非小细胞肺癌患者外周血Th17和Treg表达的意义

３６４　养液洗涤３～５次。用含有１０　胎牛血清的ＲＰＭＩ　１６４０液调整细胞浓度为２×１０　／ｍＬ，用于流式细胞　学检测。　Ｔｈｌ７细胞流式检测　每孔加入１００　Ｌ浓度为　１　ｘ　１０　／ｍＬ的新鲜ＰＢＭＣｓ，然后分别加入１　ｔ，ｇ／ｍＬ　离子霉素和２５　ｎｇ／ｍＬ佛波酯各２０　Ｌ，再加入１０　ｔ＊ｇ／ｍＬ布雷菲得菌素Ａ　２０　Ｌ，于３７℃、５　ＣＯ：　中孵育６　ｈ。用ＰＥ标记的鼠抗人ＣＤ８单抗和　ＦＩＴＣ标记的鼠抗人ＣＤ３单抗进行细胞表面分子的　染色，通过Ｒｅａｇｅｎｔ　Ａ固定、Ｒｅａｇｅｎｔ　Ｂ破膜后再用　ＡＰＣ标记的鼠抗人ＩＬ一１７Ａ单抗或同型ＩｇＧ１标记　胞内抗体取０．４　ｍＬ　１　９／６多聚甲醛ＰＢＳ重悬细胞上　流式细胞仪进行检测，应用同型对照去除背景荧光，　采用ＦｌｏｗｊＯ　６．０分析软件对结果进行分析。Ｔｈｌ７　细胞以ＣＤ３　ＣＤ８一ＩＬ一１７Ａ　细胞在ＣＤ３　ＣＤ８一细　胞中的百分比表示。　Ｔｒｅｇ细胞流式检测　每孔加入１００　Ｌ浓度为　１　ｘ　ｌ０　／ｍＬ的新鲜ＰＢＭＣ，分别加入ＰＥ标记的鼠　抗人ＣＤ２５单抗和ＦＩＴＣ标记的鼠抗人ＣＤ４单抗进　行细胞表面染色，用Ｔｒｅｇ染色试剂进行破膜、固　定，ＰＢＳ洗涤、离心后，加入ＡＰＣ标记的鼠抗人　Ｆｏｘｐ３单抗及同型ＩｇＧｌ标记胞内抗体，０．４　ｍＬ　１　多聚甲醛ＰＢＳ重悬细胞上流式细胞仪进行检测，应　用同型对照去除背景荧光，采用Ｆｌｏｗｊｏ　６．０分析软　件对结果进行分析。Ｔｒｅｇ细胞以ＣＤ４　ＣＤ２５　Ｆｏｘｐ３　细胞在ＣＤ４　细胞中的百分比表示。　统计学方法　所有数据采用ＳＰＳＳ　１７．０软件　包进行统计学分析，计量资料结果用　±Ｓ表示。数　据符合正态分布，采用两两独立样本ｔ检验和配对　资料的ｔ检验，相关分析运用Ｐｅａｒｓｏｎ相关分析方　法；数据不符合正态分布，采用两独立样本秩和检验　或Ｋｒｕｓｋａｌ—Ｗａｌｌｉｓ检验。Ｐ＜０．０５为差异有统计学　意义。　结　果　患者疾病信息　临床共收集３１例健康对照和　６０例ＮＳＣＬＣ患者。健康对照中男１４例，女１７例，　年龄（５５．７７±１２．６４）岁。ＮＳＣＬＣ患者中男２５例，　女３５例，年龄（５７．４５±６．４３）岁。年龄、性别差异均　无统计学意义。ＮＳＣＬＣ患者包括工期１例，Ⅱ期６　例，Ⅲ期１３例，Ⅳ期４０例。将Ｉ～Ⅲ期归人局限期　组，Ⅳ期归入进展期组。ＮＳＣＬＣ患者包括腺癌３０　复旦学报（医学版）２０１５年５月，４２（３）　例，鳞癌３Ｏ例。　ＮＳＣＬＣ患者外周血Ｔｈｌ７的表达通过流式细　胞术（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｃｅｌｌ　ｓｏｒｔｅｒ，ＦＡＣＳ）对　６０例ＮＳＣＬＣ患者和３１例健康对照的外周血Ｔｈｌ７　（ＣＤ３＋ＣＤ８一ＩＬ一１７＋）进行检测并统计分析，发现　ＮＳＣＬＣ患者Ｔｈ１７表达较健康对照明显增高　ｒ（３．４Ｏ％±０．４９　）ＶＳ．（２．１６　±０．３９　Ａ０），Ｐ＜　０．００１］。在ＮＳＣＬＣ患者各亚组中（图１），腺癌组与　鳞癌组的Ｔｈ１７表达差异无统计学意义［（３．４７　±　０．４７　）＂ＵＳ．（３．２３　±０．５１　），Ｐ＝０．