猫病毒性鼻气管炎PCR检测方法的建立与应用

Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　中国兽医杂志２０１１年（第４７卷）第５期　２５　猫病毒性鼻气管炎ＰＣＲ检测方法的建立与应用　屈　哲　。，徐镔蕊　，睢艳平　，王　勇　，杜　艳。　（１．中国药品生物制品检定所，北京东城１０００５０；２．中国农业大学动物医学院，北京海淀１００１９３）　中图分类号：￥８５８．２９３　文献标识码：Ｂ　文章编号：０５２９—６００５（２０１１）０５—００２５—０２　．猫病毒性鼻气管炎（ＦＲ）又称猫疱疹病毒Ｉ型　ＦＨＶ＿１ＴＫ基因部分片段的引物：Ｐ１　５　－ＣＧＣＴＴＧＡＧ—　（ＦＨＶ一１）可引起猫的上呼吸道感染，是一种猫的常　ＧＡＣＡＧＣＡＴＡＡ一３　．Ｐ２　５　一ＴＧＧＧＡＡＡＣＡＧＡＣＣＡＧＡ　见的急性、高度接触性上呼吸道疾病口　］。病猫精神　ＧＡ－３　，由北京优博基因科技有限公司合成。　沉郁，打喷嚏，食欲下降，结膜炎，浆液性的眼鼻分泌　１．３　提取ＤＮＡ含有病毒的分泌物溶于灭菌生理　物，体温升高，深部的气管咳嗽＿３］。慢性感染病例舌　盐水，离心弃上层液体后加入裂解液和蛋白酶Ｋ　头和上颔出现溃疡。ＦＨＶ一１只感染猫及猫科动物，　５６℃水浴消化２　ｈ以上，用Ｔｒｉｓ饱和酚和酚：氯　主要侵害幼猫，发病率达１００　［４］，死亡率约为　仿：异戊醇（体积比为２５：２４：１）除蛋白质。无水　５Ｏ　＿５］。若怀孕猫感染，可造成流产ｌ＿６］。　乙醇和３　ｍｏｌ／Ｌ醋酸钾沉淀ＤＮＡ。离心弃上清，干　猫鼻气管炎病毒（ＦＲＶ）是１９５８年Ｃｒａｎｄｅｌｌ等　燥后加人灭菌双蒸水制成样品待用。　首次从美国分离［７］。随后相继发现于加拿大、英国、　１．４　ＰＣＲ扩增　２Ｏ　Ｌ反应体系：样品２　Ｌ，上下　荷兰等地。目前，我国ＦＨＶ一１发病率呈上升趋势，　游弓Ｉ物１　Ｌ，ｄＮＴＰｓ　２　Ｌ，１Ｏ×Ｂｕｆｆｅｒ（ＭｇＣ１２　２　多次发现临床可疑病例。但兽医临床还只依靠传统　Ｌ，Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶０．３　Ｌ，灭菌双蒸水加至２０　的诊断方法，诊断结果不准确，实验室诊断也主要依　Ｌ。ＰＣＲ程序：９４℃３　ｍｉｎ，９４℃１　ｍｉｎ，５２℃４５Ｓ，　靠病毒分离和血清学方法［８］，过程费时、费力。而聚　７２℃４５ｓ，３０个循环后７２℃作用１０　ｍｉｎ。反应结束　合酶链式反应（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ，ＰＣＲ）具　后，取３　Ｌ　ＰＣＲ产物用１．０　琼脂糖凝胶进行电　有敏感、特异、快速的优点　］，特异性ＰＣＲ检测方法　泳检测。　的建立，对预防，治疗及根除ＦＨＶ－１有重大意义。　１．５　敏感性试验从眼分泌物中提取的病毒ＤＮＡ　１材料与方法　在紫外分光光度计上测定浓度，２Ｏ　Ｌ体系中含　１．１材料猫疱疹病毒工型（ＦＨＶ－１）、猫细小病　ＤＮＡ量约为３　ｇ，按１Ｏ　至１０　作１Ｏ倍连续稀　毒（ＦＰＶ）、猫传染性腹膜炎病毒（ＦＩＰＶ），均由本实　释，再作为模板加入该ＰＣＲ反应体系中进行ＰＣＲ　验室分离保存。试剂Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶，Ｍａｒｋｅｒ－　扩增。　ＤＬ一２　０００，ＰＥＡＳＹ—Ｔ１载体和Ｍａｒｃｈｌ—Ｔ１菌液（北　１．