复方骨肽不同给药方法促进骨折愈合的实验研究

生物骨科材料与临床研究　４　ｄｏｌ：１　０．３９６９／１．Ｉｓｓｎ．１　６７２－５９７２．２０１　１．０６．００２　文章编号：ｓｗｇｋ２０１　１－０８　０１　４８　ＯＲＴＨＯＰＡＥＤＩＣ　ＢＩＯＭＥＣＨＡＮＩＣＳ　ＭＡＴＥＲＩＡＬＳ　ＡＮＤ　ＣＬＩＮＩＣＡＬ　ＳＴＵＤＹ　２０１１年１２月　第８卷第６期　复方骨肽不同给药方法促进骨折愈合的实验研究水　许诺范磊　袁同洲黄野于晓巍何斌　【摘要】目的比较局部应用复方骨肽超声经皮导入与静脉使用复方骨肽对于骨折愈合的影响。方法制备６Ｏ只成　年健康新西兰兔双侧桡骨骨折模型，分为超声电导局部给药组、静脉给药组、对照组３组。术后在４个时间点（按　第２…４　６　８周）通过ｘ片，光镜下观察及骨组织形态计量学分析评价骨折愈合情况。结果ｘ片半定量、光镜下组　织学观察以及骨组织形态计量学分析表明通过超声组和静脉组骨折愈合较对照组明显提前，有统计学意义　（Ｐ＜Ｏ．０５）。超声组结果稍优于静脉组，但无统计学意义（Ｐ＞０．０５）。结论复方骨肽超声经皮导入与静脉使用对于　骨折愈合全过程有相似的促进作用。　【关键词Ｊ复方骨肽；超声经皮导入技术；骨折愈合；骨组织形态计量学　【中图分类号］１１２８４；Ｒ６８３．４１　【文献标识码】Ｂ　Ｔｈｅ　ｅｍｐｉｒｉｃａｌ　ｓｔｕｄｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃｕｒａｔｉｖｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｃｏｍｐｏｕｎｄ　ｏｓｓｏｔｉｄｅ　ｏｎ　ｆｒａｃｔｕｒｅ　ｈｅａｔｉｎｇ　ｂｙ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｄｒｕｇ—ｄｅｔｉｖｅｒｙｉｎｇ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ＸｕＮｕｏ，ＦａｎＬｅｌ，Ｙｕａｎ　Ｔｏｎｇｚｈｏｕ，ｅｔａ１．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＯｒｔｈｏｐａｅｄｉｃｓ，ｔｈｅＳｅｃｏｎｄＡｔｔｉｌｉａｔｅｄＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＮａｎｊｉｎｇＭｅｄｉｃａｌ　Ｕｎ　ｉｖｅｒｓｉ￣ＮａｎｊｉｎｇＪｉａｎｇｓｕ，２１００１１，Ｃｈｉｎａ　【Ａｂｓｔｒａｃｔｌ　０ｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏ　ｃｏｍｐａｒｅ　ｔｈｅ　ｃｕｒａｔｉｖｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｃｏｍｐｏｕｎｄ　ｏｓｓｏｔｉｄｅ　ｏｎ　ｒｆａｃｔｕｒｅ　ｈｅａｌｉｎｇ　ｂｙ　ｄｉｆｅｒｅｎｔ　ｄｒｕｇ—ｄｅｌｉｖｅｒｙｉｎｇ　Ｍｅｔｈｏｄｓ：ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ－ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ　ｄｒｕｇ　ｄｅｌｉｖｅｒｙ　ａｎｄ　ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ　ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　６０　ｍａｔｕｒｅ　Ｎｅｗ　Ｚｅａｌａｎｄ　ｒａｂ—　ｂｉｔｓ　ｗｅｒｅ　ｐｒｅｐａｒｅｄ　ａｎｄ　ｂｏｎｅ　ｄｅｆｅｃｔｓ　ｗｅｒｅ　ｍａｄｅ　ｉｎ　ｂｏｔｈ　ｒａｄｉｉ　ｏｆｅａｃｈ　ｒａｂｂｉｔ　ａｓ　ｒａｃｔｆｕｒｅ　ｍｏｄｅｌｓ．