２４］，进展期　（ＩＶ期）组与局限期（Ｉ～Ｉｌｌ期）组的Ｔｈ１７表达差异　无统计学意义［（３．３５　±０．５３　）＂ＵＳ．（３．４９　±　０．４０　），Ｐ＝０．３Ｏ］。　ＮＳＣＬＣ患者外周血Ｔｒｅｇ的表达　分析６０例　ＮＳＣＬＣ患者和３１例健康对照外周血Ｔｒｅｇ（ＣＤ４＋　ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋）ＦＡＣＳ结果后，发现ＮＳＣＬＣ患者　Ｔｒｅｇ表达较健康对照明显增高［（７．７６　±１．５８　）　７２Ｓ．（４．４０　±１．０８　Ａ），Ｐ＜０．００１］。在ＮＳＣＬＣ患者　０各亚组中（图２），腺癌组与鳞癌组Ｔｒｅｇ表达差异无　统计学意义［（７．９８　±１．８９　）＂ＵＳ．（７．５５　９／６±　１．２０　／０４），Ｐ＝０．３ｏ２，而进展期组Ｔｒｅｇ表达较局限期　组明显升高Ｅ（８．１６　±１．５６％）＂ＵＳ．（６．９７　±Ｉ．　３５　），Ｐ＝０．ＯＯ５］。　ＮＳＣＬＣ患者外周血ｎｅｇ与Ｔｈ１７比值的变化　分析ＮＳＣＬＣ患者和健康对照外周血Ｔｒｅｇ与Ｔｈ１７　比值（Ｔｒｅｇ／Ｔｈ１７）变化发现，ＮＳＣＬＣ患者Ｔｒｅｇ／Ｔｈ１７　较正常对照明显增高［（２．３６±０．７３）１）Ｓ．（２．０５±　０．４６），Ｐ＝０．０３８］。进一步分析ＮＳＣＬＣ各亚组发现　（图３），腺癌组与鳞癌组的Ｔｒｅｇ／Ｔｈ１７比值差异无统　计学意义［（２．３７±０．８Ｏ）＂ＵＳ．（２．３５±０．６８），Ｐ＝　０。２４］，而进展期组Ｔｒｅｇ／Ｔｈ１７比值较局限期组明显　增高Ｅ（２．５３±０．７８）＂ＵＳ．（２．０３±０．５１），Ｐ＝０．０１２］。　讨　论　Ｔｈｌ７是近年来发现的一种新型免疫细胞，它　主要通过表达分泌特异性细胞因子ＩＬ一１７Ａ发挥生　物学效应。目前已有很多研究发现Ｔｈ１７在肿瘤患　者体内表达量增多，但是Ｔｈ１７在肿瘤的发病与进　展中的具体作用仍然存在争议。一些研究显示　Ｔｈ１７／ＩＬ一１７Ａ促进肿瘤生长。Ｎｕｍａｓａｋｉ等　在结　肠癌的小鼠模型中发现ＩＬ一１７可诱导新生血管生　成，同时诱导肿瘤细胞和纤维母细胞分泌ＶＥＧＦ、　何燕超，等．非小细胞肺癌患者外周血Ｔｈｌ７和Ｔｒｅｇ表达的意义　３６７　限期组。按肿瘤类型分析ＮＳＣＬＣ，虽然腺癌组与鳞　癌组的Ｔｒｅｇ表达差异无统计学意义，但是Ｔｒｅｇ表　达在腺癌组仍有所升高。这表明Ｔｒｅｇ表达与肿瘤　转移有关。　近年来，Ｔｈ１７／Ｔｒｅｇ模型的提出解释了很多Ｔｈ３／　Ｔｈ２经典模型无法解释的疾病与状态＿１１ｌ。Ｔｒｅｇ与　Ｔｈ１７相互依赖、相互抑制，它们在体内的平衡表达维　持机体稳态，Ｔｒｅｇ分泌的细胞因子ＩＬ－１０对Ｔｌｈ１７具有　强烈的抑制作用＿１　。本次研究发现晚期ＮＳＣＬＣ患者　Ｔｈ１７和Ｔｒｅｇ都有增加趋势，但ＮＳＣＬＣ患者Ｔｒｅｇ／　Ｔｈ１７较正常对照组明显升高，并且进展期患者Ｔｒｅｇ／　Ｔｈ１７也高于局限期患者。这些结果显示在ＮＳＣＬＣ患　者体内，虽然Ｔｒｅｇ和Ｔｈ１７均会升高，但是Ｔｒｅｇ相对　Ｔｈ１７处于优势状态，并且肿瘤进展后这种优势进一步　加强，这可能与Ｔｒｅｇ增高抑制Ｔｈ１７有关。　本文结果与大部分文献类似。Ｙａｎｇ等ｎ　发现　在肺癌患者的恶性胸腔积液中Ｔｒｅｇ／Ｔｈ１７增高预示　着患者预后不良。　等　研究发现ＮＳＣＬＣ患者　Ｆｏｘｐ３　Ｔｒｅｇ和Ｔｈ１７细胞表达均升高。