目前应用的两种快速序列测定技术是Sanger等（1977）提出的酶法（双脱氧链终止法）和Maxam（1977）提出的化学降解法。尽管其原理截然不同，但这两种方式都一样生成彼此独立的假设干组带放射性标记的寡核苷酸，每组核苷酸都有一起的起点，却随机终止于一种（或多种）特定的残基，形成一系列以某一特定核苷酸为结尾的长度各不相同的寡核苷酸混合物，这些寡核苷酸的长度由那个特定碱基在待测DNA片段上的位置所决定。然后通太高分辨率的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，经放射自显影后，从放射自显影胶片上直接读出待测DNA上的核苷酸顺序。
高分辨率变性聚丙烯酰胺凝胶电泳亦是DNA序列测定技术的重要基础，可分离仅差一个核苷酸、长度达300~500个核苷酸的单链DNA分子。DNA序列测定的简便方式为详细分析大量基因组的结构和功能奠定了基础，时至今日，绝大多数蛋白质氨基酸序列都是依照基因或cDNA的核苷酸序列推导出来的。
除传统的双脱氧链终止法和化学降解法外，自动化测序事实上已成为现今DNA序列分析的主流。另外，新的测序方式亦在不断显现，如上世纪90年代提出的杂交测序法（sequencing by hybridization，SBH）等。
一、双脱氧结尾终止法测序
㈠ 原理
双脱氧结尾终止法是Sanger等在加减法测序的基础上进展而来的。其原理是：利用大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ，以单链DNA为模板，并以与模板事前结合的寡聚核苷酸为引物，依照碱基配对原那么将脱氧核苷三磷酸（dNTP）底物的5′-磷酸基团与引物的3′-OH结尾生成3′,5′-磷酸二酯键。通过这种磷酸二酯键的不断形成，新的互补DNA得以从5′→3′延伸。Sanger引入了双脱氧核苷三磷酸（ddTNP）作为链终止剂。ddTNP比一般的dNTP在3′位置缺少一个羟基（2′,3′-ddNTP）（图7-4-1），能够通过其5′三磷酸基团掺入到正在增加的DNA链中，但由于缺少3′-OH，不能同后续的dNTP形成3′,5′-磷酸二酯键。因此，正在增加的DNA链再也不延伸，使这条链的延伸终止于那个异样的核苷酸
处。如此，在4组独立的酶反映体系中，在4种dNTP混合底物中别离加入4种ddNTP中的一种后，链的持续延伸将与随机发生却十分特异的链终止展开竞争，在掺入ddTNP的位置链延伸终止。结果产生4组别离终止于模板链的每一个A、每一个C、每一个G和每一个T位置上的一系列长度的核苷酸链。通太高分辨率变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，从放射自显影胶片上直接读出DNA上的核苷酸顺序。双脱氧链终止法测序原理如图7-4-2所示。
OHOPOHγOOPOHβOOPOHαOA,C,G or TO1'3'OHdNTP2'HOHOPOHγOOPOHβOOPOHαOA,C,G or TO1'3'HddNTP2'H
图7-4-1 脱氧核苷三磷酸和双脱氧核苷三磷酸分子结构
加ddATP反应 3'ACTG— 5' 3'AACTG— 5'
3'AGTGTGAACTG— 5'
5′GAGTCACACTTGAC—— 3′待测单链DNA
3′CTG— 5′引物、Klenow酶、 dATP、dGTP、dCTP、dTTP 和少量α-32P-dATP
加ddCTP反应
3'CAGTGTGAACTG— 5' 3'CTCAGTGTGAACTG— 5'
加ddTTP反应 3'TGAACTG— 5' 3'TGTGAACTG— 5'
加ddGTP反应 3'GAACTG— 5' 3'GTGAACTG— 5' 3'GTGTGAACTG— 5'
