小反刍兽疫病毒RT—LAMP检测方法的研究

８　杨卓Ｉ，Ｊ、反刍兽疫病毒ＲＴ—ＬＡＭＰ检测方法的研究　２０１５年第７期　小反刍兽疫病毒ＲＴ—ＬＡＭＰ检测方法的研究　杨　卓　，于汉勋　，李（１＿大连市动物疫病预防控制中心，辽宁２．大连市畜牧总站，辽宁大连巍　１１６０３７　大连１１６０３７）　摘　要：本试验利用浊度仪，采用实时浊度法进行小反刍兽疫病毒ＲＴ—ＬＡＭＰ方法检测。试验表明在　６５℃，５０　ｒａｉｎ内即可完成对小反刍兽疫病毒的检测。通过敏感性试验证明了该试验方法只能检测目的病毒，而与　同属病毒无交叉反应，灵敏性试验表明其灵敏度与Ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ　ＲＴ—ＰＣＲ方法相当，临床样本试验表明其准确性与　ＲＴ—ＰＣＲ检测试剂盒相当。　关键词：实时浊度法；小反刍兽疫病毒；检测　中图分类号：￥８５２．６５９．５　文献标识码：Ｂ　文章编号：１６７２—９６９２（２０１５）０７—０００８—０７　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｏｆ　ＲＴ——ＬＡＭ　Ｐ　ｆｏｒ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｐｅｓｔｅ　ｄｅｓ　Ｐｅｔｉｓｒｕｍｉｎａｎｔｓ　Ｖｉｒｕｓ　￣ａｎｇ　Ｚｈｕｏ　一．Ｙｕ　Ｈａｎｘｕｎ　，２　Ｌｉ　Ｗｅｉ　，　（１．Ｄａｌｉａｎ　Ａｎｉｍａｌ　Ｄｉｓｅａｓｅ　Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　Ｃｅｎｔｅｒ．Ｌｉａｏｎｉｎｇ　Ｄａｌｉａｎ　ｌ１６０３７　２．Ｄａｌｉａｎ　Ａｎｉｍａｌ　Ｈｕｓｂａｎｄｒｙ　Ｓｔａｔｉｏｎ，Ｌｉａｏｎｉｎｇ　Ｄａｌｉａｎ　１１６０３７）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ　ｔｕｒｂｉｄｉｔｙ　ｍｅｔｈｏｄ　ｗｈｉｃｈ　ｗａｓ　ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ｒｅｖｅｒｓｅ—ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　１ｏ０ｐ～ｍｅｄｉａｔｅｄ　ａｍ—　ｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＲＴ—ＬＡＭＰ）ｗａｓ　ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｅｓｔｅ　ｄｅｓ　ｐｅｔｉｓｒｕｍｉｎａｎｔｓ　ｖｉｒｕｓ（ＰＰＲＶ）Ｕｓ—　ｉｎｇ　ｔｕｒｂｉｄｉｔｙｍｅｔｅｒ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｉｎｄｉｃａｔｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ＰＰＲＶ　ｔｅｓｔ　ｃｏｕｌｄ　ｂｅ　ｆｉｎｉｓｈｅｄ　ｉｎ　５０　ｍｉｎ　ａｔ　６５℃．