但是也有一　些不一致的结果。Ｚｈａｏ等　研究显示，在肺癌患者　体内Ｔｒｅｇ表达量增多，但Ｔｈ１７表达量下降，并且随　着病情进展Ｔｈ１７表达量进一步降低。这可能与对　照组的选择、样本量及其他干预因素有关。综上所　述，在肿瘤发展中，Ｔｒｅｇ在诱导免疫耐受的过程中占　有重要作用，Ｔｒｅｇ对Ｔｈ１７有明显的抑制作用。　总之，Ｔｈｌ７和Ｔｒｅｇ均来自于初始Ｔ细胞，两　者在分化及功能上相互制约，正常生理状况下两者　会以一定的比例表达来维持机体的稳态。在　ＮＳＣＬＣ患者体内，这种稳态被打破，虽然Ｔｒｅｇ和　Ｔｈｌ７均是上调的，当免疫耐受增强后Ｔｒｅｇ表达可　能会抑制Ｔｈ１７表达。Ｔｈｌ７与Ｔｒｅｇ失衡可能是肺　癌的一个重要发病机制，而Ｔｒｅｇ／Ｔｈｌ７比值的变化　也与肺癌的预后相关。　参　考　文　献　［１］陈万青，张思维，邹小农．中国肺癌发病死亡的估计和流　行趋势研究［Ｊ］．中国肺癌杂志，２０１０，１３（５）：４８８—４９３．　［２］　汪济东，姜庆玲，孙琦．ｍ　ｂ＋ＩＶ期晚期肺癌治疗效果分析　［Ｊ］．临床肺科杂志，２０１３，１８（４）：３５８—３６１．　［３］　Ｒａｊａｔａｖａ　Ｂ，Ｒｏｂｉｎ　Ｄ，Ｃａｓｅｙ　Ｔ，ｅｔ　ａ１．Ｔｈｅ　Ｔｈｌ７　ｆａｍｉｌｙ：　ｆｌｅｘｉｂｉｌｉｔｙ　ｆｏｌｌｏｗｓ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｉｍｍｕｎｏｌ　Ｒｅｖ，２０１３，２５２　（１）：８９—１０３．　［４］　Ｋｈａｚａｉｅ　Ｋ，ｖｏｎ　Ｂｏｅｈｍｅｒ　Ｈ．Ｔｈｅ　ｉｍｐａｃｔ　ｏｆ　ＣＤ４　ＣＤ２５　Ｔｒｅｇ　ｏｉｌ　ｔｕｍｏｒ　ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ　ａｎｄ　ｃａｎｃｅｒ［Ｊ］．Ｓｅｍｉｎ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｂｉｏｌ，２００６，１６（２）：１２４—１３６．　［５］　Ｎｕｍａｓａｋｉ　Ｍ，Ｆｕｋｕｓｈｉ　Ｊ，Ｏｎｏ　Ｍ，ｅｔ　ａ１．Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ　１７　ｐｒｏｍｏｔｅｓ　ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ　ａｎｄ　ｔｕｍｏｒ　ｇｒｏｗｔｈ［Ｊ］．Ｂｌｏｏｄ，　２００３，１Ｏ１（７）：２６２０—２６２７．　［６］　Ｗａｎｇ　Ｌ，Ｙｉ　Ｔ，Ｋｏｒｔｙｌｅｗｓｋｉ　Ｍ，ｅｔ　ａ１．ＩＬ一１７　ｃａｎ　ｐｒｏｍｏｔｅ　ｔｕｍｏｒ　ｇｒｏｗｔｈ　ｔｈｒｏｕｇｈ　ａｎ　ＩＬ—－６—－Ｓｔａｒ３　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　ｐａｔｈｗａｙ　［Ｊ］．Ｊ　Ｅｘｐ　Ｍｅｄ，２００９，２０６（７）：１４５７—１４６４．　［７］　Ｍｕｒａｎｓｋｉ　Ｐ，Ｂｏｎｉ　Ａ，Ａｎｔｏｎｙ　ＰＡ，ｅｔ　ａ１．Ｔｕｍｏｒ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　Ｔｈ１　７　ｐｏｌａｒｉｚｅｄ　ｃｅｌｌｓ　ｅｒａｄｉｃａｔｅ　ｌａｒｇｅ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ　ｍｅｌａｎｏｍａ　［Ｊ］．