鹅血液基因组DNA的简单快速提取方法研究_吴慧英

鹅血液基因组DNA的简单快速提取方法研究

吴慧英１，刘铀２，贾汝敏１＊，刘艳芬１，张丽１

（１．广东海洋大学动物科学系，广东湛江５２４０８８；２．广东海洋大学动物医学系，

广东湛江５２４０８８）

摘要：本研究针对家禽血液红细胞有细胞核的特点，研究适合鹅血液基因组DNA的廉价、简便、快速

的DNA提取方法，并为其它禽（鸟）类相关操作提供参考。通过裂解细胞，利用简便快速的操作方法将蛋白质和核酸分离，去除杂质，沉淀核酸，获得大量基因组DNA，并通过基因扩增检测其质量和效果。该方法提

NA电泳检测条带明量，无拖尾，含量及纯度均较高，能够用于分子生物学实验研究。与传统的取的基因组D

酚-氯仿DNA抽提方法相比，本实验建立的血液基因组DNA提取方法具有成本低、操作步骤简便和快速的特点，特别是对大量样品的提取更为实用。

关键词：DNA提取方法；鹅血液中图分类号：Ｓ８１４．８文献标识码：Ａ文章编号：１００５－８５６７（２０１０）０４－００２９－０３

SimpleandrapidextractionmethodofgoosebloodgenomeDNAWuHuiYing1，LiuYou2，JiaRumin1*，LiuYanfen1，ZhangLi1

(1.DepartmentofAnimalScience,GuangdongOceanUniversity,Zhanjiang524088,China;2.DepartmentofVeterinary

Medicine,GuangdongOceanUniversity,Zhanjiang524088,China)

Abstract：SimpleandrapidDNAextractionmethodwasestablishedaccordingtothefeaturethattheavianredbloodcellshavenucleolus,whichwouldprovidereferencesforotherfowls(birds).Bloodcellswerelysedandthenthenucleicacidwasseparatedfromproteins.ThenthegenomeDNAwasacquiredafterprecipitation.ThequalityofobtainedDNAwasdetectedbyPCRandelectrophoresis.TheobtainedgenomeDNAwascompleteandhighlypure.Thusitcouldbeusedasthetempleteforfurtheranalysis.TheresultsshowedthatthisDNAextractionmethodwassimple,fastandwithlowcost.Itwasespeciallyadapttotheextractionoflarge-scalesamples.

Keywords：DNAextractionmethod；gooseblood

获得高纯度和完整的基因组ＤＮＡ是进行后续分子生物学研究的基础，而寻找合适的ＤＮＡ提取方法是基因工程和分子生物学实验面临的首要问题。不同物种、不同材料其ＤＮＡ提取方法各异［１］。动物多采用活体采血继而从血液中提取ＤＮＡ，这样可以在不杀死动物的前提下对其基因组ＤＮＡ进行研究。从哺乳动物血液中提取基因组ＤＮＡ的方法大都是先得到淋巴细胞，再用蛋白酶Ｋ等消化。由于家禽及鸟类血液红细胞中有细胞核，ＤＮＡ含量丰富，因此应建立适合家禽血液生理的ＤＮＡ提取方法。目前，以鸡为材料的家禽基因组ＤＮＡ的提取方法较为常见，如ＣＴＡＢ法、ＳＤＳ法、异硫氰酸

收稿日期：2010-03-30

热硼酸盐法以及商业ＤＮＡ提取试剂盒等，但鲜胍、

见鹅血ＤＮＡ提取方面的报道；且有些方法较为繁琐和昂贵。

我国是世界上养鹅数量最多且品种资源最为丰富的国家。狮头鹅、合浦鹅作为我国优良的地方家禽品种资源，以其品质优良著称于世，丰富了世界家禽遗传资源基因库，尤其是狮头鹅作为我国乃至亚洲唯一的大型鹅种，具有体型大、适应性强、产肉性能好、生长速度快、耐粗饲等优良特性，是极为宝贵的家禽资源［２］，但两鹅种都存在就巢性强及产蛋率低等缺点，亟待从分子水平对其生物学特性进行研究。