Ａｎｄ　ｈｅ　ｔｒａｂｂｉｔｓ　ｗｅｒｅ　ｄｉｖｉｄｅｄ　ｉｎｔｏ　３　ｇｒｏｕｐｓ　ｒａｎｄｏｍｌｙ：ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ－ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｒａｔｎｓｄｅｒｍａｌ　ｄｒｕｇ　ｄｅｌｉｖｅｒｙ　ｇｒｏｕｐ，ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ　ｄｅｌｉｖｅｒｙ　ｇｒｏｕｐ　ａｎｄ　ｃｏｎｔｒａｓｔ　ｇｒｏｕｐ．Ｘ—ｒａｙ　ｉｍａｇｉｎｇ、ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｌｉｇｈｔ　ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ　ａｎｄ　ｍｏｒｐｈｏｍｅｔｒｙ　ｏｆ　ｏｓｓｅｏｕｓ　ｔｉｓｓｕｅ　ｗｅｒｅ　ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ　ｔｏ　ａｓｓｅｓｓ　ｔｈｅ　ｄｅｇｒｅｅ　ｏｆｆｒａｃｔｕｒｅｈｅａｌｉｎｇｉｎｔｈｅ　ｒａｂｂｉｔｓ　ｏｆｅａｃｈｇｒｏｕｐａｔｔｈｅ　ｅｎｄｏｆ２ｔｈ、４ｔｈ、６ｔｈａｎｄ　８ｔｈｗｅｅｋｐｏｓｔｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ．ＲｅｓｕｌｔｓＴｈｅ　ｒｅｓｕｌ￣ｏｆＸ—ｒａｙ　ｉｍａｇｉｎｇ，ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ　ｏｆｌｉｇｈｔ　ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ　ｎｄ　ａｍｏｒｐｈｏｍｅｔｒｙ　ｏｆｏｓｓｅｏｕｓ　ｔｉｓｓｕｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｉｎｄｉｃａｔｅｄ　ｈｅ　ｆｔｒａｃ—　ｔｕｒｅ　ｈｅａｌｉｎｇ　ｎ　ｉｕｌｒａｓｏｕｎｄ－ｔｍｅｄｉｔｅｄ　ａｒａｎｓｄｅｒｔｍａｌ　ｄｒｕｇ　ｄｅｌｉｖｅｒｙ　ｇｒｏｕｐ　ａｎｄ　ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ　ｄｅｌｉｖｅｒｙ　ｇｒｏｕｐ　ｗｅｒｅ　ｂｅＲｅｒ　ｈａｔｎ　ｈａｔ　ｔｎ　ｃｏｎｔｉｒａｓｔ　ｇｒｏｕｐ　ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔｌｙ（Ｐ＜０．０５　１　Ａｎｄ　ｈｅ　ｔｒａｃｔｕｒｅ　ｆｈｅａｌｉｎｇ　ｉｎ　ｕｌｒｔａｓｏｕｎｄ－ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ　ｄｒｕｇ　ｄｅｌｉｖｅｒｙ　ｇｒｏｕｐ　ｗｅｒｅ　ｓｌｉｇｈｔｌｙ　ｂｅｔｔｅｒ　ｔｈａｎ　ｔｈａｔ　ｉｎ　ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ　ｄｅｌｉｖｅｒｙ　ｇｒｏｕｐ．ｂｕｔ　ｗｉｔｈ　ｎｏ　ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ　ｓｉｎｉｇｉｆｃａｎｃｅ（　０．０５　１　Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ—ｍｅｄｉｔａｅｄ　ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ　ｄｒｕｇ　ｄｅｌｉｖｅｒｙ　ａｎｄ　ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ　ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｏｍｐｏｕｎｄ　ｏｓｓｏｔｉｄｅ　ｈａｖｅ　ｓｉｍｉｌｒａ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｅｆ－　ｆｅｅｔ　ｏｎ　ｆｒａｃｔｕｒｅ　ｈｅａｌｉｎｇ．　【Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］Ｃｏｍｐｏｕｎｄ　ｏｓｓｏｔｉｄｅ；Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ—ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ　ｄｒｕｇ　ｄｅｌｉｖｅｒｙ；Ｆｒａｃｔｕｒｅ　ｈｅａｌｉｎｇ；Ｍｏｒｐｈｏｍｅｔｒｙ　ｏｆｏｓ—　ｓｅｏｕｓ　ｔｉｓｓｕｅ　骨折在骨科疾病中最为常见，骨折的愈合过程是一　将基因给药应用于促进骨折愈合领域也取得乐观的成果　Ⅲ。个复杂的动态过程，是以骨组织的再生而获得组织形态　和功能的完全恢复，受多种生长因子的调控。在复位、　全身性给予复方骨肽注射液疗效肯定　，本研究比　较经皮将复方骨肽注射液超声导入局部骨折断端和静脉　使用复方骨肽，从动物实验水平观察比较骨肽不同的给　药方法对于骨折愈合的影响。　固定、功能锻炼的治疗原则基础上，近年来促进骨折愈　合方法及机制方面的研究取得飞速进展，包括植骨术、　骨生长因子、电刺激、活血化瘀药物的应用，一些学者　１材料与方法　１．１实验动物　６０只纯种健康新西兰兔，雌雄不拘，体重２．０～２．５ｋｇ，　基金项目：２００９年南京医科大学科技发展基金项目（０９ＮＪＭｕＭ０２４）　作者单位：南京医科大学第二附属医院骨科，江苏南京２１００１１　营养饲料颗粒喂养，自由饮水。（如遇实验动物死亡，则　２０１１年１２月　第８卷第６期　生物骨科材料与临床研究　ＯＲＴＨＯＰＡＥＤＩＣ　ＢＪＯＭＥＣＨＡＮＩＣＳ　ＭＡＴＥＲＩＡＬＳ　ＡＮＤ　ＣＬＩＮＩＣＡＬ　ＳＴＵＤＹ　５　添加动物以达到实验数量）。　１．２实验仪器与药物　低；１０分，骨髓腔处密度减低明显；１２分，骨髓腔完　全再通。将上述２参数评分相加即为骨折愈合的ｘ线评分。　１．５．２骨组织形态结构测量：上述实验兔在ｘ线片检查完　成后，使用过量的戊巴比妥钠耳缘静脉注射法将兔处死，　取双侧桡骨以骨折线为中间位置１．０ｅｍ长的标本，１Ｏ％甲　超声药物透入设备由北京某医疗技术公司提供，治　疗参数：超声频率２０ＫＨｚ，承载量０。５￣２．５ｍｌ／部位，透入　深度０－１２ｅｒａ可调，透药速度０．１￣３００ｕｇ可调。半自动图　像分析系统（ＭＯＰ４０，ＢＡＳ１０００）由德国某公司提供。复　方骨肽注射液（２ｍｌ／支）由南京某公司提供。　１．３骨折动物模型的建立和分组　６０只实验兔分批用３％戊巴比妥钠按２５ｍｇ／ｋｇ的剂量　经耳缘静脉注射麻醉。手术造成两侧桡骨骨折并有３ｍｍ　的骨缺损的标准骨折模型　，分层缝合各层组织。不予　包扎和固定。术后庆大霉索肌注预防感染，剂量为２ｒａｇ／　，每天１次，共３天。实验分为超声导入局部给药组、　静脉给药组、空白对照组３组（其中４０只右侧肢体为超　声导入局部给药实验组，左侧为空白对照组；２０只两侧　肢体均为静脉给药组）。将实验兔分成４个时间组（按第　２、４、６、８周），每组为１５只（其中超声／对照组１０只，　静脉组５只），每次取得３０根桡骨的实验数据。　１．４治疗方法　超声组：应用超声电导仪，将２ｍｌ复方骨肽注射液　注入专用耦合剂中，从双侧经皮给入右侧桡骨骨折部位，　电致孔强度４，超声强度６，作用时间３０分钟，每天１　次，７天为一疗程，间隔２天后可进行下一疗程，直至实　验完成。静脉组：将２ｍｌ复方骨肽从耳缘静脉处静脉推　注，每天１次，７天为一疗程，间隔２天后可进行下一疗　程，直至实验完成。　１．５观察指标　１．５．１　Ｘ线评分：各组实验兔分别于术后第２、４、６、８周麻醉　后在相同条件下摄正位ｘ线片，读片采用盲法，评价２项　参数（均由同一位医师完成）。根据骨折愈合过程中外骨　痂和骨折线的变化规律。将外骨痂和骨折线进行半定量　分析。　外骨痂评价标准：０分，外骨膜无反应；１分，外骨　膜出现反应；２分，外骨痂大小或密度较前明显提高；３　分，外骨痂连接形成皮质骨桥；４分，外骨痂轻度吸收；　５分，外骨痂明显吸收；６分，外骨痂接近完全吸收，骨　折处皮质骨密度接近正常皮质骨。　