3'TCAGTGTGAACTG— 5'
A
C
T
变性凝胶电泳、 放射自显影
G 5′
测序图谱识读
GAGTCACACTT 3′
图7-4-2 双脱氧链终止法测序原理
㈡ 模板
有两种类型的DNA模板能够作为Sanger法测序的模板，即纯化的单链DNA和经热变性或碱变性的双链DNA。
1．单链DNA模板 在一样情形下，可将靶DNA片段克隆于M13mp载体，从重组克隆M13mp系列噬菌体颗粒中分离取得的单链DNA模板。这种单链模板成效最正确，只要细心把握模板与引物的最正确比例，有体会的测序人员通过一次结尾终止反映，能读取500个以上的核苷酸序列。
2．经热变性或碱变性的双链DNA模板 尽管采纳变性双链DNA作测序模板显然简单且方便，但事实上很难取得单链模板那样的中意结果。利用双链质粒模板测序，其中有两个相当重要的因素，即模板的质量和聚合酶的种类。用小量制备的质粒DNA来测定未知序列的DNA克隆往往因为有污染而并非可取，高纯度的质粒最好采纳氯化铯-溴乙锭梯度平稳超速离心法制备。第二是应采纳高质量的聚合酶。一次结尾终止反映亦可能读出300核苷酸序列。应该注意的是，适合做双链模板的质粒，最好具有较高的拷贝数并有插入失活的选择标志，有配
套的通用引物结合区。最经常使用的载体系统是pUC系列、pGEM系列及Bluescript系列等。双链模板测序最大的优势是对已知序列DNA的亚克隆进行鉴定，可省略再经M13载体亚克隆获取单链模板进程。
㈢ 引物
酶法测序反映中都有一个与模板链特定序列互补的合成的寡核苷酸作为DNA合成的引物。不管是将靶DNA片段克隆于M13mp载体获取的单链DNA作模板，仍是采纳变性双链DNA（如变性质粒DNA）模板，都有能够与位于靶DNA侧翼的载体序列相退火的通用引物（universal primer）可用，而没必要另行设计与未知DNA序列互补的引物。适合于M13mp系列载体的通用引物一样长15~29个核苷酸，固然这些引物也一样适用于那些克隆于pUC系列质粒的DNA进行双链测序。这些测序用的通用质粒及其通用引物可直接从许多厂商购买到。
㈣ DNA聚合酶
如前所述，选用适合的DNA聚合酶进行测序反映也是保证测序质量的重要因素之一。经常使用于双脱氧结尾终止法测序的有几种不同的酶：
1．大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow片段） 此酶是最先用于成立Sanger测序的酶。但通常会有两个问题：①Klenow片段的持续合成能力较低，通常只能取得约250~350个核苷酸的序列，而且由于聚合酶随机从模板上解离而终止链延伸，通常会产生较高的本底和假带；②对同聚核苷酸段或其他含牢固二级结构的区域复制效能低下。但此酶价钱廉价，对已知序列的亚克隆进行鉴定仍有应用价值。
2．测序酶（sequenase） 该酶是一种通过化学修饰的T7噬菌体DNA聚合酶，其原先很强的3′→5′外切酶活性，经化学修饰后大部份被排除。目前经常使用的测序酶多数是基因工程产品，完全缺失3′→5′外切酶活性，具有活性超级稳固靠得住、持续合成能力强和聚合速度高等优势，是测定较长DNA的首选酶。市售的各类以该酶为基础的测序试剂盒，成效甚佳。
3．耐热DNA聚合酶 PCR技术的应用正在不断扩大，耐热DNA聚合酶应用于以Sanger双脱氧链终止法为基础的DNA测序方案，已进展成为被称为“循环测序”或“线性扩增测序”方式。在该类测序方式中，由于利用了耐热DNA聚合酶，与其他DNA聚合酶相较较具有二大优势。其一，由于采纳热循环方式
