硅藻金色奥杜藻色素的HPLC分析与超临界CO2萃取研究

李振;李爱芬;张成武

【摘 要】以硅藻金色奥杜藻(Odontella aurita)为实验材料,利用高效液相色谱法分析了其色素组成与含量,采取超临界CO2萃取技术研究了从干藻粉内提取岩藻黄素的条件.结果表明,该藻主要含有岩藻黄素、硅甲藻黄素、β-胡萝卜素、硅藻黄素等类胡萝卜素以及叶绿素a和叶绿素c1,其中岩藻黄素为该藻含量最高的类胡萝卜素.色素的萃取率与压强、温度、夹带剂含量以及萃取时间呈正相关,夹带剂含量对萃取率影响最大,CO2流速的影响最小；与有机溶剂法相比,超临界Co2萃取岩藻黄素效率略低,而更利于岩藻黄素的选择性萃取及分离提纯；岩藻黄素的SFE-CO2适宜条件为压强400 bar、温度50℃、CO2流速0.2 L/min、夹带剂比例10％、萃取时间2～3h.%Pigment composition and content of the diatom Odontella aurita were analyzed by reverse-phase HPLC,and a study of extraction of fucoxanthin from the freeze-dried powder of Odontella aurita was carried out using supercritical carbon dioxide. The results demonstrated that major pigments in the microalgae were fucoxanthin, diadinoxanthin,β-carotene, diatoxanthin, chlorophyll a and chlorophyll cl. Fucoxanthin was the most abundant carotenoid in the microalgae with a high content of 9.22 μg/mg dry weight. The yields of pigment extracted were positively related to temperature, pressure,addition amount of modifier and extraction time. Among the factors tested,the additional amount of modifier showed a greatest impact on pigment extraction yields,while the CO2 flow rate was the smallest factor. Although the fucoxanthin yield extracted by SFE-CO2 was lower,the SFE-CO2 was more conducive to

fucoxanthin selectively extraction, separation and purification compared to organic solvent extraction. The suitable conditions for the SFE-CO2 of fucoxanthin were 400 bar,50 ℃ ,CO2 flow rate 0.2 L/min,addition amount of modifier 10% and extraction time 2-3 h. 【期刊名称】《天然产物研究与开发》 【年(卷),期】2012(024)006 【总页数】5页(P814-818)

【关键词】金色奥杜藻;高效液相色谱;超临界CO2萃取;色素 【作 者】李振;李爱芬;张成武

【作者单位】暨南大学水生生物研究中心,广州510632;暨南大学水生生物研究中心,广州510632;暨南大学水生生物研究中心,广州510632 【正文语种】中 文

【中图分类】Q946.82;R917

金色奥杜藻(Odontella aurita)是一种海洋硅藻，含有丰富的不饱和脂肪酸(DHA和EPA)，2002年法国批准该藻为人类保健食品的新来源［1］，用于EPA的工业化生产［2］。Dimitri Moreaua等人近期发现该藻含有的岩藻黄素对支气管及上皮癌细胞株有很强的抗增殖作用［3］。岩藻黄素，也称为墨角藻黄素，为硅藻、褐藻、金藻所含有的一种重要的类胡萝卜素，其功能除上述报道的外，还有诱导人前列腺癌PC-3细胞凋亡［4］，抑制人结肠癌细胞株Caco-2、HT-29、DLD-1的增殖［5］以及抗内毒素(EIU)炎症［6］、光保护［7］、减肥［8］等多种生理

功能。可见，天然岩藻黄素在医药、保健、化妆品等行业具有良好的应用前景。 目前，提取类胡萝卜素常采用有机溶剂法，但多数有机溶剂会污染产品，且分离工艺复杂［9］。如采用无毒、无污染且选择性高的超临界CO2萃取技术将该藻所含的岩藻黄素萃取出来，从而保持其天然活性，则可增加金色奥杜藻产品的附加值。另外，目前为止该藻的具体色素组成也尚未清楚。因此，本文采用高效液相色谱法(HPLC)先对该藻的色素组成与含量进行分析，然后利用超临界CO2萃取技术(SFE-CO2)初步考察从其干藻粉内提取岩藻黄素的条件，以期为该藻色素的研究与开发提供参考。 1 材料与方法 1.1 实验材料

