带电粒子在电场中向着与其本身所带电荷相反的电极移动的过程称为电泳。 电泳方法按其使用的支持体的不同，可以分为： 纸电泳 薄层电泳 薄膜电泳 凝胶电泳
等电聚焦电泳
颗粒在电场中的移动速度主要决定于其本身所带的净电荷量，同时受颗粒形状和颗粒大小的影响。
此外，还受到电场强度、溶液pH值、离子强度及支持体的特性等外界条件的影响。 1）电场强度是指每厘米距离的电压降。
根据电场强度的大小可将电泳分为高压电泳（20～200 V/cm ）和常压电泳（2～10V/cm ）。
2）溶液的pH值: 溶液的pH值决定了溶液中颗粒分子的解离程度，也就是决定了颗粒分子所带净电荷的多少。
3）溶液的离子强度: 溶液的离子强度越高，颗粒的泳动速度越慢。一般电泳溶液的离子强度为0.02～0.2 较为适宜。
4）电渗: 在电场中， 溶液对于固体支持物的相对移动称为电渗。 此外，缓冲液的粘度和温度也对颗粒的泳动速度有一定影响。
酶学研究中，电泳主要用于：酶的纯度鉴定、酶分子量测定、酶等电点测定、少量酶的分离纯化。
1、凝胶电泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳）
是以具有网状结构的多孔凝胶（聚丙烯酰胺）为支持体，不同电荷、不同大小生物大分子在电场的作用下，发生迁移，具有电泳和分子筛的双重作用，即迁移率取决于所带电荷和分子大小形状。
丙烯酰胺为单体，甲叉双丙烯酰胺为交联剂，在化学催化剂（过硫酸铵和四甲基乙二胺—TEMED）或光聚合催化剂（核黄素）的作用下，聚合而成。
单体（聚丙烯酰胺）浓度越高，凝胶孔径越小；交联剂浓度越大，凝胶孔径越小。 PAGE常用于鉴别蛋白的纯度。 2、SDS-凝胶电泳
在聚丙烯酰胺凝胶制备时，加入1-2%的十二烷基硫酸钠（SDS），即成SDS-聚丙烯酰胺凝胶。当蛋白质溶液中加入SDS和巯基乙醇后，蛋白质分子在SDS-凝胶电泳中的迁移率主要取决于分子量大小，而与分子形状和所带电荷无关。 常用于鉴别蛋白质的分子量。
蛋白质溶液中加入SDS和巯基乙醇后，巯基乙醇使蛋白中的二硫键还原而打开，SDS使蛋白质的氢键、疏水键破坏，使蛋白质变性解聚。
在一定条件下，1.4gSDS与1g蛋白质或亚基结合，形成SDS-蛋白质复合物。 由于SDS为阴离子带负电荷，SDS-蛋白质复合物上的大量阴离子掩盖了蛋白质之间电荷的差别；
SDS与蛋白质结合后，引起蛋白质构象的变化，在水溶液中都变成了长椭圆形，其短轴长度都为18A左右，而其长轴长度与蛋白质分子量成正比，因此蛋白质的迁移率只与分子量大小有关。 SDS-凝胶电泳
3、等电聚焦电泳(IEF-PAGE)
原理：利用各种蛋白质pI不同，以聚丙烯酰胺凝胶为电泳支持物，并在其中加入两性电解质载体，两性电解质载体在电场作用下，按各自pI形成从阳极到阴极逐渐增加的平滑和连续的pH梯度。
在电场作用下，蛋白质在此pH梯度凝胶中泳动，当迁移至pH值等于pI处时，就不再泳动，而被浓缩成狭窄的区带。 两性电解质
是许多异构和同系物的混合物，是一系列多羧基多氨基脂肪族化合物，分子量在300~1000之间。其pH分布在2.5~10之间。在制备聚丙烯酰胺凝胶时，将其混溶其中。
两性电解质特点：