线性扩增模板DNA，取得清楚可辨的序列梯带所需要的模板DNA量少；其二，由于，耐热DNA聚合酶可在95℃高温下维持稳固，测序反映能够在高温（70~80℃）下进行。因此能克服富含GC序列的模板形成自身二级结构对测序的阻碍。因此，循环法能够方便地对PCR产物、质粒DNA、λDNA和粘粒DNA等双链模板进行序列测定，专门有利于对高GC碱基含量的模板测序。
循环测序法利用了热循环仪的自动循环的高效能力。循环测序反映与一般PCR反映有所不同。只需一条引物，通过单引物进行热循环，模板DNA以线性方式被扩增，而不是标准PCR的指数方式扩增；反映底物除四种脱氧核苷三磷酸（dNTP）外，还加入了双脱氧核苷三磷酸（ddNTP），进行扩增时，链的延伸终止于掺入ddNTP的位置，产生别离终止于不同核苷酸的一系列不同长度的扩增片段。
㈤ 放射性标记
传统的DNA测序方式都采纳α-32P-dNTP作为放射性标记物，但由于32P发射的高能β射线，常会引发二个问题。第一是致使放射自显影图谱条带扩散、分辨率低，限制了识读序列的数量和准确性。第二是32P衰变会致使DNA样品分解，通常都应在测序反映后24h内进行电泳，不然无法取得好的结果。
最近几年来α-35S-dNTP被普遍采纳，是由于
35
S产生较弱的β射线，克服
了32P的二大缺点。放射自显影图谱具有较高的分辨率和较低的本底，测序反映产物可在-20℃保留一周，而分辨率并非下降。
㈥ 关于DNA序列的识读
DNA序列的识读是一个熟能生巧的进程。注意几点技术：①在显影前后必然要注意标明模板名称、日期和测序人等，并标明各套反映位置；②识读时从显而易见的特点序列开始，如持续的同聚核苷酸（如TTTTT、AAAAA）或交替显现的嘌呤和嘧啶（如GTGTGTGT），一旦找到这种序列，即可较快地确信目的序列的位置。
二、Maxam-Gilbert化学降解法测序
几乎在双脱氧法进展的同时，1977年Maxam-Gilbert等提出了化学降解法。自Maxam-Gilbert第一次提出以来，其实验方案大体上没有转变。
㈠ 原理
化学降解法与包括合成反映的链终止法不同，需要对原DNA进行化学降解。其大体原理是，第一对待测DNA结尾进行放射性标记，再通过5组（也能够是4组）彼此独立的化学反映别离取得部份降解产物，其中每一组反映特异性地针对某一种或某一类碱基进行切割。因此，产生5 组（或4组）不同长度的放射性标记的DNA片段，每组中的每一个片段都有放射性标记的一起起点，但长度取决于该组反映针对的碱基在原样品DNA分子上的位置。尔后各组反映物通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，通过放射自显影检测结尾标记的分子，并直接读取待测DNA片段的核苷酸序列。测序原理如图7-4-3所示。
图7-4-3 化学裂解法测序原理
*GATCGGACCT *GATCGGACC *GATCGGAC *GATCGGA *GATCGG *GATCG *GATC *GAT *GA *G G G+A T+C C G反应 G+A反应 T+C反应 C反应 5' *P-GATCGGACCT 3'
㈡ 待测DNA的结尾标记
化学降解法测序第一要制备单侧结尾标记的待测DNA片段。DNA片段的核素标记有三种方式：
1．利用T4噬菌体多核苷酸激酶和γ-32P-ATP标记DNA的5ˊ-结尾 关于去5′-磷酸化的DNA片段，T4噬菌体多核苷酸激酶能够通过正向反映将γ-32P-ATP的γ-磷酸基转移至DNA的5ˊ-结尾；关于5′-磷酸化的DNA片段，在过量ATP条件下，该酶能够通过互换反映将γ-32P-ATP的γ-磷酸基与DNA的5ˊ-结尾磷酸基发生互换反映而标记。但关于双链DNA片段，由于DNA的双侧均被标记，不能直接用于测序反映。需要经限制性内切酶切割，电泳分离二种不同大小的标记片段，或直接用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离二条单链，但这种分离方式比较困难，较少利用。
