一、 ①实验前准备,每天早上到实验室后,先把超净工作台的紫外灯打开
15-20分钟。②超净台前做实验，需佩戴干净的橡胶手套/一次性薄膜手套，RNA抽提需带口罩。③取EP管/枪头时需用镊子，不可以用使用过的手套直接取用。取完EP管/枪头后，袋子及时封好。④橡胶手套须放入超净台照射紫外，实验操作过程中不得带出超净台，移液器在一天工作结束后调至最大量程，并用75%乙醇清洁移液器，枪头盒及超净台面。⑤实验进行的过程中或观看实验时,没有带口罩不要在超净台前讲话. 二、 总RNA抽提
1）细胞培养皿中细胞样品用1＊PBS洗两次后,用1ml枪将PBS吸干净，加入1ml Trizol (Invitrogen）溶液，吹打混匀，并吸至1。5ml RNase free EP管中使细胞充分裂解，室温静置5min;
组织样品用液氮充分研磨,加入1ml Trizol （Invitrogen）溶液，混匀,室温放置5min使其充分裂解；（管盖与管壁都需标记样品名称） 2）加入200μl氯仿，剧烈振荡混匀30s，使水相和有机相充分接触，室温
静置3—5min；（离心时离心管按顺序排放，离心完毕，离心管的顺序也按顺序排好，与第一步的顺序一致）
3） 4℃下，14，000g离心15min，可见分为三层，RNA在上层水相，移至另一个新的RNase free EP管；(用20—200ul的枪吸取上清，吸上清时,枪头应沿着液面上层吸取上清，枪头不可碰到、吸到中间层） 4）沉淀RNA：加入等体积异丙醇，轻柔地充分混匀（颠倒6—8次）（不
应用振荡器混匀),室温静置10min；
5） 4℃下，14,000g离心10min，收集RNA沉淀（如离心后仍不见EP管底部有沉淀，应将EP管放置在-80度冰箱过夜,继续在4℃下，14,000g离心10min，收集RNA沉淀),去上清；
6） 用75％乙醇洗涤两次（12,000g离心5min）（加入乙醇后只需轻轻颠倒EP管即可,不用振荡器震荡或枪头吸打沉淀）,超净台风干；沉淀不能过干或过湿，过干则不易溶解，过湿则乙醇残留。
1
7） 视沉淀量加入适量DEPC水（至少15ul）溶解沉淀. 三、去基因组
使用RNase—free的DNase І(Promega）,按以下体系配置反应液，37℃消化30min，65℃灭活10min。
RNA DNase І 10 x buffer H2O（RNase free) RNasin 总体积
然后按以下步骤操作：
1） 加入等体积的苯酚/氯仿,上下颠倒混匀，室温放置5min,后14，000rpm,
离心15min,取上清。
2） 加入等体积的氯仿，上下颠倒混匀,静置分层后14,000rpm,离心15min,取上清.
3）加入等体积异丙醇，轻柔地充分混匀（颠倒6—8次），—20℃静置15min；
4）4℃下，14,000g离心15min，收集RNA沉淀，去上清； 5）用75％乙醇洗涤两次（12,000g离心5min),超净台风干； 6）加入适量DEPC水（至少15ul)溶解沉淀。 四、总RNA纯度和完整性检测
1） 纯度检测:取1μl RNA样品50倍稀释,在核酸蛋白检测仪上测定OD值，
OD260/OD280的比值大于1。8，说明制备的RNA较纯,无蛋白质污染. 2） 总RNA完整性检测：取RNA样品1μl，1％琼脂糖凝胶电泳80V×20min，EB
染色10min，用凝胶成像系统观察并拍照，总RNA的5s rRNA， 18s rRNA和28s rRNA条带，三条条带完整的话即可证明总RNA抽提比较完整。 五、逆转录 1. mRNA：
1) 在RNase free的PCR管中配置下列溶液。
30 20 10 39.5 0.5 100
µl µl µl µl µl µl
2
2) 将上述溶液吹
保温5min，使立即冰上致冷， 性；
总体积
12
µl
Total RNA 1.0 H2O
µg µl
打均匀，置85℃RNA变性。随后以防止RNA复
3) 在该PCR管中加入下列试剂（Promega)
oligo(dT）
0.5
µl µl µl µl µl µl µl