Ｂｌｏｏｄ，２００８，１ｉ２（２）：３６２—３７３．　［８］　Ｍａｒｔｉｎ—Ｏｒｏｚｃｏ　Ｎ，Ｍｕｒａｎｓｋｉ　Ｐ，Ｃｈｕｎｇ　Ｙ，ｅｌａ１．Ｔ　ｈｅｌｐｅｒ　１７　ｃｅｌｌｓ　ｐｒｏｍｏｔｅ　ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ　Ｔ　ｃｅｌｌ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｔｕｍｏｒ　ｉｍｍｕｎｉｔｙ［Ｊ］．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，２００９，３１（５）：７８７—７９８．　［９］　Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅ　ＴＬ．Ｗｈａｔ　ａｒｅ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　Ｔ　ｃｅｌｌｓ（Ｔｒｅｇ）　ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ　ｉｎ　ｃａｎｃｅｒ　ａｎｄ　ｗｈｙ？［Ｊ］．Ｓｅｍｉｎ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｂｉｏｌ，　２０１２，２２（４）：３２７—３３４．　［１０］　Ｙｏｓｈｉｋｏ　Ｔ，Ｙａｓｕｎａｒｉ　Ｎ，Ａｋｉｋｏ　Ｎ，ｅｔ　ａ１．Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ　ｏｆ　ＣＤ４５ＲＯ　ｓｕｂｓｅｔ　ｉｎ　ＣＤ４　ＣＤ２５　ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　Ｔ．ｃｅｌｌｓ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕ１ａｒ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ　［Ｊ］．Ｃａｎｃｅｒ　Ｌｅｔｔ，２０１　１，３０７（２）：１６５—１７３．　［１１］　Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ　ＬＥ，Ｈａｔｔｏｎ　ＲＤ，Ｍａｎｇａｎ　ＰＲ，ｅｔ　ａ１．Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ　１　７　ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ　ＣＤ４＋ｅｆｆｅｃｔｏｒ　Ｔ　ｃｅｌｌｓ　ｄｅｖｅｌｏｐ　ｖｉａ　ａ　ｌｉｎｅａｇｅ　ｄｉｓｔｉｎｃｔ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　Ｔ　ｈｅｌｐｅｒ　ｔｙｐｅ　１　ａｎｄ　２　ｌｉｎｅａｇｅｓ［Ｊ］．Ｎａｔ　Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００５，６（１１）：１１２３—１１３２．　