2．利用结尾转移酶和α-32P-ddNTP标记DNA的3ˊ-结尾 在二价阳离子存在下，结尾转移酶催化dNTP加入DNA分子的3ˊ-羟基结尾，若是作为底物的核苷酸通过修饰（如ddNTP），那么能够在DNA的3ˊ-OH上仅加入一个核苷酸。关于双链DNA片段，亦存在DNA的双侧均被标记问题，可通过上述一样的方式分离。
方法A： 用两种不同的限制性内切酶切割DNA片段，且其中只有一种酶可产生3′凹末端。 5′ 3′ 3′ 5′ α-32P-dNTP DNA聚合酶ⅠKlenow片段 5′ 32pN 3′ 3′ 5′
图7-4-4 对双链DNA进行不对称标记的经常使用方式
方法B： 5′GATC 3′ 用两种可产生不同3′3′ TTAA5′ 凹末端的限制性内切酶切割DNA。 α-32P-dGTP DNA聚合酶Ⅰ α-32P-dATP Klenow片段 GATC G32p GATC 32pA TTAA 3．利用Klenow片段和α-32P-dNTP对限制性内切酶产生的3ˊ-凹进结尾进行标记 这种方式能直接制备单侧结尾标记的DNA，但要求待测DNA能知足以下条件之一：①DNA两头的一侧为3ˊ-凹进结尾，而另一侧为平端或3ˊ-凸出结尾；②两头虽均为3ˊ-凹进结尾但结尾单链结构不同，这时可选择不同的γ-32P-NTP来实现结尾标记。这是对双链DNA进行不对称标记的经常使用方式，如图7-4-4所示。
CS载体系列（CS是chemical sequecing的缩写）是专门为化学降解法测序进行结尾标记而构建的一类克隆载体，如pSP64CS和pSP65CS。这种载体最重要的特点是，在待测DNA克隆片段的周围有两个可被限制性酶Tth111识别的典型位点（GACN↓NNGTC，不对称），能在克隆DNA片段双侧不同的3ˊ-凹进结尾，从而方便地实现对待测DNA的单侧标记。
值得专门注意的是，化学降解法对标记的待测DNA纯度有较高的要求，因为盐浓度会干扰肼对胸腺嘧啶的修饰，也会抑制A+G反映中的去嘌呤进程。因此，标记的DNA一样要经酚/氯仿抽提、70%乙醇洗涤除盐，并用去离子水溶解而不用TE缓冲液。
㈢ 碱基特异的化学切割反映
在化学降解法中，专门用来对核苷酸作化学修饰并打开碱基环的化学试剂要紧有肼（hydrazine）和二硫酸甲酯（dimethylsulphate）。
肼又叫联氨（NH2-NH2），在碱性条件下，能作用于T/C的C4和/或C6原子位置，并同C4-C5-C6环化形成一种新的五元环。肼进一步作用释放出吡唑啉酮环。在六氢吡啶的作用下，通过β排除反映，该碱基两头的磷酸基团便会以磷酸分子形式从糖环上释放出来，从而致使在那个核苷酸位置上发生DNA断裂若是在此反映体系中加入1mol/L浓度的盐，那么肼同T的反映速度会下降，即可发生C特异的化学切割反映。因此，能够依照这一特点来区别C和C+T这2种化学切割反映。化学反映进程如图7-4-5所示。
二硫酸甲酯[(CH3O)2SO2]，能使DNA碱基环中的氮原子发生甲基化反映。在DNA测序分析中所涉及的甲基化位点是G的N7原子和A的N3原子。在中性pH环境中，这2种碱基的甲基化作用，都足以致使其糖苷键发生水解作用，而留下失去碱基的糖-磷酸骨架。再通过碱催化的β-排除反映水解无碱基糖环两
头的磷酸二酯键，造成DNA在此位点发生断裂。同时，已知DNA中G的N7原子甲基化速度比A的N3原子快4~10倍，故在中性条件下水解速度G位置也比A位置要快得多（差4~6倍），这是初期Maxam-Gilbert化学降解法测序分辨DNA中G和A的大体依据。现行的化学裂解反映，都采纳六氢吡啶与DNA中的甲基化碱基反映，且这种反映付甲基化的G是特异的，因此这种DNA链的断裂也仅发生在G残基位点。化学反映进程如图7-4-6所示。