金色奥杜藻(Odontella aurita)干藻粉由暨南大学水生生物研究中心实验与应用藻类学实验室提供。 1.2 标准品与试剂

岩藻黄素、硅藻黄素、硅甲藻黄素、叶绿素a及β-胡萝卜素标准品(购于DHI丹麦)，乙腈(色谱纯)，乙酸乙酯(色谱纯)，丙酮等均为分析纯，高纯CO2(＞99.999%)。 1.3 色素提取

称取10 mg干藻粉，加入90%丙酮［10］5 mL，置于磁力搅拌器上避光提取3 h，离心收集上清液，反复提取2～3次，直至藻渣变为灰白色，合并上清液定容后待HPLC定性定量。 1.4 色素分析

采用戴安UltiMate 3000高效液相色谱系统(四元泵单元、自动进样器、柱温箱系统、DAD检测器);色谱条件:反相Kromasil C18色谱柱(5 μm，100Å250 ×4.6 mm)，配有 Acclaim 120 C18保护柱(5 μm，120Å 15×4.6 mm)。流动相A∶乙

腈-水(90∶10 v/ v)，流动相B:乙酸乙酯，梯度洗脱程序:0～20 min，A由100%线性下降至0%，B则由0%线性上升至100%，20～25 min，维持B 100%，25～27 min，B下降至0%，27～30 min，以100%平衡A结束。检测波长:445 nm，波长扫描范围:300～800 nm，柱温:20℃，流速:1 mL/min，进样量:20 μL。 通过对比样品峰和标准品峰的保留时间和特征吸收光谱进行色谱峰定性，对没有标准品对照的色谱峰，通过与文献报道［11，12］的特征吸收光谱及出峰顺序等色谱行为的对比进行初步定性。采用外标和归一化法进行色素定量。 1.5 标准曲线绘制

取岩藻黄素(1.267 mg/L)、硅甲藻黄素(1.147 mg/L)、硅藻黄素(0.580 mg/L)、β-胡萝卜素(1 mg/ L)叶绿素a(1.748 mg/L)标准液各1 mL，分别进样5、10、20、30、40、50 μL，以峰面积(mAU·min)为纵坐标，以进样质量(mg)为横坐标，绘制标准曲线(回归方程见表1)。

表1 色素标准品的回归方程及相关系数Table 1 Regression equation，

correlation coefficient of standards色素标准品Standards 回归方程Equation 相关系数R2 线性范围Linear range岩藻黄素Fucoxanthin Y=75921x-0.0409 0.9992 6.34×10-6～6.34×10-5硅藻黄素Diatoxanthin Y=121431x-0.1583 0.9984 2.90×10-6～2.90×10-5硅甲藻黄素Diadinoxanthin Y=137074x-0.0766 0.9999 5.74×10-6～5.74×10-5 β-胡萝卜素β-Carotene Y=15144x-0.0014 0.9998 5.00×10-6～5.00×10-5叶绿素a Chlorophylla Y=15040x-0.0277 0.9993 8.74×10-6～8.74×10-5 1.6 超临界CO2萃取

采用 Spe-ed SFE-2(Applied separation，Inc.USA)超临界CO2萃取仪，称取金色奥杜藻冻干藻粉100 mg，倒入萃取釜，放入萃取室。实验设置压强200、300、400、500 bar，温度40、50、60℃，夹带剂(乙醇)含量0、5%、10%、15%，

CO2流速0.2、0.5、0.8 L/min，萃取时间0.5～3 h。萃取结束后取下收集瓶，将萃取液定容后，采用高效液相色谱法分析色素含量。 1.7 有机溶剂提取

称取10 mg干藻粉，加入溶剂5 mL，置于磁力搅拌器上(避光、50℃)提取3 h，离心收集上清液，定容，最后采用高效液相色谱法分析色素含量。 1.8 萃取率计算

萃取率=(C外标×V定容)/M

注:C外标为通过外标法计算的萃取液的浓度，V定容为萃取液定容后的体积，M为藻粉重量(mg)。 2 结果与分析

2.1 金色奥杜藻的色素组成与含量

金色奥杜藻干藻粉色素提取液的高效液相色谱分析如图1所示，共检测出色素11种。根据色素保留时间及其特征吸收光谱和标准品，色素定性分析结果见表2。从表2可知，金色奥杜藻的主要色素包括岩藻黄素、硅甲藻黄素、β-胡萝卜素以及叶绿素a、叶绿素c1。其中岩藻黄素为最主要的类胡萝卜素，在类胡萝卜素中含量最高，为9.22 μg/mg，约占总类胡萝卜素含量的60%。由此可见，金色奥杜藻是岩藻黄素的良好生物来源。