Ｅ１２］　Ｈｕｂｅｒ　Ｓ，Ｇａｇｌｉａｎｉ　Ｎ，Ｅｓｐｌｕｇｕｅｓ　Ｅ，ｅｔ　ａ１．Ｔｈｌ７　ｃｅｌｌｓ　ｅｘｐｒｅｓｓ　ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ一１０　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ａｎｄ　ａｒｅ　ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　ｂｙ　Ｆｏｘｐ３　ａｎｄ　Ｆｏｘｐ３　ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　ＣＤ４　Ｔ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　ａｎ　ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１０　ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｍａｎｎｅｒ［Ｊ］．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，２０１１，３４　（４）：５５４—５６５．　［１３］　Ｙａｎｇ　Ｇ，Ｌｉ　Ｈ，Ｙａｏ　Ｙ，ｅｔ　ａ１．Ｔｒｅｇ／Ｔｈｌ７　ｉｍｂａｌａｎｃｅ　ｉｎ　ｍａｌｉｇｎａｎｔ　ｐｌｅｕｒａｌ　ｅｆｆｕｓｉｏｎ　ｐａｒｔｉａｌｌｙ　ｐｒｅｄｉｃｔｓ　ｐｏｏｒ　ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ［Ｊ］．ＯｎｃｏｌＲｅｐ，２０１５，３３（１）：４７８—４８４．　［１４］　Ｌｉ　Ｓ，Ｌｉ　Ｙ，Ｑｕ　Ｘ，ｅｔ　ａ１．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ　ｏｆ　ＴｒｅｇＦｏｘＰ３　ａｎｄ　Ｔｈ１７　ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ　ｂｌｏｏｄ　ｏｆ　ｎｏＢ．　ｓｍａｌｌ　ｃｅｌｌ　ｌｕｎｇ　ｃａｎｃｅｒ　ｐａｔｉｅｎｔｓ［Ｊ￣．Ａｒｃｈ　Ｍｅｄ　Ｓｃｉ，２０１４，１０　（２）：２３２—２３９．　［１　５］　Ｚｈａｏ　Ｉ　，Ｙａｎｇ　Ｊ，Ｗａｎｇ　ＨＰ，ｅｔ　ａ１．Ｉｍｂａｌａｎｃｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｔｈｌ７／　Ｔｒｅｇ　ａｎｄ　ｃｙｔｏｋｉｎｅ　ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ　ｉｎ　ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ　ｂｌｏｏｄ　ｏｆ　ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ　ａｎｄ　ｓｑｕａｍｏｕｓ　ｃｅｌｌ　．ｃａｒｃｉｎｏｍａ［Ｊ］．ＭｅｄＯｎｃｏｌ，２０１３，３０（１）：４６１—４７０．　（收稿日期：２０１４—０３—０５；编辑：段佳）