化学反映设有5组独立的反映：G反映（在G 残基上的裂解）、A+G反映（在嘌呤残基上的裂解）、C+T反映（在嘧啶残基上的裂解）、C反映（在C残基上的裂解）和A＞C反映（在A和C 残基上的裂解），A＞C反映也能够不做。
OOOCH3HNO5'—OPOHOONH2NNH25'OOH2NOOHNHNNCH35'—OOPOOHNH2OOHOHPOO—3'—OPOHNOHOPO—O3'OHOOOPO—OH5'—OPOHO3'NH+5'N+OHH2CCCHCHCHOHOPOHON+5'—OOPONH2NOHOH—OOHOHOH+HOPOOPONHOPOO—3'O—3'O—3'
图7-4-5 联氨和六氢吡啶在胸腺嘧啶残基位点切割DNA的化学进程
ONOH3CSCH3OOCH3N+OCH3NCHOHNOH2NPOHOHOPO—OHPOHH2COOHCCHOOHNOHN2POHOHOPO—OOHNOHN2POHOHOPO—NHOO5'—ONON5'—ONON5'—ONONH3'3'3'5'—O+CHCHOHHOPO—ON+5'—OOPOHOOHCHN+OCH3NCHO+OH—HOHNOPO—O+H2NNNH23'3'图7-4-6 硫酸二甲酯和六氢吡啶在鸟嘌呤残基位点切割DNA的化学进程
㈣ 测序图谱的识读
关于测序电泳图谱的识读，化学降解法测序要比结尾终止法较为复杂，因为化学裂解反映并非是完全绝对碱基特异的。每组测序图谱为5条或4条（A＞C反映能够不做）泳道。需要通过从C+T泳道显现的条带中扣除C泳道的条带而推断T残基的存在。类似地，A残基的位置也要通过从A+G泳道中扣除G泳道的条带推断出来。同时，若是A＞C泳道中显现较强的条带，那么可确证A残基的存在。
实际读片时从胶片底部一个个地向顶部读取。从下至上，一个一个地从G+A泳道和C+T泳道二个列中确信只相差一个碱基的条带。若是在G+A泳道中显现一条带，就看G泳道中是不是有相同大小的带，若是有即为G碱基，若是没有那么为A碱基；一样，在C+T泳道中显现的条带，就检查C泳道中有无一样大小的条带，若是有即为C，无那么为T。若是做了A＞C反映，在该列中显现较强的条带时，可帮忙A的确信。
㈤ 化学降解法测序的优势
在化学降解法与链终止法问世之初，利用化学降解法进行测序不仅重复性更高，而且由于只需要简单的化学试剂和一样的实验条件，易为一般实验室和研究人员所把握。而链终止法需要单链模板、特异的寡核苷酸引物和高质量的大肠杆
菌DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow片段），这在二十世纪八十年代一样的实验室很难做到。但随着M13mp载体的进展、DNA合成技术的进步及Sanger法测序反映的不断完善，至今DNA测序已多数采纳Sanger法进行。但是，Maxam-Gilbert法可对合成的寡核苷酸进行测序，能够分析DNA甲基化修饰情形，还能够通过化学爱惜及修饰等干扰实验来研究DNA的二级结构和DNA与蛋白质的彼此作用，这些仍然是Maxam-Gilbert法所独具的鲜明特点。
固然，犹如双脱氧终止法一样，化学降解法测序的要紧限制因素也是测序凝胶的分辨能力。化学测序法一样都用32P标记，因此与用32S标记作标记的结尾终止法相较，它显示的条带较宽且有扩散现象，这限制了化学降解法在对较大DNA片段测序时的分辨能力。一样一块电泳胶上最多能读出200~250核苷酸序列。但是，若是按2个相反的取向别离从DNA片段的两头进行测序，那么可克服这一不足。
三、DNA序列分析的自动化