Ｔｈｅ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　Ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ　ＲＴ—ＰＣＲ　ｔｅｓｔ　ｒｅｓｕｌｔ　ｉｎｄｉｃａｔｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅｒｅ　ｗａｓ　ｎｏ　ｃｒｏｓｓ—ｒｅ—　ａｃｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ｏｔｈｅｒ　ｒｅｌａｔｅｄ　Ｖｉｒｕｓｅｓ，ｔｈｅ　ａｃｃｕｒａｃｙ　ｏｆ　Ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ　ＲＴ—ＰＣＲ　ｔｅｓｔ　ｒｅｓｕｌｔ　ｗａｓ　ａｓ　ｗｅｌ１　ａｓ　ＲＴ—ＰＣＲ　ｄｅｔｅｃｔｉＯＨ　ｋｉｔ　ｏｆ　ＰＰＲＶ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｒｅａｌ　ｔｉｍｅ　ｔｕｒｂｉｄｉｔｙ　ｍｅｔｈｏｄ：Ｐｅｓｔｅ　ｄｅｓ　ｐｅｔｉｓｒｕｍｉｎａｎｔｓ　ｖｉｒｕｓ：Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　小反刍兽疫（ｐｅｓｔｅ　ｄｅｓ　ｐｅｔｉｓｒｕｍｉｎａｎｔｓ，ＰＰＲ）　是由小反刍兽疫病毒（ｐｅｓｔｅ　ｄｅｓ　ｐｅｔｉｓｒｕｍｉｎａｎｔｓ　检测抗体和病原的ＥＬＩＳＡ方法，以及检测病毒核酸　的普通ＰＣＲ和ＲＴ—ＰＣＲ方法。　环介导等温核酸扩增（ＬＯＯｐ—ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｉｓｏ—　ｔｈｅｒｍａｌ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ＬＡＭＰ）是由Ｎｏｔｏｍｉ等发明　ｖｉｒｕｓ，ＰＰＲＶ）引起的一种严重的烈性、接触性传染　病。本病发病率可达１００％，属于ＯＩＥ法定需报告的　动物疫病，我国将其列入一类动物疫病。从遗传进　的一种新型核酸扩增技术，该技术具有快速、高　化系上，ＰＰＲＶ可分为４个谱系，谱系４分布最广　。　效、高特异性和反应条件简单等优点，已经被应用　我国于２００７年７～９月，在西藏首次爆发小反刍兽疫　于多种疾病病原的检测，如尼罗河病毒　、日本脑　疫情　。目前，我国ＰＰＲＶ有两种，分别为西藏株和　炎病毒　、裂谷热病毒　、口蹄疫病毒　等。本文　新疆株。通过遗传进化分析结果显示，新疆株亦属　于谱系４　。目前该病的主要检测方法有通过血清学　利用ＲＴ—ＬＡＭＰ技术和浊度仪，在６５℃、扩增１　ｈ　的条件下，对小反刍兽疫病毒核酸检测方法进行了　收稿日期：２０１５—０５—２３　作者简介：杨卓（１９８３一），女，大学本科，兽医师，研究方向：动物疫病诊断及防控。　通讯作者：于汉勋（１９６５一），男，大学本科，研究员级高级兽医师，研究方向：动物疫病诊断及防控。　２Ｏ１５年第７期　研究。　１．４核酸提取所用病毒ＲＮＡ核酸均按照核酸提取　１材料和方法　１．１材料株、新疆分离株和临床样本来自中国动物卫生与流　株提取物来自新疆天康疫苗，犬瘟热病毒来自辽宁　试剂盒说明进行提取，分光光度计测定浓度，使用　　小反刍兽疫疫苗株（Ｎ７５—１）、西藏分离　之前放一８０℃保存。１．５反应条件和方法本试验按照核糖核酸扩增　行病学中心（简称“流研中心”），小反刍兽疫疫苗　试剂盒说明书进行操作。反应体系为２５　Ｌ，其　中Ｆ１Ｐ、ＢＩＰ均为４０　ｐｍｏｌ；ＬＦ为２０　ｐｍｏｌ；Ｆ３、Ｂ３　省出入境检验检疫局。　１．２试剂提取试剂盒，核糖核酸扩增试剂盒，ＬＡＭＰ反应管。　均为５　ｐｍｏｌ；２×反应缓冲液ｌ２．５　ｕ　Ｌ；酶溶液　Ｌ；ＲＮＡ样本２　Ｌ。最佳　小反刍兽疫ＲＴ—ＰＣＲ检测试剂盒，核酸　ｌ＿０　Ｌ；去离子水４．５　ｕ　引物筛选反应在６５℃，９０　ｍｉｎ完成；特异性、敏　　１．３　仪器设备　浊度仪Ｌａ一３２０Ｃ（日本荣研化学株　感性和样本检测在６５℃。式会社）；ＰＣＲ反应仪（ＡＢ公司７５ＯＯ）；分光光度计　１．６判定方法（ＮａｎｏＤｒｏｐ　ＮＤ一１０００）。　