骨折线可定量标准：０分，骨折线清晰无变化；２　分，骨折线开始变为模糊；４分，骨折线模糊未消失，　但出现较牢固的连接迹象；６分，骨折线己消失，骨折　线被高密度的骨痂取代；８分，骨髓腔处密度开始减　醛固定液中固定４８小时，脱钙后石蜡包埋，切片，经常规　ＨＥ染色，行组织学定性分析及形态结构检测。第４周的　骨组织切片用骨组织计量参数测定软件测定标本矿化骨　痂面积（％琊矿化骨痂均宽（１ａｍ）。　１．６统计学分析　实验数据采用平均数４－标准差Ｃ２￣ｓ）表示。分别将　超声导入局部给药组与静脉给药住与对照组数据间比较　采用配对ｔ检验。所有数据分析采用ＳＡＳ软件。　２结果　２．１　Ｘ片影像学表现　术后第２周时超声组和静脉组骨折断端外骨痂量较　多，骨折间隙处密度开始增高；空白对照组仅出现外　骨膜反应，骨折线无变化（图１　３）。第４周时超声组　和静脉组骨折线模糊，被密度高的骨痂取代，外骨痂　已开始被吸收；空白对照组外骨痂连接形成骨桥，骨　折线仍可见，但模糊程度较前增加（图４．６）。第６周　时实验组外骨痂明显吸收，骨髓腔处密度开始减低；对　照侧断端仍可见骨桥，骨折线消失被高密度的骨痂取　代。第８周时实验组骨折处皮质骨密度接近正常皮质　骨，骨髓腔完全再通，基本恢复桡骨正常形态，对照　组外骨痂尚未完全吸收，骨髓腔未通（图７－９）。２参数　总的评分超声组与对照组具有明显差异（表１）（Ｐ＜０．０５），　静脉组与对照组有有明显差异（Ｐ＜０．０５），超声组比静　脉组评分高但统计学上无明显差异（Ｐ＞０．０５）。（表１）　表１　Ｘ片影像学评分（　ｓ）（ｎ＝１Ｏ）　２０１１年１２月　第８卷第６期　生物骨科材料与临床研究　０ＲＴＨＯＰＡＥＤＩＣ　ＢＩｏＭＥＣＨＡＮＩＣＳ　ＭＡＴＥＲＩＡＬＳ　ＡＮＤ　Ｃ　ＬＩＮＩＣＡＬ　ＳＴＵＤＹ　７　注射液至骨折断端和静脉使用复方骨肽，从第２周开始　ｘ线上就可以判读明显的变化，直到骨折愈合，再通过　光镜下观察及骨形态计量学分析进一步证明了不同的给　药方法对于促进骨折愈合的影响，复方骨肽加快了骨痂　的生成及骨骼重塑型过程。　别和对照组的检测指标对比都明显的差异（Ｐ＜Ｏ．０５），说　明超声给药技术的实用性。超声组ｘ线评分和第４周骨　组织形态计量学指标都优于静脉组，但无统计学差异（Ｐ　＞Ｏ．０５），进一步证明了复方骨肽注射液在促进骨折愈合　中的作用。　现代经皮给药理论是２０世纪８０年代初由美国医药学　家所提出，该理论基于药物能以一定速率通过完整皮肤　进入组织，从而进入体循环对靶组织器官产生药效的方　实验证明复方骨肽经超声经皮导入和静脉使用都可　以促进骨折愈合。超声导入降低了全身用药的副作用，　是一种安全有效的方法，其在骨科领域的应用有待于进　一法来治疗内脏和全身疾病。该理论的建立使给药途径产　生了革命性的影响，并成为目前最热门学科和研究方向　。步研究和推广。　参考文献　美国麻省理工学院科学家在１９９５年首次报道了利用　低频超声波介导成功地将胰岛素透入体内　。通过电致　【１　Ｊ　Ｈｉｔｕｎｅｎ　Ｍ０，Ｒｕｕｓｋａｎｅｎ　Ｍ，Ｈｕｕｓｋｏｎｅｎ　Ｊ，ｅｔ　ａ１．Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ．ｍｅｄｉ—　ａｔｅｄ　ＶＥＧＦ—Ａ　ｇｅｎｅ　ｔｒａｎｓｆｅｒ　ｉｎｄｕｃｅｓ　ｂｏｎｅ　ｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｖｉｖｏ［Ｊ］．　ＦＡＳＥＢ　Ｊ，２００３，１　７（６）：１１４７．　孔技术和超声空化技术以及角质层预处理技术，建立药　物透入的人工通道，达到克服皮肤屏障、细胞膜和组织　［２】　段景柱，崔少千．复方骨肽注射液促进四肢骨折愈合的临床观　察［Ｊ］．实用药物与临床，２００６，９（３）：１６９．１７３．　［３］周丕琪，沈霖，杨艳萍，等．复方骨肽注射液治疗胸腰椎骨质疏松　性骨折的临床观察［Ｊ】．中外医疗，２００８，２７（１７）：６８．　膜，使药物成分顺利透过正常皮肤进入病变组织，而发　挥药物的作用”　。超声电导仪的超声波能在组织中衰减　产生热作用，使药物获得定向转运的驱动力，提高药物　粒子的活化能。其产生的辐射压和对流转运作用，又可　以使药物获得定向转运的驱动力，产生定向运动。