狂犬病口服疫苗研究进展

狂犬病口服疫苗研穷进展　刘娟，王学林，郭恒，孙树民　吉林大学人兽共患病研究所　吉林长春１　３００６２　狂犬病（Ｒａｂｉｅｓ）是由狂犬病　病毒（Ｒａｂｉｅｓ　ｖｉｒｕｓ，ＲＶ）感染引　口服疫苗口服免疫家鼠，抗体阳转　率达８０％以上。１９９６年郑海发等又　实的技术基础。Ｄｉｅｔｚｓｃｈｏｌｄ把编码　细胞凋亡蛋白基因插入到狂犬病病　起的一种人兽共患急性传染病。狂　犬病在世界范围内广泛流行。调查　表明，我国农村地区犬只免疫率仅　为１０％～２０％，猫则几乎没有进行　过免疫，形成不了免疫屏障。而且，　我国狂犬病病例多未进行暴露后处　置或处置不规范。面对这种极为严　峻的形势，唯一简便有效的方法就　是研制口服疫苗建立免疫群，最终　达到消除狂犬病的目的。　一、口服狂犬病毒疫苗毒株　随着对狂犬病毒疫苗技术研究的　深入，有许多种病毒被用来研究口　服疫苗。ＥＲＡ株活疫苗能有效刺激　狗和浣熊产生中和抗体，具有很好　的保护性，但对鼠等啮齿动物、猫、　臭鼬具有致病性。ＳＡＤ—Ｂｅｒｎ株疫　苗对红狐有很好的保护作用，但对　啮齿动物和狒狒具有一定的致病性。　ＳＡＤ—ＢＩ９株在实验室研究中，对狐　狸和浣熊做口服试验结果发现，血　清阳转率很高，但ＳＡＤ－ＢＩ９株疫苗　对鼠有一定的致病性。ＳＡＤ～Ｐ５／８８　疫苗主要对部分啮齿动物是致命　的。源于ＳＡＤ－Ｂｅｒｎ株的双突变株　ＳＡＧ１株，均是无毒的，无论日服、　肌注、脑注和免疫剂量如何，对成　年小鼠和狐狸均无致病性，但对仓　鼠是致病的。ＣＴＮ—ｌ株制备的口服　狂犬病疫苗给家犬一次性口服，可　获得长达１５个月的免疫力。１９８９年　又将该毒株适应Ｖｅｒｏ细胞，制备的　采用ＣＴＮ一１株经Ｖｅｒｏ细胞传ｌ５代，　制备狂犬口服疫苗，口服乳犬，结　果表明该疫苗病毒对乳犬口服无致　病性，而且疫苗抗体阳转率很高。　二、减毒活疫苗　与灭活疫苗相比较，减毒活疫苗　可以诱导强的细胞毒性Ｔ细胞（ＣＴＬ）　介导的免疫反应，而灭活疫苗不能　诱导Ｔ细胞免疫。反向遗传操作系　统方法是新近发明的方法，应用该　方法通过修改狂犬病病毒糖蛋白与　毒力相关的位点和蛋白的膜外区，　可以重组出更安全、更有效的减毒　活疫苗。　狂犬病毒的反向遗传学操作系　统，迄今为止已经得到飞速发展。　艾军等应用反向遗传操作技术拯救　出重组病毒ＨＥＰ—Ｆｌｕｒｙ（ＮＩＧ２），获　得了适应ＢＨＫ一２１细胞的病毒克隆　株，重组病毒的致病性已明显降低、　在ＢＨＫ一２１细胞中的病毒滴度逐渐　升高。Ｉｔｏ等用ＲＶ强毒株，证明Ｇ　基因是ＲＶ毒力决定基因，并通过实　验进一步证实糖蛋白３３３位氨基酸　是毒力决定位点。郭霄峰等于２００６　年运用基因突变、反向遗传技术的　原理与方法成功地拯救已发生基因　重排的狂犬病毒。郭利等于２００９年　采用负链ＲＮＡ病毒反向遗传学方法　构建减毒株ＥＲＡＧ６，减弱了其潜在　的毒力回归的危险，为研制更加安　全有效的狂犬病减毒活疫苗打下坚　毒中，通过该蛋白刺激免疫或干预　病毒的致病性来增强疫苗的效力和　安全性。　