ＲＴ—ＬＡＭＰ法和Ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ　ＲＴ—ＰＣＲ检　测小反刍兽疫病毒的判定方法如表１。　表１　ＲＴ—ＬＡＭＰ法和Ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ　ＲＴ—ＰＣＲ法判定标准　Ｔａｂｌｅ１　Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ　ｓｔａｎｄａｒｄ　ｆｏｒ　ＲＴ—ＬＡＭＰ　ａｎｄ　Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ＲＴ－ＰＣＲ　１．７　ＲＴ—ＬＡＭＰ引物设计及最佳引物筛选通过对小　本的敏感性。　反刍兽疫病毒Ｎ基因序列进行生物信息学分析，确　１．１０临床样本试验　以新疆天康小反刍兽疫病毒　定以ＧｅｎＢａｎｋ中小反刍兽疫病毒序列号ＫＭ０９１９５９．１　为模版参考序列。根据ＬＡＭＰ引物设计软件（网址：　疫苗和流研中心保存的新疆株、西藏株、疫苗株　（Ｎ７５—１）等各类型小反刍兽疫病毒样本为检测对象，　ｈｔｔｐ：／／ｐｒｉｍｅｒｅｘｐｌｏｒｅｒ．３ｐ／ｅ／）进行ＬＡＭＰ引物设　分析其在临床检测中的应用。　计，得到６组引物。通过最佳引物筛选试验，得出　小反刍兽疫病毒ＲＴ—ＬＡＭＰ反应的最佳引物。　１．８特异性试验２结果　２．１最佳引物筛选结果　以新疆天康小反刍兽疫病　佳引物筛选反应模版。结果详见图１。　从结果看，６号引物在２４　ｍｉｎ时最先发生反　将不同时间和不同地点分离出的　毒疫苗提取ＲＮＡ，进行小反刍兽疫ＲＴ－ＬＡＭＰ反应的最　小反刍兽疫病毒ＲＮＡ样本与同属的犬瘟热病毒ＲＮＡ，　按照如上体系进行反应，分析其特异性。　１．９敏感性试验分别用新疆天康小反刍兽疫病毒　应，并出现特征性扩增曲线，可判定６号引物为小　反刍兽疫ＲＴ—ＬＡＭＰ反应最佳引物。引物序列见表２。　疫苗、西藏株病毒样本、疫苗株（Ｎ７５－１）样本进行核　ＲＴ—ＬＡＭＰ法敏感性比较，分析两种反应对各类试验样　酸提取，测定浓度后进行Ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ　ＲＴ—ＰＣＲ法和　２．２特异性试验结果　以不同地区和不同时间分离　的小反刍兽疫病毒样本和犬瘟热病毒样本进行比　１４　现代畜牧兽医　２０１５年第７期　检测法。前三种方法为目前比较普遍的试验结果检　参考文献　测法，但是不足在于无法判定反应中是否出现污　［１］Ｄｈａｒ　Ｐ，Ｂ　Ｐ　Ｓｒｅｅｎｉｗａｓａ，Ｔ　Ｂａｒｒｅｔｔ，ｅｔ　ａ１．Ｒｅ—　ｃｅｎｔ　ｅｐｉｄｅｍｉ０１ｏｇｙ　ｏｆ　ｐｅｓｔｅ　ｄｅｓ　ｐｅｔｉｔｓ　ｒｕｍｉ—　染、二聚体扩增等假阳性情况，从而得不到准确、　高效的反应体系。　本试验中，利用了浊度仪，采用实时浊度法可　以实时监测反应过程中所产生的白色焦磷酸镁沉　淀，从而实现对ＬＡＭＰ整个反应过程的实时监控。通　ｎａｎｔｓ　ｖｉｒｕｓ（ＰＰＲＶ）［Ｊ］．　Ｖｅｔ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，　２００２，　８８：１５３—１５９．　［２］Ｗａｎｇ　Ｚ，Ｊ　Ｂａｏ，ｘ　Ｗｕ，ｅｔ　ａ１．Ｐｅｓｔｅ　ｄｅｓ　ｐｅｔｉｔｓ　ｒｕｍｉｎａｎｔｓ　ｗｉｒｕｓ　ｉｎ　Ｔｉｂｅｔ，Ｃｈｉｎａ［Ｊ］．Ｅｍｅｒｇ　Ｉｎ—　ｆｅｃｔ　ＤｉＳ，２００９，１５：２９９—３０１．　过对曲线形态的分析，能够客观准确的排除假阳性　结果；通过沉淀产生的起始时间判断反应的进行程　度；通过浊度值的高低和反应开始时问的快慢来确　［３］王清华，刘春菊，吴晓东，等．新疆小反刍兽疫疫情诊断　［Ｊ］．