埃可病毒11型多个基因型在中国大陆的循环及肠道病毒的实验室生物安全研究

埃可病毒11型多个基因型在中国大陆的循环及肠道病毒的实验室

生物安全研究

研究背景:肠道病毒(enterovirus,EV)归属于小RNA病毒目小RNA病毒科中的肠道病毒属。目前已经报道的EV有116种血清型,分属于15个组:EV-A至EV-L,以及鼻病毒A-C组。

肠道病毒为无包膜病毒,在酸性环境中稳定,对紫外线敏感,目前实验室常用的EV灭活方式包括热力灭活、紫外线照射、含氯消毒剂及甲醛熏蒸等方式。Echovirus 11作为EV-B的一员,是较常分离到的EV,疾病谱分布广泛:从轻度非特异性症状到全身性疾病,如皮疹,发热,手足口病(Handfoot,andmouthdisease,HFMD),葡萄膜炎(uveitis)和严重的神经系统疾病,包括无菌性脑膜炎,脑炎和急性迟缓性麻痹(acute flaccid paralysis,AFP)等。

特别是导致新生儿败血症样症状(sepsis-likedisease)和多器官系统出血

(multisystem hemorrhagic disease)的发生,其高病死率引起社会恐慌。文献提示,有关E-11流行病学和基因特征及实验室EV灭活效果评价方面的研究仍比较匮乏。

仅有的E-11基因特征研究在地理分布和时间跨度上也较为局限,本实验室曾经对1999年西藏自治区和1999-2003年山东省AFP病例中分离得到的E-11毒株进行过相关研究,本研究在此基础上依托HFMD网络实验室监测技术平台,首次对中国大陆分离得到的E-11毒株进行流行病学、基因特征及遗传进化等方面的系统研究;并在EV生物安全二级实验室(Biosafety laboratory-2,BSL-2)中首次对EV常用灭活方式进行了系统评价。研究目的:阐明我国E-11的流行规律,建立E-11 VP1全长及全基因组序列的测定方法,更新E-11基于VP1全长的基因分型结果,系统掌握E-11不同基因型别毒株在全球及全国范围内的分布及流行规律,完善对其基因重组及遗传进化规律的认识,为E-11的进一步研究提供基础数据,

为相关疾病的预警预测及预防控制提供科学依据。

系统评价EV常用灭活方式的灭活效果,建立BSL-2实验室表面消毒技术,确保实验操作人员安全,为生物安全管理提供可靠数据。研究方法:基于中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所建立的中国大陆AFP、HFMD网络实验室监测技术平台,收集1999-2003年,2008-2017年中国大陆由E-11引起的共59例AFP及HFMD病例信息,并扩增全部E-11 VP1全长序列。

同时收集筛选GenBank数据库500条国内外E-11 VP1编码区全长序列,建立E-11 VP1区全长序列数据集;对从HFMD网络实验室检测平台获得的17株E-11毒株进行全基因组测序,使用Sequencher、MEGA、Bioedit、Simplot软件对其基因序列特征,重组情况和进化规律等特征进行系统分析。利用细胞培养技术,将灭活处理后的病毒接种于细胞进行病毒滴度实验,通过观察细胞病变效应(CPE),并利用behrens-karber法计算灭活后EV的TCID5o,评价EV热力灭活及常用消毒剂的灭活效果。

研究结果:1.截止至2018年12月5日,共收集到国内外E-11 VP1区核苷酸序列全长559条,其中包含分离至六大洲33个国家,时间跨度为1953-2014年度,来源于11种疾病类型的E-11 VP1区全长序列359条和分离至中国大陆1994-2017年12个省份(自治区)的200条E-11VP1区核苷酸全长序列。其中59条为本实验室分离株:41株来源于本实验室前期基于AFP网络实验室监测技术平台,18株来源于HFMD网络实验室监测平台。

HFMD来源的18株E-11毒株中有4株为重症HFMD,分离至2012年广东省,2010年湖南省,海南省和2017年河北省。2.基于VP1区核苷酸序列全长,按照肠道病毒基因型别划分标准将E-11划分为A-F六个基因型,基因型A,C和D可被进一步划分为A1-A5,C1-C4和D1-D5基因亚型。