双脱氧终止法和化学降解法自1997年提出并的慢慢完善，无疑是目前公认的二种最通用、最有效的DNA序列分析方式，Sanger、Maxam和Gilbert等人也因此分享了1979年度诺贝尔化学奖。但实际操作中都存在一些一起的问题，如放射性核素的污染，操作步骤繁琐、效率低和速度慢等缺点，专门是结果判定的读片进程实在是费时又乏味的工作。随着运算机软件技术、仪器制造和分子生物学研究的迅速进展，DNA自动化测序技术取得了冲破性进展，以其简单（自动化）、平安（非同位素）、精准（运算机操纵）和快速等优势，已成为今天DNA序列分析的主流。
DNA序列分析的自动化包括两个方面的内容，一是指“分析反映”的自动化，更重要的一方面那么是指反映产物（标记DNA片段）分析的自动化。尽管各类DNA自动测序系统不同专门大，但Sanger法所采纳的DNA聚合酶和双脱氧核苷酸链终止的原理，亦是现今自动化测序的最正确选择方案。即多数沿用Sanger的双脱氧核苷酸链终止法原理进行测序反映，要紧的不同在于非放射性标记物和反映产物（标记DNA片段）分析系统。仅举例简介其大体原理：
㈠ ALF全自动激光荧光DNA测序系统
ALF自动DNA测序系统，是由德国海德堡欧洲分子生物学实验室（EMBL）等提出和设计的。该系统采纳非放射性的单一Cy5荧光素标记测序引物。沿用双脱氧链终止法进行反映，别离生成4组终止于不同种类碱基、带有Cy5荧光素标记的DNA片段。A、G、C和T四组反映物在变性凝胶上电泳，每一个泳道都有一个由激光枪和探测器组成的检测装置，当Cy5荧光素标记的DNA条带迁移至探测区并遇上激光时，荧光标记被激活并释放出光信号，光信号由光探测器接收；最后电脑将搜集到的信号（原始数据）进行处置，取得样品DNA的最终序列。
ALF系统包括电源、电泳系统、探测系统、驱控系统（运算机）和输出设备（画图仪）等。与传统的手工操作测序相较，ALF系统能直接获取原始数据并及时加以处置。该系统在仪器硬件和驱动软件的设计上都进行了不断的改良，最近几年推出了ALF expressTM全自动激光荧光DNA测序仪。该仪器设计独特，可提供快速靠得住的核酸测序、片段分析和突变检测。目前普遍应用于人类基因组打算，在此种大规模序列测定中，该仪器起到了重要的初筛作用。
㈡ ABI型全自动DNA测序仪
ABI测序仪是由Perkin Elmer（PE公司）推出的DNA自动化测序仪。其特点是采纳专利的4种荧光染料别离标记终止物ddNTP或引物，经Sanger测序反映后，反映产物3′端（标记终止物法）或5′端（标记引物法）带有不同的荧光标记。一个样品的4个测序反映产物可在同一泳道内电泳，从而降低测序泳道间迁移率不同对精准性的阻碍。通过电泳将各个荧光标记片段分开，同时激光检测器同步扫描，激发的荧光经光栅分光，以区分代表不同碱基信息的不同颜色的荧光，并在CCD（charge-coupled device）摄影机上同步成像。电脑可在电泳进程中对仪器运行情形进行同步检测，结果能以电泳图谱、荧光吸收峰图或碱基排列顺序等多种方式输出。
ABI测序仪包括电泳系统、激光检测装置、power Macintosh型苹果电脑、HP1600CM型彩色打印机、DNA序列分析软件和DNA片段大小和定量分析软件（Gene ScanTM）。该系统采纳电脑单点操纵整个DNA测序仪，包括电泳参数设置、数据搜集、数据分析及结果输出等。目前PE公司已生产出377,373,310和3700型DNA测序仪。377型全自动DNA测序仪为最新产品，具有可一次测
定多个样品（64个以上）、测序精准度高和每一个样品判读序列长（约700bp）等优势。测序速度高达200bp/h，比373型效率提高了许多。
ABI测序仪在人类基因组测序和cDNA测序研究中应用最为普遍。另外，亦能够利用各类辅助软件进行DNA定量分析和大小分析，故可普遍应用于基因突变分析（SSCP）、DNA指纹图谱分析、基因连锁图谱分析及基因表达水平分析等。