三、转基因植物口服疫苗　表达狂犬病病毒抗原蛋白的植物　可能成为人或动物疫苗的廉价来源，　特别对于发展中国家，这种疫苗更　有推广价值。目前报道有两种方法　能够在植物中表达狂犬病病毒抗原　基因。第一种方法是直接种植表达　狂犬病病毒抗原蛋白的转基因植物。　ＭｃＧａｒｖｅｙ等于１９９５年通过这种方　法率先在西红柿中的叶片和果实中　表达糖蛋白，但其相对较低的抗原　蛋白表达量可能不足以避免动物受　到病毒的攻击。第二种方法是构建　重组植物病毒，然后用重组的植物　病毒感染植物，用分离的病毒粒子　免疫动物或直接用病毒感染的植物　叶片饲喂动物就可起到免疫效果。　Ｙｕｓｉｂｏｖ等于１９９７年成功构建了带　有糖蛋白Ｂ细胞表位和核蛋白Ｔ细　胞抗原表位的重组ＡＩＭＶ病毒。通　过纯化的病毒粒子腹腔免疫小鼠，　小鼠能产生中和抗体。Ｙｕｓｉｂｏｖ等又　于２００２年用重组病毒感染的菠菜叶　给受试者食用，结果表明植物病毒　表达系统具有用作狂犬病口服加强　免疫的潜力。但是，狂犬病病毒糖　蛋白目前在可食性植物中的表达水　平还相当低，然而，表达水平方面　的技术难题一旦攻破，将为生产安　全廉价有效的新型狂犬病口服疫苗　提供空前繁荣的前景。　载体疫苗中以痘苗病毒为载体Ｖ２ＲＧ　体的疫苗外，还可以利用细菌作为　研究的最为清楚、应用得也最广泛。　２００１年Ｂｌａｓｏ用表达Ｇ蛋白的　运载体。对沙门氏菌为疫苗运载体　的口服疫苗的免疫学基础了解得比　四、重组活载体疫苗　人们希望发展一种既保留狂犬　病病毒完整的免疫原性而又不含狂　重组痘苗病毒疫苗免疫雌狐，表明　较全面，有很多资料显示以鼠伤寒　用重组痘苗病毒载体有可能适合于　沙门氏菌为运载体构建的其它疫苗　幼狐的免疫。在痘病毒中插入狂犬　都有报道，故有学者将沙门氏菌和　犬病致病的疫苗，目前研究得最多　的是重组活载体疫苗。故是当前认　为最有开发和应用前景的动物疫苗。　病病毒ＥＲＡ株的糖蛋白基因，研制　狂犬病病毒疫苗紧密的结合在一起，　出安全有效的ｖＣＰ１６重组病毒疫苗，　目前这种新型的粘膜免疫的口服疫　苗正在研究之中。其大致可能机理　重组ＣＰＶ狂犬病病毒疫苗保护小鼠、　该活载体疫苗克服了常规疫苗的缺　点，兼有死疫苗和活疫苗的优点，　在免疫效力上有很强的优势。　（一）杆状病毒载体有资料报　道，具有免疫反应性和保护性的狂　犬病病毒糖蛋白和核蛋白，已在杆　状病毒一昆虫细胞系统获得成功表　达，并可大量生产，易于纯化精制。　杆状病毒表达系统是比较理想　的真核表达系统。狂犬病病毒Ｇ基　因在异源宿主系统杆状病毒中的高　效表达，为大规模地制备亚单位疫　苗提供了另一条可能的途径。１９９０　年Ｐｒｅｈａｕｄ等将ＣＶＳ株Ｇ基因插　入苜蓿Ｙ纹夜蛾核型多角体病毒转　移载体上，与ＡＣＮＰＶ　ＤＮＡ共转染　Ｓｆ９，结果发现狂犬病病毒糖蛋白表　达产量高，而且有免疫原性。Ｆｕ　ＺＦ　把ＥＲＡ株Ｇ基因和Ｎ基因分别重　组到杆状病毒中，分另０用纯化表达　的Ｇ蛋白和Ｎ蛋白免疫浣熊和小鼠，　均能诱生抗狂犬病病毒的中和抗体　和抵抗街毒致死剂量的攻击，从而　显示了此种疫苗的口服使用前景。　