６　特异性试验　从ＦＨＶ－１、ＦＰＶ、ＦＩＰＶ的病毒　京全式金生物技术有限公司），ｄＮＴＰｓ，Ｂｕｆｆｅｒ　保存液中提取病毒ＤＮＡ，加入该ＰＣＲ反应体系进　（ＭｇＣ１　），随机引物（北京优博基因科技有限公司提　行扩增，检测该方法的特异性。　供合成）。　１．２　引物　根据ＧｅｎＢａｎｋ中注册的ＦＨＶ一１－ＴＫ　１．７重复性试验用该方法重复３次各检测８份　基因，借助Ｐｒｉｍｅｒ　Ｐｒｅｍｉｅｒ５．０软件，设计针对　ＦＨＶ一１阳性样品和２份阴性样品，比较其重复性。　１．８　ＰＣＲ产物测序　将１．２．４中得到的ＰＣＲ产　收稿日期：２００７—０９—２６　物回收纯化后连接到ＰＥＡＳＹ—Ｔ１载体上并转化感　作者简介：屈哲（１９８２一），女，实习研究员，硕士，从事药品科研工　受态细胞Ｍａｒｃｈｌ—Ｔ１，筛选出４个可疑重组质粒菌　作，Ｅ—ｍａｉｌ：ｑｕｚｈｅ８２ｑ７＠１６３．ｃｏｒｎ　落做ＰＣＲ扩增均得到目的片段，送往Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公　通讯作者：徐镔蕊，Ｅ—ｍａｉｌ：ｘｕｂｒ＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ　ｏ●０●＜＞●（＞●ｏ●ｏ●ｏ●ｏ●ｏ●ｏ●ｏ●－＜＞●＜＞●０●ｏ●＜＞●ｏ●ｏ●ｏ●０●－＜＞●＜＞●ｏ●ｏ●ｏ●◇●＜＞●０●＜＞●＜＞●ｏ●ｏ●ｏ●＜＞●０●０●＜＞●＜＞●ｏ●ｏ●ｏ●０●　参考文献：　［５］才旦，刘志林，努果．松针粉饲喂肉兔的效果研究［Ｊ］．现代　畜牧兽医，２００７，１：１９．　［１］董小英，唐胜球．松针粉对广西铁脚麻鸡生产性能及养分利　［６］何云，王浓章．蒜辣松针粉饲喂肉鸭的效果观察［Ｊ］．饲料博　用率的影响［Ｊ］．中国饲料，２００９，２４：２０—２２．　览，２００３，２：２８．　［２］　王三立，周翠珍，张玉海．蛋鸡日粮添加落叶松针粉的试验　［７３唐胜球，董小英．松针粉对铁脚麻鸡免疫器官指数的影响［Ｊ］．　［Ｊ］．饲料研究，２００７，９：４３—４４．　中国饲料，２００９，６：４２—４４．　［３］　闫景萍．饲料中添加松针粉对肉鸡生产性能的影响［Ｊ］．当代　［８］　亢娟娟，孙永刚，康相涛，等．松针粉对固始鸡消化及免疫器　畜牧，２００６，５：３１—３２．　官发育的影响［Ｊ］．饲料研究，２００９，１０：４６—４８．　［４］陈龙星，郑世山，曾建政．饲料添加松针粉饲养肥育猪试验　［９］　陈宝江，王建辉．松针粉对雏鸡生长及免疫力影响的研究［Ｊ］．　［Ｊ］．福建农业科技，２０００，５：１９．　饲料研究，２０００，４：２８—３０．　２６　中国兽医杂志２０１１年（第４７卷）第５期　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｊｏｕｒｎａ１　ｏｆ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　，　１　司进行测序。　１．９　临床病例检测　取２８例临床可疑病例的猫眼　病率迅速上升，而检测ＦＨＶ一１却主要依靠临床表　现及发病史进行诊断，其诊断结果不确实，实验室诊　ｈｐ　０　∞　，Ｏ　Ｏ　Ｏ　∞　∞　如Ｏ　Ｏ　ｍ　鼻拭子，用该ＰＣＲ方法进行检测并统计出检测的阳　性率。　２　结果　２．１敏感性试验ＰＣＲ结果表明，该引物能检测　出的最低ＦＨＶ　１　ＤＮＡ量约为３００　Ｐｇ（图１）。　