四、测序策略
尽管核酸序列测定方式愈来愈成熟、简便而且能够自动化，但事实上，关于一个片段较长、序列未知的待测核酸而言，仍然是一件耗时且繁琐的工作。关于一个待测DNA分子，要制定一个能够简捷准确的测定方案，一样能够从以下几个方面考虑：
⑴ DNA片段大小。
⑵ 背景资料：是不是清楚DNA限制性酶切图谱，是不是有一段已知序列，是不是具有重复序列等。
⑶ 测序目的：①测定未知序列；②确信重组DNA的方向与结构；③对突变（如点突变）进行定位和鉴定；④比较性研究，如比较同种病毒不同株系之间的基因不同。后3种测序目的称为确证性测序。
⑷ 实验条件：如手工测序仍是自动化测序，合成引物费用等。
由于单套测序反映所能准确测定的DNA序列最长一样仅400~500bp。因此，在进行序列测定之前，必需第一考虑待测DNA分子的大小，第二是所要测定的序列范围和要求的序列精准程度等，再结合实验室的条件选择切实可行的克隆及测序方案。
㈠ 确证性测序策略
多数情形下，测序是对已知序列的次级克隆进行鉴定和证明（即确证性测序），如次级克隆DNA的插入方向、定点突变的检测、删切产物的鉴定和待表达基因阅读框架的调整等。这种DNA片段通常较小，只需了解两头的部份序列即可。因此只需直接克隆到M13mp或质粒载体中，进行单链或双链模板测序。关于一个稍大的DNA片段的确证性测序，能够利用通用引物别离从两头开始双向测序，再通过中间重迭部份拼出全序列。关于更大的的DNA序列，能够在序
列适当区段增加一个或数个测序引物，别离测序再拼出全序列。
㈡ 未知DNA序列的测定策略
未知DNA序列的测定是指确信一个未知序列的准确长度及核苷酸排列顺序。未知DNA序列的测定，复杂而费时。目前已进展了一些可行的策略。
关于较小的目的DNA片段（如小于400bp），能够利用直接利用M13mp或质粒系统（如pUC18等）克隆、测序。随着质粒DNA序列测定技术的改良，目前其测序水平大体上已达到M13mp单链DNA测序水平，利用质粒载体系统具有显著的优势。因此，除非有特殊用途，如体外定点突变，都能够用pUC系统代替M13mp系统进行克隆测序。
若是是数千个碱基的大片段未知序列DNA，且要求精准测定其整个序列，就必需将其切割成适当大小的各个片段（300~400bp）别离进行次级克隆再进行测序，最后拼出全序列。能够考虑以下几种方式：
1． 随机克隆法或称鸟枪法 这是一种传统的方式，即利用DNaseⅠ或超声波，将目的DNA大片段随机切割成小片段，并别离进行亚克隆，然后再测定亚克隆的序列，通过排列分析，可取得目的DNA的全序列。但由于用于测序的克隆是随机挑选出来的，因此某些区段往往被重复测定，有时需要很长时刻才能确信最后几个亚克隆的序列而拼出全序列。
2．限制性酶切片段亚克隆法 第一需要对目的DNA进行酶切分析确信其酶切图谱。再选择适合的限制性酶消化以制备各类不同长度的限制性酶切片段，并亚克隆到测序载体上成立亚克隆库。然后别离测定各个亚克隆的核苷酸序列，通过排列分析，即可获取目的DNA的全序列。但事实上应用此法相当不易，仅当目的DNA片段上限制性酶切位点散布较均匀、且片段不大情形下，可考虑用此策略。
3．定向持续次级克隆 大片段未知DNA序列片段的定向持续次级克隆法，亦称嵌套系列缺失突变体法，是目前经常使用的一种策略，此法具有节省工作量、便于拼读等优势。这些次级克隆具有其同的缺失起点（通常在目的DNA的一端），并慢慢延伸到目的序列不同距离。从而使目的DNA中较远距离的序列慢慢地进入了通用引物的测序范围之内。目前，利用核酸外切酶Ⅲ和核酸酶BAL31构建持续次级克隆的方式比较成熟。
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