承 德 医 学 院 科学研究计划申请书
项目名称：维生素D受体FOKI突变对CYP3A4
转录调控的影响
研究类别：应用基础 申请单位：药理教研室 申 请 人：李宝群
申报日期：2010年3月15 日
承德医学院科技处制
项目名称 维生素D受体FOKI突变对CYP3A4转录调控的影响 起止时间 研究类别 职称 负责人 中职 研究生 硕士 其 中 32 药理 2010.4－2012.7 应用 学历 申请经费 成果水平 学位 8000元 国内领先 年龄 现从事专业 总人数 高级 中级 初级 项目组 6 2 2 1 博士 硕士 学士 其他 3 3 1
维生素D3是人体必需的一种维生素，可以调节钙磷代谢，调控细胞的生长分化，除却这些经典的为人所熟知的作用外，VD3还具有抗肿瘤的作用，其机制现已明确，VD3可以抑制前癌基因表达，促进细胞分化抑制增殖及诱导凋亡，以及化学预防作用，这些作用都是通过维生项 目 内 容 摘 要 素D受体实现的，诸多研究表明VD3作为维生素D受体(VDR)的天然配体与之结合后通过激活其下游靶基因如细胞色素氧化酶CYP3A4，使之mRNA转录和蛋白表达增加，对内外源性物质的解毒能力增强起到保护细胞的作用，我们从受体基因变异这个角度了解SNP对VDR表达和功能的影响，以及是否改变CYP3A4的转录表达和活性；进而最终影响结直肠肿瘤发生频率。 2
一．立论依据（包括科学意义、应用前景、国内外研究现状分析、参考文献等） CYP3A4代谢了现在临床上60%的常用药物, 研究发现CYP3A4活性在人群中的差异可高达100倍之多，并且这种差异被认为90%是由于遗传因素决定。鉴于CYP3A4蛋白活性和CYP3A4mRNA表达具有密切相关性，因此就可能提示CYP3A4的表达差异是来自转录水平的影响。VDR是一类重要的核转录因子，可调控CYP3A4的转录；所以VDR的表达和功能的改变可影响下游基因的调控表达。对它的变异的研究也是近年来探索CYP3A4表达个体差异显著的重点方向。最近的研究表明，VDR可与石胆酸（LCA）结合，目前已明确石胆酸为结肠致癌物，在大肠癌的发生发展进程中起重要作用，而肠道中的CYP3A4可以代谢石胆酸排出体外，降低结直肠癌的发病率，由于VDR在肠道中对CYP3A4的转录调节占有重要地位，它的基因变异和异常表达则会导致肠道中CYP3A4表达的改变,从而造成对内外源性物质解毒能力的的改变进而影响人群中结直肠癌发病率以及化疗药物疗效的差异。因此对VDR和CYP3A4的研究具有重要的临床意义。除此之外，由于VDR和 CYP3A4在小肠高表达，而这些都是药物吸收，代谢及排泄的重要器官，这都预示了VDR数量和/或质量的改变还可能对临床上药物代谢、疗效和相互作用有深远影响，所以非常值得深入研究和探讨。本课题通过检测 VDR的FOKI突变在结直肠癌患者中的分布频率是否与健康人群存在差异，以及研究在体内和体外此突变是否也引起VDR表达的下降，因此为了进一步探索该变异对下游靶基因CYP3A4表达的影响，并且是否成为CYP3A4活性个体差异的一个重要因素，并且为了给今后研究临床上一系列VDR和CYP3A4有关的药物代谢异常、药物相互作用及毒副反应等提供机制性的理论指导，在本研究中，我们在从转录调控的新视角从组织，体内体外三个水平探讨了核受体VDR的FOKI突变对CYP3A表达和功能的影响。 [1] Yaylim-Eraltan,Arzu Erfen H,ARikan S,et,al Investigation of the VDR gene polymorphisms association with susceptibility to colorectal cancer. Cell Biochem Funct. 2007 Nov-Dec;25(6):731-7. [2]. Jurutka PW, Thompson PD, Whitfield GK et al. Molecular and functional comparison of 1,25-dihydroxyvitamin D(3) and the novel vitamin D receptor ligand, lithocholic acid, in activating transcription of cytochrome P450 3A4. [J]Journal of Cellular Biochemistry, 2005,94(5):917-943. [3] Murtaugh MA, Sweeney C, Ma KN, Potter JD, Caan BJ, Wolff RK, Slattery ML. Vitamin D receptor gene polymorphisms, dietary promotion of insulin resistance, and colon and rectal cancer. Nutr Cancer. 