图1 金色奥杜藻色素提取液的高效液相色谱图(左)及标准品色谱图(右)(峰定性见表2)Fig.1 HPLC chromatogram of pigment extract from O.aurita(left)and chromatogram of standards(right)

表2 金色奥杜藻色素的定性结果与含量Table 2 Pigment composition and content of O.aurita identified by HPLC注:a:溶剂为100%丙酮;b:流动相A:甲醇-0.5M醋酸铵(80∶20 v/v)，流动相B:乙腈-水(90∶10 v/v)，C:乙酸乙酯Note:a:Solvent:100%acetone;b:Mobile phase A:methanol，0.5M

ammonium acetate(80∶20 v/v)B:acetonitrile/water(90∶10 v/v)，C:ethyl acetate峰号No.色素名称Pigment保留时间/min Rt/min最大波长/nm λmax/nm(eluent)最大波长/nm λmax/nm(reported)［13］含量

Content(μg/m 1 g) 4.63±0.34 2岩藻黄素Fucoxanthin 8.43 446.3 467.5 446.3 468a 9.22±0.53 3 岩藻黄素异构体cis-Fucoxanthin 9.65 444.3 467.5 444 (464)b 1.61±0.11 4 硅甲藻黄素Diadinoxanthin 10.57 446.9 476 448 478a 0.50±0.08 5 Diadinochrome 10.98 410 430.5 455.9 410 430.7 457.9a 0.05±0.01 6 19'-己酰岩藻黄素Hex-fucoxanthin 11.31 420 444.5 469.5 420 444.3 470.3a 0.19±0.04 7硅藻黄素Diatoxanthin 11.84 453 480 453.9 482.3a 0.08±0.02 8 叶绿素a异构体Chl a allomer 15.71 426 616.3 663 425 616 664b 0.25±0.06 9叶绿素a Chlorophyll a 16.43 430.2 616.3 662.9 430.3 616.5 662.1b16.35±1.2 10 叶绿素a异构体Chl a epimer 16.79 430.2 616.3 662.9 431 618 666b 1.27±0.20 11 β-胡萝卜素β-Carotene 19.82 452.3 476.3 453.5 479.9a叶绿素c1Chlorophyll c1 6.89 446.5 581 630 444.6 581.3 629.7a 4.29±0.31

2.2 金色奥杜藻色素的超临界CO2萃取 2.2.1 压强和温度对萃取率的影响

由图2可看出，金色奥杜藻色素的萃取率随着压强的增大而升高，因为随着萃取压力的增加，超临界CO2的密度上升，从而增加CO2的溶解度和粘度，溶解色素的能力增强。当压强由200 bar升至400 bar时，岩藻黄素的萃取率提高最为显著，由200 bar时的0.196提高到400 bar时的1.152 μg/mg，叶绿素的萃取率由 200 bar时的 0.120上升为0.515 μg/mg。当压强升至500 bar时，岩藻黄素萃取率虽趋于上升，但岩藻黄素/总类胡萝卜素下降，使得萃取的岩藻黄素纯度下降，且高压对设备工艺和操作条件要求高，实际应用中选用400 bar为宜。

图2 压强对萃取率的影响Fig.2 Effect of pressure on extraction yield(温度temperature 50℃，夹带剂 modifier addition 0%，CO2流速flow rate 0.5 L/min，2 h)

温度和萃取率有双重关系，在一定压力下，升高温度，一方面会导致CO2的密度下降，溶解能力下降，不利于萃取;另一方面，升温可以使溶质挥发性升高(蒸汽压)，即导致藻粉内的色素的蒸汽压大于CO2溶解色素的蒸汽压，从而使色素在藻粉与超临界CO2之间的传质加快，从而有利于萃取［14］。从图3看出，岩藻黄素以及其他色素的萃取率随着温度的升高而上升，当温度超过50℃以上，岩藻黄素萃取率升高幅度并不大，且随温度升高萃取的岩藻黄素纯度降低，所以萃取温度50℃比较适宜。