同时　［４】　顾坚毅．实验性骨折愈合的研究方法［Ｊ］．中医正骨，２００１，１３　（１１　４７．４９．　该仪器还采用包括生物学方法、药剂学方法、物理学方　法和电化学方法的综合应用，从不同角度促进药物向组　［５］　Ｍｉｔｒａｇｏｔｒｉ　Ｓ，Ｂｌａｎｋｓｃｈｔｅｉｎ　Ｂ，Ｌａｎｇｅｒ　Ｒ．Ｕｌｒｔａｓｏｕｎｄ－ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｒｔａｎｓｄｅｒｍａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｄｅｌｉｖｅｒｙ［Ｊ］．Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９５，２６９：８５０－８５３．　［６】Ｃｅｖｃ　Ｇ．Ｄｒｕｇ　ｄｅｌｉｖｅｙ　ｒａｃｒｏｓｓ　ｔｈｅ　ｓｋｉｎ［Ｊ］．Ｅｘｐ　Ｏｐｉｎ　Ｉｎｖｅｓｔ　Ｄｒｕｇｓ，　１９９７．６（１２）：１８８７－１９３７．　织的有效转运可使药物透皮速率增加几十倍甚至数百倍，　并且，在深部病变组织形成药物高浓度聚集，比口服和　［７］Ｌｉ　Ｘｉｅ　ＬＺ，Ｌｉ　Ｄ　ｅｔ　ａ１．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ　ｓｔＩｌｄｙ　ｏｆｔｈｅ　ｍａｈｅｍａｔｔｉｃａｌ　ｍｏｄｅｌｓ　ｆｏｒ　ｕｌｔｒａｓｏｎｄ　ｃｕｏｎｔｒａｓｔ　ａｇｅｎｔｓ［Ｊ］．Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｍｅｄ　Ｉｍａｇｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｏｌ，２００８，２３（２）：２９５—２９８．　静脉投药法的浓度高几十倍甚至百倍，提高了药物的利　用度。再者这种给药方法具有避免药物在肝脏的“首过　效应”和胃肠道的降解破坏，无血药浓度的峰谷变化，　减少个体差异和毒副作用等优点，是对传统给药观念的　重大突破　。　［８］余涛，张海南，郑海荣．基于超声的药物传送系统［Ｊ］．中国医学　影像技术，２００８，２４（１２）：２０１０－２０１２．　［９］Ｔａｎｇ　Ｈ．Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ　ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｏｆ　ｒｔｎｓａｄｅｒｍａｌ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔ　ｏｆｈｙ－　ｄｒｏｐｈｉｌｉｃ　ｐｅｒｍｅａｎｔｓ：ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｔｏ　ｌｏｗ－￣ｅｑｕｅｎｃｙ　ｓｏｎｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　骨组织形态计量技术　是近年来新兴的一门组织定　量技术，是一种直接研究骨组织变化的定量分析技术，　可提供很多新型的骨组织形态计量资料。本实验选取了　其中２个静态参数进行研究，矿化骨痂面积为矿化骨痂　面积占骨组织面积的比例，矿化骨痂均宽为将矿化骨痂　测ｎ次宽度后，取平均值。术后４周超声组、静脉组分　［Ｊ］．Ｐｈａｒｍ．２００１，９０（５）：５４５－５６８．　［１０］党耕町．骨组织形态计量学［Ｊ］＿中华骨科杂志，１９８９，２７（１　５７．５９．　【作者简介ｌ许诺（１９７７．甥，本科，主治医师。研究方向：创伤与修复。　［通讯作者］范磊（１９８１．）男，硕士，住院医师。研究方向：骨关节创伤。　（收稿日期：２０１１．０８．１５）　《生物骨科材料与临床研究》２０１２年杂志改版公告　亲爱的读者朋友：　您好，根据期刊发展和广大读者的要求，编辑部拟从２０１２年起将杂志增加页码，每期由原来的５６面增至６４面。　同时会根据作者要求进行图片彩色印刷。希望大家在新的工作中继续关心支持编辑部工作！