1)易溶于水，在pI处应有足够的缓冲能力，形成稳定的pH梯度，不致被蛋白质或其它两性电解质改变pH梯度。
2)在pI处应有良好的电导及相同的电导系数，以保持均匀的电场。 3)分子量小，可通过透析或分子筛法除去，便于与生物大分子分开。
4)化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，也无变性作用，其化学组成不同于蛋白质。
十、萃取分离
萃取分离是利用物质在两相中的溶解度不同而使其分离的技术。
萃取分离中的两相一般为互不相溶的两个液相。有时也可采用其它流体。
按照两相的组成不同，萃取可以分为有机溶剂萃取、双水相萃取、超临界萃取和反胶束萃取等。 1、有机溶剂萃取
用于萃取的有机溶剂主要有乙醇、丙酮、丁醇、苯酚等。例如，用丁醇萃取微粒体或线粒体中的酶；用苯酚萃取RNA等。
由于有机溶剂容易引起酶蛋白和酶RNA的变性失活，所以在酶的萃取过程中，应在0~10℃的低温条件下进行，并要尽量缩短酶与有机溶剂接触的时间。 2、双水相萃取
是利用溶质在两个互不相溶的水相中的溶解度不同而达到分离的萃取技术。
将两种不同的水溶性聚合物的水溶液混合时（或者是某种聚合物溶液和盐溶液），当聚合物浓度达到一定值（阈水平Threshold level）， 体系会自然的分成互不相混溶的两相，这就是双水相体系。
此两相中任何一相都含有较高的水分。细胞碎片、多糖、核酸以及酶的性质不同，在两相中的分配情况亦不同，在多数情况下，酶可与这些杂质迅速而有效地分离。 双水相形成原因
由于高聚物之间的不相溶性，即高聚物分子的空间阻碍作用，相互无法渗透，不能形成均一相，从而具有分离倾向，在一定条件下即可分为二相。
一般认为只要两聚合物水溶液的憎水程度有差异，混合时就可发生相分离，且憎水程度相差越大，相分离的倾向也就大。 各种双水相系统 双水相的形成
1、相图为一条双曲线，在双曲线上方溶液可形成分离的两相；在下方则为均相。
2、C—临界点；两相的组成和体积相同，分配系数为1，加入极少量的水，即可导致分离的两相转为均相。
T—上相的组成；B—下相的组成；T1，T2，T3…B1，B2，B3…称为节点。连接节点的线称为双节线。
3、同一双节线上任何一点的上相和下相组成相同，分配系数相同，但相体积不同。 相图是选择形成分离两相所含多聚物或盐的含量的依据。
影响物质分配的因素 两相组成；
高分子聚合物分子量，浓度，极性。 两相溶液比例；
盐类(包括离子的类型和浓度，离子强度，pH值)。
溶质的物理化学性质(酶分子量，电荷，极性，等电点)。 体系的温度，pH值等。
这些参数并不是独立地起作用，而是相互作用的。 3、超临界萃取
超临界萃取又称为超临界流体萃取，是利用欲分离物质与杂质在超临界流体中的溶解度不同而达到分离的一种萃取技术。
物质在不同的温度和压力条件下，可以以不同的形态存在，如固体(S)、液体(L)、气体(G)、超临界流体(SCF)等。
超临界流体作为萃取剂需具备的条件：
稳定性好，无腐蚀性 临界温度不能太高或太低 临界压力不能太高 选择性好，溶解度高 容易获得，价格便宜
某些超临界流体的超临界点和超临界密度
根据分离方法的不同，分离工艺过程可以分为3种： 等压分离 等温分离 吸附分离