２　０００　ｌ　０００　７５０　５００　３００　１ＯＯ　图１　ＦＨＶ－１　ＰＣＲ敏感性试验结果　Ｍ：ＤＬ一２　０００　Ｍａｒｋｅｒ；１：ＦＨＶ　１阳性分泌液（３　０００　ｎｇ）　２：００　ｎｇ；３：３０　ｎｇ；４：３　ｎｇ；５：３００　Ｐｇ；６：３０　Ｐｇ；７：３　Ｐｇ　２．２　特异性试验　将ＦＨＶ一１、ＦＰＶ、ＦＩＰＶ和阴性　分泌液中提取的ＤＮＡ　ＰＣＲ扩增后只有ＦＨＶ一１毒　株可扩增出特异性条带，片段长度约５３７　ｂｐ。与预　计的片段长度相符合。而其他毒株和阴性分泌液均　未出现特异性条带（图２）。　图２　ＦＨＶ－１　ＰＣＲ特异性检测结果　Ｍ：ＤＬ一２　０００　Ｍａｒｋｅｒ；１：阴性对照组；２：ＦＨＶ一１阳性分泌液　３：ＦＰＶ；４：ＦＩＰＶ　２．３重复性试验　用该方法重复３次检测８份阳　性ＦＨＶ一１样品，结果３次试验中８份阳性样品均扩　增出特异性片段，说明该方法具有可重复性。　２．４产物序列分析将ＰＣＲ产物序列测定结果与　ＧｅｎＢａｎｋ上收录的所有ＦＨＶ一１ＴＫ基因部分序列　作同源性分析，结果发现同源性达１００　。证明　ＰＣＲ扩增片段属ＦＨＶ一１的特异性片段。　２．５临床病例检测结果将２８个临床可疑病例分为　４组，应用上述该ＰＣＲ方法进行检测，检测结果。总共　有２５例检测出ＦＨＶ－１阳性，阳性率约为８９．３　９／５。　３　讨论　近几年，在我国临床上猫病毒性鼻气管炎的发　断也只停留在病毒分离和血清学诊断，但其操作繁　琐、诊断时间长、结果重复性不好等。ＰＣＲ技术具　有特异性强、灵敏度高、快速简便及重复性好等优　点。本试验首次根据ＧｅｎＢａｎｋ中注册的ＦＨＶ一１　ＴＫ基因序列，设计１对针对ＦＨＶ一１的特异性引　物，并不断摸索优化ＰＣＲ的反应条件和反应程序，　建立了一种快速、敏感、特异性强的ＦＨＶ一１　ＰＣＲ检　测方法。　ＦＨＶ一１的ＴＫ基因是ＦＨＶ一１的特异性基因序　列，通过ＰＣＲ方法扩增ＴＫ基因部分序列可以用于　确诊ＦＨＶ一１。特异性试验结果显示５３７　ｂｐ处出现　特异性的扩增条带，其测序结果与已注册的ＦＨＶ－１　ＴＫ基因部分序列同源性１００　，而ＦＰＶ和ＦＩＰＶ　以及阴性分泌液均未扩增出特异性片段，因此，此　ＰＣＲ方法具有较高的特异性。本试验建立的ＰＣＲ　检测方法的敏感性试验能检测出的最低ＤＮＡ量约　为３００　Ｐｇ，灵敏度较高。　本研究建立的ＦＨＶ一１　ＰＣＲ检测方法可通过采　集病猫的眼鼻分泌物对临床出现的可疑病例进行检　测，其检测过程快速简便，检测结果准确性高。本实　验室已将该检测方法应用于临床检测，检出的阳性　率较高。本方法的建立使本试验室分离、纯化以及　保存了猫疱疹病毒，为今后研究疱疹病毒及疫苗的　开发打下基础，对我国现今发病率迅速上升的猫病　毒性鼻气管炎的防治有重要意义。　参考文献：　［１］Ｙｏｋｏｙａｍａ　Ｎ，Ｍａｅｄａ　Ｋ，Ｔｏｈｙａ　Ｙ，ｅｔ　ａ１．Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ　ａｎｄ　ｖａｃ—　ｃｉｎｅ　ｅｆｆｉｃａｃｙ　ｏｆ　ａ　ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ　ｋｉｎａｓｃ（｛ｔ、ｆｉｃｉｅｎｌ　ｍｕｔａｎｔ　ｏｆ　ｆｅｌｉｎｅ　ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ　ｔｙｐｅ１　ｉｎ　ｃａｔｓ［Ｊ］．