*：通讯作者

基金项目：湛江市科技招标项目（0609135）、广东海洋大学基金项目（C04095）和校企合作项目（0810314）

·30·试验研究鹅血液基因组DNA的简单快速提取方法研究—吴慧英，等

上游引物：ＰＲＬ１－ＣＣＴＧＡＡＣＡＧＧＴＴＴＧＴＴＧＣＴＧＧ下游引物：ＰＲＬ２－ＣＡＴＧＧＡＴＣＴＧＣＴＧＡＧＣＴＴＧＣＴ

１０×ＰＣＲＰＣＲ反应体系：２０μＬ（ＤＮＡ模板５μＬ，

Ｂｕｆｆｅｒ２μＬ，２０ｐｍｏｌ／Ｌ正反引物各１μＬ，２．５ｍｍｏｌ／ＬｄＮＴＰ２μＬ，Ｔａｑ酶１μＬ，ｄｄＨ２Ｏ８μＬ）。反应条件：９４℃预变性５ｍｉｎ，３０个循环（９４℃变性５０ｓ，５５℃退火４０ｓ，７２℃延伸６０ｓ），７２℃再延伸１０ｍｉｎ。扩增完毕后用１％琼脂糖电泳检测。

1.6ISSR多态性分析检测以提取的ＤＮＡ为模板进行ＩＳＳＲ标记多态性分析，ＰＣＲ产物通过变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，以检测所获得的ＤＮＡ效果。

但现有ＤＮＡ提取方法对鹅血液基因组ＤＮＡ的提取不能取得较好效果。因此，笔者在借鉴和改进前人工作的基础上［３－９］，研究建立一种适合鹅血液ＤＮＡ提取的快速、简便、经济实用方法，以利于从分子水平上对鹅种生物特性进行研究，同时也为其它禽类分子遗传学的相关研究提供参考。

1材料和方法

０．１ＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ1.1试剂及样品ＤＮＡ提取液：

（ｐＨ８．０），０．５ＭＮａＣｌ，０．０５ＭＥＤＴＡ－Ｎａ２，２％ＳＤＳ，０．１％β－巯基乙醇，０．５％ＰＶＰ（聚乙烯吡咯烷酮）；抗凝剂ＡＣＤ［１５］；氯仿－异戊醇（２４：１）；琼脂糖（Ｓｉｇｍａ公司）；ＤＮＡＭａｒｋｅｒ、ＴａｑＤＮＡ聚合酶、ｄＮＴＰ均购自ＴａＫａＲａ公司；其它试剂均为国产分析纯。血液样品采集：狮头鹅、合浦鹅各６０只，无菌翅静脉采血０．５ｍＬ／只，加入抗凝剂ＡＣＤ，冻存于－２０℃备用。

）取２０μＬ抗凝全血放1.2DNA提取方法（１

入１．５ｍＬ离心管中，加入５００μＬＤＮＡ提取液，充分混匀，６５℃温水浴３０ｍｉｎ，期间振荡数次。（２）以１２０００ｒ／ｍ离心１０ｍｉｎ，小心取出上清转移至新的１．５ｍＬ离心管，在上清中加入１／１０体积的３ＭＮａＡｃ（ｐＨ５．２），４℃静置２０ｍｉｎ，再加入３００μＬ氯仿－异戊醇（２４：１），剧烈振荡，４℃静置２０ｍｉｎ，１２０００ｒ／ｍ离心１０ｍｉｎ。（３）转移上清至新的１．５ｍＬ离心管，加入等体积的异丙醇（－２０℃预冷），轻轻颠倒混匀，室温放置３０ｍｉｎ；１２０００ｒ／ｍ离心５ｍｉｎ，弃去上清。（４）用７５％酒精洗涤沉淀两次，将离心管倒置于吸水纸上５－１０ｍｉｎ，待风干后加入２００μＬＴＥ溶解沉淀，－２０℃低温保存备用。

1.3基因组DNA的纯度、浓度测定利用紫外分光光度计测定ＤＮＡ溶液在２６０ｎｍ和２８０ｎｍ处吸光度值，根据ＯＤ２６０ｎｍ与ＯＤ２８０ｎｍ比值来估计ＤＮＡ的纯度［１５］，用Ａ２６０／Ａ２８０比值表示。根据公式计算ＤＮＡ浓度：ＤＮＡ的含量（ｍｇ／ｍＬ）＝５０×Ａ２６０×稀释倍数／１０００