还可以添加少量辅助溶剂（夹带剂） 4、反胶束萃取
反胶束萃取是利用反胶束将酶或其他蛋白质从混合液中萃取出来的一种分离纯化技术。
反胶束，又称为反胶团，是表面活性剂分散于连续有机相中形成的纳米尺度的一种聚集体。
反胶束溶液是透明的、热力学稳定的系统。 胶束与反胶束的形成
将表面活性剂溶于水中，并使其浓度超过临界胶束浓度，表面活性剂就会在水溶液中聚集在一起而形成聚集体。通常将在水溶液中形成的聚集体胶束，称为正胶束。 如果将表面活性剂溶于非极性溶剂中，并使其浓度超过临界胶束浓度，便会在有机溶剂内形成聚集体，这种聚集体称为反胶束。 反胶束分离目标蛋白质包括两个过程： 萃取过程和反萃取过程。
萃取过程：目标蛋白质从主体溶液转移至反胶束溶液中的过程； 反萃取过程：目标蛋白质从反胶束溶液中转移至第二水相(或以固体的形式游离出来)
的过程。
通过改变pH 值、增加离子强度和(或) 增加反胶束溶液中助溶剂的浓度，加入反离子表面活性剂等，破坏反胶束体系，使目标蛋白质释放出来，实现反萃取过程。 影响反胶团萃取的因素 溶液的pH
pH影响蛋白质的电荷数量和电荷性质
溶液的离子强度
影响微胶团的静电状态
凡是对蛋白质所含电荷有影响的因素，如pH，以及对反胶束的静电状态有影响的因素，均能改变蛋白质的增溶作用。
表面活性剂的浓度和种类
其他（有机溶剂、助表面活性剂、温度） 应用举例 纯化和分离蛋白质：
对于溶菌酶和肌红蛋白的混合溶液(两种蛋白质相对分子量相近,等电点分别为11. 1 和6. 8），用二烷基磷酸盐/ 异辛烷反胶束溶液萃取，并用缓冲液将混合液的pH 值调至9. 0，则溶菌酶完全进入有机相中，而肌红蛋白则留在水相。 通过调节pH条件，对溶菌酶进行反萃取。 十一、结晶
结晶是溶质以晶体形式从溶液中析出的过程。酶的结晶是酶分离纯化的一种手段。 酶在结晶之前，酶液必须经过纯化达到一定的纯度。如果酶液纯度太低，不能进行结晶。通常酶的纯度应当在50%以上，方能进行结晶。总的趋势是酶的纯度越高，越容易进行结晶 主要的结晶方法 盐析结晶
有机溶剂结晶 透析平衡结晶 等电点结晶
酶分离纯化方法总结
根据分子大小分离的方法。如离心分离法、膜分离法、凝胶过滤法等。
根据溶解度大小分离的方法、如盐析法、有机溶剂沉淀法、选择性沉淀法、等电点沉淀法等。
按分子所带正负电荷多少分离的方法，如离子交换分离法、电泳分离法、等电聚焦等。
按亲和作用的差异建立的分离方法，如亲和层析法等。
设计分离纯化工艺的基本要求：分辨率、速度、容量、回收率。 十二、浓缩与干燥
浓缩与干燥都是酶与溶剂（通常是水）分离的过程。
离心分离、过滤与膜分离、沉淀分离、层析分离等都能起到浓缩作用。
用各种吸水剂，如硅胶、聚乙二醇、干燥凝胶等吸去水分，也可以达到浓缩效果。 蒸发浓缩是通过加热或者减压方法使溶液中的部分溶剂汽化蒸发，使溶液得以浓缩的过程。酶液的浓缩通常采用真空浓缩。即在一定的真空条件下，使酶液在60℃以下进行浓缩。
酶液浓缩中主要采用超滤膜浓缩技术。
酶的干燥
干燥是将固体、半固体或浓缩液中的水分（或其他溶剂）除去一部分，以获得含水量较少的固体的过程。