图3 温度对萃取率的影响Fig.3 Effect of temperature on extraction yield(压强pressure 300 bar，夹带剂modifier addition 0%，CO2流速 flow rate 0.5 L/min，2 h)

2.2.2 夹带剂含量、CO2流速以及萃取时间对萃取率的影响

图4所示的为不同夹带剂含量下色素的萃取率。由图看出，在没有夹带剂(乙醇)的条件下，岩藻黄素的萃取率很低，当加入5%的夹带剂后，其萃取率大幅度增加，萃取效果由无夹带剂时的0.46上升为 6.44 μg/mg(约为藻内岩藻黄素含量的70%)。因为纯CO2的极性小，加入夹带剂乙醇后，使CO2的极性增强，有利于极性较强的色素提取。随着夹带剂含量的上升(由5%增加至15%)，虽然岩藻黄素萃取率也随着提高，但提高的幅度较小，考虑到后续处理，选用5%～10%的乙醇作为夹带剂。

图4 夹带剂含量对萃取率的影响Fig.4 Effect of modifier addition on extraction yield(压强pressure 300 bar，温度temperature 50℃，CO2流速flow rate 0.5 L/min，2 h)

图5所示的为不同CO2流速对色素萃取率的影响。由图可知，不同CO2流速对岩藻黄素的萃取率影响不明显，鉴以CO2成本，可采用较低流速。萃取时间对色素提取率的影响如图6所示，随着萃取时间的延长，萃取的色素含量明显增加，其中岩藻黄素及总类胡萝卜素的萃取率上升趋势较叶绿素明显，后者在2 h后趋于平缓。虽然溶剂与溶质的接触和传质时间的延长可以提高萃取率，但实际应用中考虑到能耗等因素，选用2～3 h适宜。

2.3 金色奥杜藻色素的有机溶剂法提取

图7 不同有机溶剂对色素的提取效果Fig.7 Extraction yields of pigments under different solvents

图7所示的为不同有机溶剂对色素的提取效果，可看出，甲醇、乙醇、丙酮的各色素提取率均高于石油醚的提取率，其中甲醇较其他溶剂更利于叶绿素的提取(叶绿素萃取率最高)，而丙酮对岩藻黄素的提取效果略好于其他各溶剂。值得注意的是不同溶剂下的叶绿素提取率均高于岩藻黄素和总类胡萝卜素的提取率，而超临界CO2各条件的叶绿素萃取率均低于岩藻黄素和总类胡萝卜素的提取率。从两种提取方法的叶绿素提取率差别较大来看，有机溶剂提取法虽效率较高，但选择性较低(各色素提取率均较高)，而超临界CO2萃取法虽提取率较低，但选择性较高(叶绿素提取率很低)。另外，比较两种提取方法的岩藻黄素提取率，可看出超临界CO2萃取在有夹带剂条件下也能达到有机溶剂提取的70%左右，如果进一步优化超临界CO2萃取条件，岩藻黄素的萃取率及选择性可能会更高。 3 结论

本文利用反相高效液相色谱技术对金色奥杜藻(Odontella aurita)色素组成进行分析，共检测出11种色素，该种硅藻含有的主要类胡萝卜素为岩藻黄素、硅甲藻黄

素、β-胡萝卜素及硅藻黄素等，叶绿素类色素主要含有叶绿素a和c1。超临界CO2萃取色素的实验表明，萃取压强、温度、夹带剂含量以及萃取时间对色素的萃取率影响较大，CO2流速影响较小;纯的CO2萃取色素的效率很低，加入一定比例的夹带剂(乙醇)，可使色素的萃取率大大提高;与有机溶剂法相比，超临界CO2萃取法在本实验条件下不利于叶绿素的提取，但更利于岩藻黄素的选择性萃取与分离提纯，尽管岩藻黄素的萃取率低于有机溶剂法的提取率。

此外，如藻粉粒度大小、含水量大小也会对色素的超临界CO2萃取产生影响。总之，采用超临界CO2萃取金色奥杜藻干藻粉内的岩藻黄素具有萃取速度快、无污染、选择性高、萃取物色味纯正等优点，值得进一步发展与应用研究。 参考文献

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