ＡｒＣ　１／Ｖｉｒｏ１．１‘　６，１４ｌ：８１　４９４．　Ｅ２］　Ｆｕｊｉｔａ　Ｋ．Ｍａｅｄａ　Ｋ．Ｙｏｋｏｙａｍａ　Ｎ．ｔ　，“ｆ．Ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｆｅｌｉｎｅ　ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ　ｔｙｐｅｌ￣Ｊ］．Ａｒｃｈ　Ｖｉｒｏｌ，１９９８，１４３：２５—３４．　Ｅ３３利凯，徐彤，刘朗，等．猫上呼吸道感染性疾病的诊疗ＥＪ］．中国　兽医杂志，２００５，４１（３）：３７—３８．　ｒ４］Ｐｏｖｅｙ　Ｒ　Ｃ．Ａ　ｒｅｖｉｅｗ　ｏｆ　ｆｅｌｉｎｅ　ｖｉｒａｌ　ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅｉｔｉｓ（ｆｅｌｉｎｅ　ｈｅｒ　ｐｅｓｖｉｒｕｓ　１　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）［Ｊ］．Ｃｏｍｐ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　Ｉｎｆｅｃｔ　Ｄｉｓ，　１９７９，２：３７３－３８７．　Ｅ５］Ｒｏｇｅｒ　Ｋ　Ｍａｅｓ，Ｓａｎｄｒａ　Ｌ　Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｌｏｒｉ　Ｌ．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ　Ｐｒｏ—　ｔｅｉｎｓ　ｏｆ　Ｆｅｌｉｎｅ　Ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅｉｔｉｓ　ＶｉｒｕｓＦＪ￣．Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，　１９８４，７：２５９—２６２．　［６］Ｒｏｉｚｍａｎ　Ｂ，Ｃａｒｍｉｃｈａｅｌ　Ｌ　Ｅ，Ｄｅｉｎｈａｒｄｔ　Ｆ，ｅｔ　ａｌ，Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉ—　ｄａｅ；ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ，ｐｒｏｖｉｓｉｏｎａｌ　ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ　ａｎｄ　ｔａｘｏｎｏｍｙ［Ｊ］．　Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９８２，１６：２０１—２１７．　［７］Ｃｒａｎｄｅｌｌ　Ｒ　Ａ，Ｍａｕｒｅｒ　Ｆ　Ｄ．Ｐｒｏｃ　Ｓｏｃ　Ｅｘｐｔｌ　ＢｉｏｌＥＪ］．Ｍｅｄ．９７，　１９５８，４８７．　［８］　Ｊ　Ｄｉｔｃｈｆｉｅｌｄ．Ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ　ａｎｄ　Ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ　Ｐｅｐｏｒｔｓ［Ｊ］．Ｖｉｏｌ，　１９６５，２６：５０４—５０６．　［９］萨姆布鲁克Ｊ，拉塞尔Ｄ　ｗ．分子克隆实验指南ＦＭ］．黄培堂，　译．３版．北京：科学出版社，２００２．