1、直接干燥：就是利用热空气直接干燥一些工业酶制剂粗制品，直接干燥的设备常为烘箱或烘房，烘房墙壁用绝热材料做保温层，室内有多层框架，湿酶饼均匀铺于料盘中，放在框架上，室内有循环热空气装置，空气在料盘间流动，把水分带走。 2、真空干燥（减压干燥）：
真空干燥是在可密闭的干燥器中进行，干燥器与真空装置相连，操作时，一边抽真空、一边加热，使酶在较低的温度下蒸发干燥。
3、冷冻干燥：
是将酶液降到冰点以下，使之冻结成固态，然后在低温下抽真空，使冰直接升华为气体，而使酶干燥。冻干产品质量高，可保持完整结构和高生物活性，但成本较高，特别适用于对热非常敏感且有较高价值酶的干燥。
实验室用冷冻干燥机 工业用冷冻干燥机 4、喷雾干燥：
喷雾干燥是将酶液通过喷雾装置喷成直径为几十微米的细小雾滴，分散于热气流之中，水分迅速蒸发，而使酶成为粉末状干燥制品，具有外观美观，流散性好，酶溶解性高等优点。
喷雾干燥时，控制好气流进口温度，并加入糖类(海藻糖、蔗糖、乳糖、麦芽糊精) 、盐类(MgSO4)物质等酶保护剂，可减少酶在干燥过程中引起的变性失活。 喷雾干燥按料液的雾化方式分为3种：
1）压力喷雾法：是利用高压泵，以50-200atm(0.5-20MPa)的压力将料液从ф0.5-1.5mm喷孔喷出，液膜伸长变薄，分散为小雾滴。动力消耗小，适用粘度小，操作弹性小，喷孔易阻塞。
2）气流喷雾法：是依靠压力为2.5-6atm的压缩空气，通过喷嘴时产生的高速度，将料液吸出并雾化，喷嘴孔径较大（一般1-4mm），故可干燥粘度较大的酶液。动力消耗大，适用粘度范围大，结构简单。
3）离心喷雾法：是利用在水平方向作高速旋转的圆盘给予料液以离心力，使其高速甩出，形成薄膜、细丝或液滴，同时又受周围空气的摩擦、阻碍与撕裂等作用形成细雾。动力消耗中，适用粘度高，操作弹性大。其中离心喷雾法较为常用。
压力喷雾干燥塔
5、气流干燥：
气流干燥是在常压下，利用热空气流直接与固体或半固体状态的制品接触，水分蒸发而得到干燥制品的过程。
气流干燥设备简单，操作方便，但用于酶制品干燥时，酶活损失较大。为了减少酶的变性失活，提高干燥质量，要控制好气流温度，温度不能太高，并要使气流的流通性保持良好，以便把蒸发的水汽及时带走，同时要经常翻动制品，使干燥均匀。
单级气流干燥设备 6、沸腾干燥与沸腾造粒干燥
沸腾干燥是利用流态化技术，即利用热的空气流体使孔板上的粒状物料呈流化沸腾状态，使水分迅速汽化达到干燥目的。在干燥时，气流速度与颗粒的沉降速度相等，粒子就在气体中呈悬浮状态，并在流动层中自由地转动，流动层犹如正在沸腾。
沸腾造粒干燥是利用流化介质（空气）与料液间很高的相对气流，压缩空气把溶液
带进流化床就使溶液迅速雾化，液滴与原来在沸腾床内的晶体结合，进行沸腾干燥，它可以被看成是喷雾干燥与沸腾干燥的结合。
流化床的结构 振动流化床干燥机
7、吸附干燥：是在密闭的容器中用各种干燥剂吸收水分或其他溶剂，使制品干燥。 干燥剂应对水或其他溶剂应有较大的吸附能力和较快的吸附速度。常用的干燥剂有无水氯化钙、硅胶、氧化钙、五氧化二磷、无水硫酸钙等，也可采用各种硅酸盐的结晶，这些硅酸盐的结晶对微量的水分、某些溶剂和某些气体有选择性的吸附能力，可根据需要选用。
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