其中基因型F是本研究划分的新基因型,D5基因亚型在HFMD中的检出为国内首次报道。3.除中国大陆外共获得六大洲33个国家,时间跨度为1953-2014期间的359株E-11毒株,经分型鉴定后分布于A4-A5、B、C2、C4、D1-D5和F基因(亚)型中。

D5基因亚型为1998-2014年度国外流行的优势基因亚型,首次于1998年分离于Tunsia。4.中国大陆分离至1994-2017年度的200株E-11经分型鉴定后,分布于A1-A3、B、C1、C3、D5和E基因(亚)型中,A1基因亚型为2008-2017年度中国大陆流行的优势基因亚型。

A1基因亚型自2006年首次从AFP病例中被分离后,至2017年一直有持续性流行。5.将HFMD来源的可获得全长序列的17株E-11毒株根据不同基因型别和不同疾病类型进行重组分析。

本实验分离到的轻、重症病例D5基因亚型分离株的重组方式相同,表现为在3C区与EV-B100和EV-B111发生重组,在3D区与EV-B86发生重组;A1基因亚型轻、重症病例分离株间的重组模式存在差异,轻症病例A1基因亚型分离株的重组方式与D5基因亚型分离株相同,3株重症病例A1基因亚型分离株存在两种不同的重组模式,一种以

HaN-2010-165和HuN-2010-112为代表,表现为5’-UTR与EV-B98发生重组,另一种以GD-2012-34为代表,表现为5’-UTR与EV-B74,3D区与EV-B86存在重组;除与EV-B原型株存在重组外,中国大陆E-11分离株还与近几年流行的其他EV-B流行株发生重组,重组活动频繁。6.肠道病毒热力灭活方式显示,56℃加热灭活30min后可使EV-A71病毒的灭活对数值超过6,65℃加热灭活30min,70℃加热灭活10min后观察不到CPE发生,建立灭活温度和处理时间的多重线性回归方程,结果显示温度每提高10℃,EV-A71病毒滴度下降约1.7个TCID50,灭活作用时间每提高10分钟,EV-A71病毒滴度下降约0.2个TCID50;化学消毒剂灭活效果评价显示,三氯异氰尿酸泡腾片,virkon消毒粉和新型消毒剂次氯酸分

子可以有效灭活EV-A71病毒。

研究结论:1、基于E-11 VP1编码区全长序列,可将其划分为A-F共六个基因型,其中F基因型为本研究划分的新的基因型别,分离至非洲中西部的内陆国家;D5基因亚型的E-11毒株在中国HFMD中的检出为国内首次报道。2、1994-2017年度中国大陆分离到的200株E-11毒株可以被划分到A1-A3,B,C1,C3,D5,E基因型,存在多个E-11基因型的循环,其中A1-A3为中国大陆本土流行株,暂未见其他国家报道。

3、分子流行病学分析显示,A1基因亚型是2008-2017年期间中国大陆流行的优势基因型别,以1999年和2008年为时间节点,中国大陆流行的E-11基因型别可能发生了较为明显的转变:持续流行的基因型别由C1转变为A2,再转变为A1基因亚型。4、除中国大陆外其他国家分离到的E-11毒株的基因型分布可能在1998年前后发生明显转变,由D4基因亚型转变为D5基因亚型的持续性流行,1998-2014年期间D5基因亚型是国外分离株的绝对优势基因型。

5、基因重组:本研究提示中国大陆HFMD来源的E-11毒株在5’-UTR区和3D区与其他EV-B新型肠道病毒发生重组,A1基因亚型分离株重组方式较D5基因亚型多,可能在其成为优势基因亚型过程中起着重要作用;HFMD来源的E-11毒株与近年流行的其他EV-B流行株重组活动频繁,且不乏与暴发事件分离株发生重组,成为其将来导致疾病暴发流行的潜在隐患。6、热力和化学消毒剂对EV-A71的灭活效果与灭活温度、消毒剂浓度和处理作用时间等因素有关,研究化学消毒剂对EV-A71的灭活曲线对于指导化学消毒剂浓度和处理作用时间的选择具有重要意义。