2006;55(1):35-43. [4]Wonq HL , Seow A , Arakawa K, et al. Vitamin D receptor start codon polymorphism and colorectal cancer risk :effect modification by dietary calcium and fat in Singapore Chinese [J] . Carcinogenesis , 2003 ,24 :1091 - 1095. [5] 章振林 赵金秀 孟迅吾等 维生素3 D受体基因起始密码和3′端多态性与绝经后妇女骨密度的关系【J】中华医学遗传学杂志2003,2第20卷第1期 二．研究内容（说明具体研究内容、拟解决的关键问题和创新点） 研究内容 1探讨CYP3A4活性与临床结直肠癌病人的关系。 2研究临床结直肠癌病人CYP450酶活性与维生素D受体VDR基因型的关系。 3研究维生素D受体FOKI位点的突变在体外对其下游靶基因CYP450酶活性和蛋白表达量的影响。 4研究EB1089（维生素D类似物）在体内对CYP3A活性的影响及其与维生素D受体VDR基因型的关系。 拟解决的关键问题 1维生素D受体FOKI突变体需要的定点突变技术 2核受体(VDR)的真核表达载体的构建 3维生素D受体野生型和突变体的细胞转染 创新点 本项目的最大特色在于从核受体变异这个崭新的角度在转录调控水平探讨结肠肿瘤发生机制，首次在肿瘤组织研究VDR和CYP450的蛋白表达，从而间接阐明药物代谢酶CYP3A4个体活性的差异是由于肝脏和肠道两套酶系统所致且受不同核受体调节，给今后研究临床上一系列VDR和CYP3A4有关的药物代谢异常，药物相互作用及肿瘤易患性等提供了一个机制性的理论指导。 4
三．研究方案（包括研究方法、实验方案、技术路线） 5
实验1. 研究维生素D受体FOKI位点的突变在结直肠癌患者中的分布频率 1）选取临床上已经确诊为结直肠癌患者的手术切取的肿瘤组织标本32个 2）采用allelic special-touchdownPCR方法进行基因型FOKI位点的检测。 3）将分型结果进行频率分析并与健康人群和文献报道的其他种族比较。 实验2 维生素D受体FOKI位点的突变对CYP3A4转录调控及表达的影响 利用 RT-PCR 和western-blot方法检测肿瘤标本的VDR和CYP3A4的表达。 实验3. 研究维生素D受体FOKI位点的突变在体外对其下游靶基因CYP450酶活性和蛋白表达量的影响。 1）质粒的构建：分别构建有进一步研究意义的CYP450异构酶的报告基因质粒和hVDR的表达载体。 2）将CYP450异构酶的报告基因质粒和作为内对照的质粒分别转染至COS-7细胞中，分别用地塞米松、1，25（OH）2VD3、和利福平处理，最后用双荧光素酶报告基因系统检测VDR与其天然配体结合后，野生型和FOKI突变体对下游靶基因的转录和表达是否存在差异进而在体外水平证实此突变是否具有功能意义。 实验4 维生素D受体FOKI位点的突变对CYP3A4活性的体内研究 1 对大样本人群进行VDR基因分型，从中选取野生型纯合子，突变杂合子，突变纯合子各六名。 2将三个基因组受试者随机分成两组进行临床试验，按照两阶段交叉方案进行，分别给予维生素D类似物EB1089和安慰剂处理13天，第14天给所有受试者咪哒唑仑探药。 3 经过两周14天的洗脱期后交叉重复实验 4服药后24小时中采血，各时段血中咪哒唑仑和1－羟基咪哒唑仑用HPLC-MS/MS方法测定。 6
四．研究进度安排（要求具体、详细） 2008.6－2008.12 实验室准备及部分体外实验 2009.01－2009.10 完成体外实验 2009.12－2010.2 体内实验 五．预期目标 （1） 首次研究VDR的FOKI突变在中国结直肠癌患者中的分布频率。 （2） 首次研究1，25（OH）2VD3在体内是否诱导CYP3A以及与FOKI基因型的关系。 （3） 揭示VDR基因型与CYP3A4和结直肠癌的关系，为维生素D抗肿瘤作用提供个体化给药的依据。 在国内外核心期刊上发表相关研究论文2－3篇。 六．经费预算 年度 2010 2011 2012 500元 4500元 3000元 金额 使用说明 临床病人手术标本收集 购买实验材料 试剂药品购置费 临床实验 色谱柱 资料查新，文献复印 电脑耗材 7
七．课题组成员及分工（包括课题负责人限报6人)： 姓 名 李宝群 王瑞婷 梅爱敏 关丽华 负责人签字： 年 月 日 负责人签字： 年 月 日 （盖 章） 年 月 日 性 别 女 女 女 女 专 业 药 理 药 理 药 理 药 理 职 称 讲师 副教授 副教授 助教 分 工 负责 体外细胞实验 体内临床实验 搜集资料 教 研 室 意 见 部 处 系 意 见 学 院 意 见
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