（二）痘病毒载体用痘苗病毒做　载体具有许多优点，比如：病毒载　体本身无毒性，对目标动物和非目　标动物都是安全的；制备的疫苗具有　很好的保护性；可以通过消化道免疫　动物以及具有热稳定性，在野外可　以存活一个月以上，其最先被用于　狂犬病口服疫苗的构建中。重组活　猫和狗抵抗致死性狂犬病病毒攻击　如下：将狂犬病病毒Ｇ和Ｎ具有抗　所需的接种剂量很低。用重组ＣＰＶ　原性蛋白的外源基因，克隆到表达　狂犬病病毒疫苗，替代目前已有的　质粒中，然后将该重组质粒电转入　狂犬病病毒疫苗能取得很好的效果。　减毒沙门氏菌。用此重组减毒沙门　（三）腺病毒载体腺病毒基因重　氏菌对动物和人进行粘膜免疫（１１　组活载体疫苗已成为当前开发研制　服或鼻腔免疫）。这种方法制备的Ｅｌ　经济、安全、有效，且使用方便的　服疫苗廉价、接种方式简便，毋需　新型疫苗中十分活跃的领域。目前，　专门医护人员，适用于大群体免疫，　基于犬２型腺病毒、猴腺病毒、腺　且可避免因注射接种而感染血源传　相关病毒等的狂犬口服疫苗的研究　播的疾病。此外，以减毒沙门氏菌　也都在进行中，有的已进入临床试　为载体的疫苗抗原不需要提纯、制　验阶段，对载体病毒的减毒及狂犬　备简单、易于储存和运输，可显著　保护性抗原基因的修饰是研究的热　降低疫苗的制作成本。鉴于这些优　点问题。　点，减毒鼠伤寒沙门氏菌可成为狂　１９９０年加拿大Ｐｒｅｖｅｃ等用基因　犬疫苗的优良载体，用于某些细菌、　重组技术将狂犬病病毒ＥＲＡ株糖　病毒、寄生虫、肿瘤性疾病的预防　蛋白基因表达狂犬病病毒糖蛋白的　或治疗性疫苗。　ＡｄＲＧ１。体内外试验均证实ＡｄＲＧ１　均可诱生高水平的中和抗体，保护动　五、ＤＮＡ疫苗　物抵抗致死剂量狂犬病病毒的攻击。　在一些动物实验模型中，ＤＮＡ　１９９２年Ｃｈａｒｌｔｏｎ等以重组腺病毒疫　疫苗预防狂犬病有较好的效果。目前，　苗给臭鼬和红狐狸口服免疫，证明　传统ＤＮＡ疫苗存在的抗体应答弱的　安全有效可抵抗病毒的攻击。Ｚｈｏｕ　缺陷得到很大改善，通过使用佐剂、　Ｄ等构建了表达狂犬病病毒糖蛋白　对ＤＮＡ质粒的改造及免疫剂量和次　的黑猩猩腺病毒，该病毒可以作为　数的优化，Ｍａｎｐｒｅｅｔ　Ｋａｕｒ等构建了　１７服疫苗，保护机体免受狂犬病病　一种有效的狂犬ＤＮＡ疫苗，动物保　毒的感染。２００５年张守峰等构建出　护率为１００％，中和抗体滴度为４ＩＵ／　狂犬病病毒糖蛋白的重组犬２型腺　ｍｌ。但是这种传统的ＤＮＡ疫苗接种，　病毒，在细胞当中包装出毒，通过　需要极高剂量的质粒，在人体内免疫　采用各种接种途径都获得了令人满　原性很弱，使人们不得不考虑寻找有　意的效果。　效的ＤＮＡ疫苗的运载系统。　（四）细菌载体除了病毒作为载　近年来，ＤＮＡ疫苗的运载系统　血毒混感多肽注射液的体外抑菌　试验及人工攻毒试验研究　向世忠　，商树林　，张国红　，刘利春　，郭世勤　，杜国清　（１四川省宣汉县畜牧兽医协会　四川宣汉６３６１　５０　ｊ　２四川省雷波县畜牧兽医局　四川雷波６１６５５０．