白研究的三个里程碑! ! ! 2008年诺贝尔化学奖简介. 自然杂志, 30( 6) : 324~ 328
[4] Dr. Robert E. Campbell, University of Alberta, CANADA. Campbell (2008), Scholarpedia, 3(7):5410.
[5]Novagen.ORDERING 800-526-7319.TECHNICAL SUPPORT 800-207-0144 [6]陈伟伟, 郭正红, 康升云, 魏兰珍, 王全喜. (上海师范大学 生命与环境科学学院, 上海 200234) . 增强型绿色荧光蛋白在集胞藻6803中的表达 [7]魏春红、李毅·现代分子生物学实验技术·高等教育出版社，2006:1-44；
鸣谢：很感谢指导老师王友如，给予我精辟的理论和熟谙的实践指导，是我受益匪浅！同时感谢同学宜佳，丁佐彬友好的合作帮助！
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