1.4琼脂糖电泳检测采用１％琼脂糖凝胶电泳检测ＤＮＡ的质量，观察电泳条带大小及是否有拖尾现象。

1.5PRL内含子2引物扩增检测根据ＮＣＢＩ发表的鹅ＰＲＬ基因，利用Ｐｒｉｍｉｅｒ５．０设计ＰＲＬ内含子两引物。ＰＣＲ引物序列如下：

2结果与分析

2.1基因组DNA的纯度、浓度测定结果若获得的ＤＮＡ样品纯度低于１．７，表明蛋白质被污染，可再次进行氯仿－异戊醇抽提除去蛋白质污染。本试验测得两个品种鹅ＤＮＡ纯度Ａ２６０／Ａ２８０比值均在１．７８±０．１６左右，接近纯ＤＮＡ比值１．８。ＤＮＡ浓度为１．３２±０．３７ｍｇ／ｍＬ，可见２０μＬ血样即可获得较高浓度。

2.2琼脂糖电泳检测结果琼脂糖电泳检测ＤＮＡ带型整齐、集中、无拖尾现象（见图１），说明该方法所提取的基因组ＤＮＡ完整、无降解。由图可见鹅血液基因组ＤＮＡ分子量大于１５０００ｂｐ。

图1合浦鹅、狮头鹅血液样品提取基因组DNA结果

M：DNAMarkerDL15,000；泳道1、2为合浦鹅血液提取DNA样品；泳道3、4为狮头鹅血液提取DNA样品

2.3PCR扩增结果一种基因组提取方法的好坏，最有效的评定方法是看其产物是否会影响后续的研究。由图２可以看出，ＰＲＬ基因内含子２片段扩增结果整齐、清晰且无杂带，与预期片段相符。该方法所提取的基因组ＤＮＡ可作为ＰＣＲ扩增的模板，用于进一步序列分析。

鹅血液基因组DNA的简单快速提取方法研究—吴慧英，等

试验研究·31·

ＤＮＡ的提否则会影响所提ＤＮＡ样品的质量。另外，

取量还取决于细胞的裂解程度，本方法采用提取

20001000750500250100

液破碎细胞，使基因组ＤＮＡ充分释放，有效地提高ＤＮＡ获得量。

本方法最大的特点就是不用蛋白酶Ｋ消化蛋白，而是用ＤＮＡ提取液的盐成分裂解细胞，用ＳＤＳ、氯仿－异戊醇等蛋白质变性剂有效的去除蛋白。盐（如Ｔｒｉｓ、ＥＤＴＡ、ＮａＣｌ等）的作用，除了提供一个合适的裂解环境外，还可抑制样品中的核酸酶在裂解过程中对核酸的破坏，维持核酸结构的稳定。应用此方法提取的鹅血液基因组ＤＮＡ，经ＰＣＲ扩增检测，均获得了目的条带，节约了大量成本。

笔者在进行氯仿：异戊醇（２４：１）抽提之前增加了一次离心去沉淀的步骤，同时用低浓度的ＮａＡｃ沉淀ＤＮＡ，以促进ＤＮＡ与多糖和其它次生代谢产物的分离，从而使最后获得的ＤＮＡ纯净度较高。应用此方法提取的鹅血液基因组ＤＮＡ，能够用于分子生物学实验研究、分子克隆、遗传多态性分析等，而且整个过程快速、简单，费用低廉，方便了常规实验室操作，特别是血液样本数量较大时更为实用。该方法也可以为其它禽（鸟）类的血液基因组ＤＮＡ的提取提供参考。

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图2合浦鹅、狮头鹅血液样品DNA经PCR扩增电泳结果

M：DNAMarkerDL2000；泳道1、泳道2分别为合浦鹅、狮NA经PCR扩增后PRL基因内含子2条带头鹅血液样品提取D

2.4ISSR标记多态性分析以提取的ＤＮＡ为模

板进行ＰＣＲ扩增，产物通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，结果各样品均能获得清晰稳定的条带（图３、图４），且多态性丰富，说明鹅个体之间存在遗传差异，研究价值较大。该方法提取的鹅基因组ＤＮＡ能够满足ＰＣＲ反应和后续分析的需要。

图3合浦鹅DNA样品ISSR多态性分析电泳图

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图4狮头鹅DNA样品PCR扩增后ISSR分析电泳图

3讨论

提取某样品核酸之前，首先要清楚地了解该

样品特性，包括其核酸含量、酶含量、特殊杂质含量等信息。哺乳类动物的红细胞是中心部凹陷的圆板状，循环血中的红细胞（除骆驼和羊驼之外）细胞核退化、消失；而家禽红细胞多数呈椭圆形，

所以用全血即是完整的真核细胞，中心有细胞核。

可直接提取基因组ＤＮＡ，且所需血样量不宜过多，