３四川西科精尖兽药饲料生物工程研究中心，四ＪＩｌ绵阳６２１０２３　４四川西昌学院动物科学系，四川西昌６１　５０００，５四川精尖动物疫病研究中心　四川绵阳６２１０２３　猪大肠杆菌病、伤寒沙门氏杆菌　川西科精尖兽药饲料生物工程研究　中心试制　硫酸安普霉素、硫酸庆　养使其活化。然后接种在营养肉汤　中，置３７℃温箱培养，取出后用肉　汤稀释到１０～１０　备用。　病、痢疾杆菌病是养猪生产中比较　常见且较多发的细菌性疾病病，危　害较大。目前，在临床中，由于抗　生素的非合理使用，使得病原菌对　一大霉素、盐酸林可霉素均购于绵阳　天诚药业有限公司，经检测属合格　产品。　（二）体外抑菌试验采用药敏纸　片法。　些抗生素产生较强的耐药性。课　（二）菌种猪大肠杆菌、伤寒沙　门氏杆菌、痢疾杆菌，由四川精尖动　物疫病研究中心从临床自然病例中　分离。　（三）人工攻毒防治试验双月龄　断奶健康仔猪３９０头，分别进行猪　题组采用脂质体技术研制了由多重　组分制备的复方制剂一血毒混感多　肽注射液，为临床用药增加了轮换、　选择的机会，可在一定程度上改善　临床因长期不规范、不合理使用抗　大肠杆菌、伤寒沙门氏杆菌、痢疾　杆菌的攻毒防治试验。将３９０头仔　（三）药敏片硫酸庆大霉素一盐　猪随机分成ｌ３组，每组３０头，设　　酸林可霉素、硫酸庆大霉素、盐酸　攻毒对照组、血毒混感多肽治疗组、林可霉素纸片，由四川精尖动物疫　硫酸庆大霉素组、盐酸林可霉素组、　健康对照组（共同对照）。健康对照　组不攻毒不给药，攻毒对照组只攻　毒不给药，血毒混感多肽预防组从　生素而产生耐药性的现象。现将该　药的体外抑菌情况和人工攻毒防治　病研究中心提供。　试验结果报告如下。　二、试验方法　一、材料　２ｍｌ／ｋｇ　（一）菌液的制备将三种菌分别　攻毒前８ｈ开始给药（按０．给药），硫酸庆大霉素组按０．２ｍｌ／　（单位：ｍｍ）　（一）供试药物血毒混感多肽　接种于适宜的培养基上，于３７℃培　注射液的主要成分为磺胺间甲氧嘧　啶钠、硫酸庆大霉素、林可霉素等，　各成分按一定比例，采用脂质体技　术和工艺制备的油相脂质体注射液，　１０　ｍｌ／支，批号：２００９０７０９，由四　表１体外抑菌试验结果也有了更深入的研究，这为狂犬口　非常方便，使其作为运载体更加安　全。而从研发成本和使用成本来说，　基于沙门氏菌的狂犬ＩＺｌ服ＤＮＡ疫苗　优势更为明显。　成功安全有效且纯化浓缩的组织细　胞狂犬病疫苗，疫苗质量已接近或　服ＤＮＡ疫苗的发展提供了广阔的空　间。利用沙门氏菌为ＤＮＡ疫苗运载　体的研究已有成功范例。沙门氏菌　达到国际先进水平，但其中还存在　接种价格昂贵，接种不方便的原因。　作为活疫苗载体技术发展迅猛，以　往激发免疫应答偏弱的缺陷得以改　善。当前沙门氏菌致弱手段非常成　熟，而沙门氏菌进入体内后被巨噬　另外近几年来高新技术在狂犬病疫　／＼、，六、展望　芪三Ｅ　动物狂犬病是人狂犬病的根　苗研究广泛应用，以细菌为活载体　的狂犬口服疫苗期待进一步开发。　源，消灭动物狂犬病关键要加强对　参考文献（略）　细胞吞噬进而在吞噬体内溶解以及　动物的免疫接种，　虽然我国狂犬病　外源抗生素的使用也使得对其调控　疫苗经过几十年的发展，已经研制