中国动物检疫，２０１４，３１：７２－７５．　［４］Ｒｙｌｌ　Ｍ，Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ　Ｈ，Ｂｉｓｇａｒｒｄ　Ｍ，ｅｔ　ａ１．　Ｓｔｕｄｉａｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ　ｏｆ　Ｒｉｅｍｅｒｅｌｌａ　ａｎａｔｉｐｅｓｔｉｆｅｒ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｕｐｐｅｒ　ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ　ｔｒａｃｔ　ｏｆ　ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙ　ｈｅａｌｔｈｙ　ｄｕｃｋｌｉｎｇｓ　ａｎｄ　ｃｈａｒａｃ～　定最佳反应体系。　本试验根据实时浊度法进行小反刍兽疫病毒　ＲＴ—ＬＡＭＰ检测，特异性试验结果表明该反应体系能　够检测出不同种类的小反刍兽疫病毒，而不与同属　的其他种类病毒发生反应。灵敏性试验表明，其灵　敏性与Ｒｅａｌ－ｔ　ｉｍｅ　ＲＴ—ＰＣＲ灵敏性相当；临床样本试　ｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｕｎｔｙｐａｌｅ　ｓｔｒａｉｎｓ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２００１，４８：５３７—５４６．　［５］Ｔｓａｉ　Ｈ　Ｊ，Ｌｉｕ　Ｙ，Ｔｓｅｎｇ　Ｃ　Ｓ，ｅｔ　ａ１．Ｇｅｎｅｔｉｃ　ｖａｒｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｏｍｐＡ　ａｎｄ　１６ＳｒＲＮＡ　ｇｅｎｅｓ　ｏｆ　验表明，在实际应用中，其对阳性样本的检出率与　ＲＴ—ＰＣＲ检测试剂盒一致。针对各类样本检测，本试　验方法均能在４０　ｍｉｎ以内出现扩增，并在５０　ｍｉｎ以　Ｒｉｅｍｅｒｅｌｌａ　ａｎａｔｉｐｅｓｔｉｆｅｒ［Ｊ］．Ａｖｉａｎ　Ｐａｔｈｏｌｏ—　ｇＹ，２００５，３４（１）：５５—６４．　［６］Ｈｉｎｚ　Ｋ　Ｈ，Ｒｙｌ１　Ｍ，Ｋｏｈｌｅｒ　Ｂ，ｅｔ　ａ１．Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ　ｏｆ　Ｒｉｅｍｅｒｅｌｌａ　ａｎａｔｉｐｅｓｔｉｆｅｒ　ａｎｄ　ｓｉｍｉｌａｒ　ｍｉｃｒｏ—ｏｒｇａｎｉｓｍｓ　ｆｒｏｍ　ｖａｒｉｏｕｓ　内进行结果判定，大大缩短了检测时问，提高了检　测效率。以上结果表明，本试验体系能够简便、快　速、准确地进行小反刍兽疫病毒检测，在临床应用　中，只需要普通的恒温金属浴或水浴锅设定具体的　反应温度即可进行小反刍兽疫病毒的检测和鉴别，　因此具有较高的应用价值。　ｈｏｓｔｓ［Ｊ］．Ａｖｉａｎ　Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，１９９８，２７：３３～４２．　［７］秦智峰，曾少灵，阮周曦，等．口蹄疫病毒ＲＴ—ＬＡＭＰ检测　方法的建立［Ｊ］．中国预防兽医学报，２００８，５：　３７５—３７８．Ｍ　撰　零　零撰　撰　零　撰　零　撰　撰　撰撰　零　劫　娶　本刊如有印装质量问题，请将原杂志寄回广告发行部，Ｅｈ本部负责调换。　张　＆　＆《　毽《　筵《　ｓ碰　《　毽《　ｓ《　＆　ｓ　毽　＆　毽　《　＆《　＆《　《　ｓ《砖嚣《　＆　＆《　《　＆《　《　龟ｓ世《　《　＆《　＆　《　＆　＆《　《　＆《　＆《　ｓ《　＆《　ｓ《　＆《　＆　《　＆《　＆《　Ｓ《　＆　嚣《　＆《　％