蛋白纯化

??? 经常我们的客户反馈没有纯化到His标签蛋白,不要着急，我们——来排除可能的原因，首先确定是蛋白没有挂上柱子都流穿了，还是蛋白没有被洗脱下来,然后——检查原因：若His标签蛋白没有结合上去都流穿了，请依次检查：

* 可能原因：超声的功率不对(太大，蛋白炭化，太小，蛋白没有释放) 策略：改变超声功率，并在超声前加入溶菌酶 ?

* 可能原因：样品或者是结合缓冲液不正确：

策略：检测pH 及样品和结合缓冲液的组成份。确保在溶液 中鳌合剂或强还原剂的浓度及咪唑的浓度不是太高。 ?

* 可能原因：组氨酸的标签没有完全的暴露

策略：在变性条件下(用4－8 M 脲，或4－6 M盐酸胍)进行纯化。 ?

* 可能原因：HIS标签丢失,

策略1：WB或者anti-his的抗体检查His是否表达，上游构建，改变his-tag的位置(C-terminal or N-terminal)，必要时增加his个数(常用6-10个)。 策略2：孵育的时间不够，降低流速和增加孵育的时间。

策略3：改变螯合的金属离子，寻找到最佳的结合金属离子。

??? Ni2+通常是从宿主细胞蛋白中纯化大多数(组氨酸)6 标记的重组蛋白质的首选金属离子。也是一般最常用的离子。蛋白和金属离子之间的结合强度受几种因素影响，包括长度、位置、亲和标记在蛋白的暴露程度、所用离子的类型、以及缓冲液的pH，因此一些蛋白用其他离子可能更容易地进行纯化而不用Ni2+。可以利用Hitrap IMACHP来筛选不同的金属离子，具体应用实例请参考《Recombinant Protein Purification Handbook》，或者登录 www.gelifesciences.com.cn 查询。

若没有洗脱下来，请依次检查：

* 可能原因：洗脱条件太温和（组氨酸标记的蛋白质仍然结合在柱上，结合力较强） 策略：用增加咪唑的梯度洗脱或降低pH 来找出最佳的洗脱条件。 ?

* 可能原因：降低PH的方法洗脱的,因为若PH低于3.5,会导致镍离子脱落 策略：改变洗脱办法,咪唑竞争性洗脱 ?

* 可能原因：蛋白已沉淀在柱上

策略：减少上样量，或使用咪唑的线性梯度而不是分步洗脱以降低蛋白的浓度。试用去污剂或改变NaCl 的浓度，或在变性条件(去折叠)下洗脱(用4－8 M脲，或4－6 M 盐酸胍)。 ?

* 可能原因：非特异性疏水或其他相互反应

策略：加非离子去污剂到洗脱缓冲液（如，2%Triton X-100）或增加NaCl 的浓度。 ?

HIS标签蛋白洗脱后杂带较多,什么原因? 如何优化?

??? 高纯度的蛋白是纯化工作者的追求，但是由于很多天然的蛋白也会带有HIS，所以经常会出现HIS

标签蛋白洗脱后有一些杂带，可能的原因和优化的方法如下： * 可能原因：蛋白酶部分降解了标签蛋白,

策略：请添加蛋白酶抑制剂，(慎用EDTA)。

?

* 可能原因：杂质对镍离子有更高的亲和性

策略1：咪唑浓度必须优化，以确保高纯度(宿主细胞蛋白质的低结合)和高产率(组氨酸标记的目标蛋白质的强结合)之间的最佳平衡。分步或者线性洗脱摸索出最优的咪唑结合和清洗浓度；在样品中加入与结合缓冲液同样浓度的咪唑；咪唑的梯度不大(20 个或更多的柱床体积)，可能分离出有相似结合强度的蛋白。应用实例可以参考《生命科学园》2006年8月第23期

策略2：筛选最适合的缓冲液条件，NaCl浓度，PH的范围都需要进行筛选以下是(His)6-NuRR1蛋白在His MultiTrapFF96孔板

上进行缓冲液条件的筛选以便决定最适的结合和洗脱条件。对于单一目标蛋白在进行缓冲液筛选时，将缓冲液、盐、甘油和还原剂设计成96个不同的混合配方。实验结果显示对于该目标蛋白在25mMTris，10mMNaCl，10％甘油，PH8.5的缓冲 液适最佳的结合条件。详细的实验方法流程请参考生命科学园2007年8月25期(参见下面图片2) 策略3：若以上优化的条件都不能去除杂质蛋白，需要考虑多步纯化的思路，离子交换(HiTrap Q HP or HiTrap SPHP) 和凝胶过滤(Superdex?Peptide，Superdex 75 or Superdex200) 是必须的.以下是用?KTAxpress仪器进行四步纯化的实例。AC(亲和)，DS(脱盐)，IEX(离子交换)，GF(凝胶过滤)所有的步骤都在?KTAxpress上自动执行,包括柱上的标签酶切。(参见下面图片3)文章出处《Recombinant Protein Purification Handbook》 ?

* 可能原因：杂质和标签蛋白结合在一起

策略：在超声破碎细胞之前加入去垢剂或者还原剂；增加去垢剂的浓度，( 2 % Triton X-100 or 2 % Tween 20)；或者在wash buffer中增加甘油的浓度(50%)减少非特异性的相互反应；考虑增加咪唑的浓度或者改变金属离子。 ?

* 可能原因：洗涤不充分

策略：增加洗涤的次数,使洗涤充分。