Random primer 0 。5 10mM dNTP 2.0 RNase inhibitor
0。5
5 x buffer 4 。0 M—MLV 0 。5 总体积
4) 将上述20μl反应溶液30℃保温10min； 5) 42℃保温50min； 6) 85℃保温10min； 7) -20℃保存。 2。 microRNA：
使用茎环逆转录法,原理如下图： 1） 在去RNase的PCR管中配置以下溶液. 2）将上述溶
85℃孵打
开
total RNA
X个miR逆转录引物 H2O 总体积
1。0 0。5*X 12。5
µl µg µl
液混匀，育5min，以RNA二级结立即置于冰止RNA复性
8.0
构。随后上，以防
再次恢复二级结构；
3） 在另一去RNase的PCR管中配置以下溶液：
10mM dNTP (promega） RNase inhibitor （promega） U6逆转录引物
5x buffer M-MLV （promega）
3
2.0 0.5 0.5 4。0 0.5
µl µl µl µl µl
总体积 7.5 µl
4） 将3）溶液加入到1）溶液中，混匀后30℃保温10min； 5） 42℃孵育50min;
6） 85℃孵育10min灭活逆转录酶。 四、定量PCR检测 1.引物测试：
根据mRNA设计的引物正式实验前需进行qPCR测试其特异性和扩增效率，具体反应体系和反应条件如正式实验，每对引物需做模板水对照。
得到结果后，首先根据熔解曲线判断引物特异性,选择标准为：单峰且峰形偏窄、水对照无明显引物二聚体熔解曲线峰。若设计的多对引物熔解曲线均显示特异性良好，则应对比各引物的扩增曲线，优先选择Ct值小、扩增效率高的引物进行正式实验。
2．确定上机内容后，首先在记录本上编排好上机的样品排放顺序。（1)一个样品的加样尽可能安排在同一行（2)如正式实验中三次重复不能安排在同一板上,则需把三次重复中的实验分开,但同一次重复的实验不能分开两板 3．正式实验：
体系配制：
H2O 4ul
SYBR Green PCR Master Mix 10ul (TOYOBO）（使用前需振荡均匀）
上游引物 0。5ul （10uM) 下游引物 0。5ul (10uM） 总体积 15ul
计算好实验中需用多少份体系，则按具体量配置。体系分装会有损失，一般多配0。5份—-1份体系.
总的体系配好后，在振荡器中振荡均匀或用枪吸打均匀，然后15ul每管分装至8连管中。
3．cDNA用灭菌纯水稀释适当的浓度,一般为1：20稀释,如遇到基因表达低的样品，则适当降低稀释比例至1:10或1:5。cDNA按一定顺序排好后,即可加至刚配好的反应体系中.加样完毕，盖好八连管盖，并在八连管盖最上沿的边上标记好1—12的顺序(不可将标记写在反应管的盖子上，八连管盖避免裸手触摸中间透明
4
的荧光采集区域,且保证每孔均盖紧，否则影响重复性或可能出现熔解曲线峰漂移。)
4．把各排八连管放在掌上离心机上离心数秒. 五．上机：
5.1 先开电脑,进入Windows 界面。接着打开PCR仪电源开关。
5.2 打开7500软件，选择“新建\"，在“Template”下拉菜单中选择“60”或“65”
（普通基因检测为“60”,MicroRNA检测为“65”）
5。3 打开样品架，放入八连管，关上样品架，并在软件上选择已放反应管的孔位,剔除无反应管的孔位.
5。4 点击File菜单中Save，输入要保存结果的文件名,命名为日期-上机时间-客户名字简写，如100830—1008-WL表示8月30日10点08分魏立的实验. 5.5 点击Start键，开始运行程序。
5.6 程序运行完毕后,取出样品架上的八连管，按顺序关闭ABI PRISM 7500 SDS
软件、PCR仪电源开关。
5。7 在7500软件上标记好每个反应孔的样品名称及检测基因的名称，分类保
存好结果文件.
反应完成后，八连管应装到封口袋中，袋子上标记好文件名,客户的名字。（同一个客户的三次重复实验,则只需保存其中一次重复的反应管即可，其余可丢弃）
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