(12)发明专利申请
(10)申请公布号 CN 105087485 A (43)申请公布日 2015.11.25
(21)申请号 201510406329.2(22)申请日 2015.07.10
(71)申请人上海鑫宸医疗科技有限公司
地址200331 上海市普陀区祁连山南路
2891弄105号2317室(72)发明人钱兆与
(74)专利代理机构上海天翔知识产权代理有限
公司 31224
代理人吕伴(51)Int.Cl.
C12N 5/0783(2010.01)
权利要求书1页 说明书5页 附图1页
(54)发明名称
一种肿瘤特异性TIL细胞的培养方法(57)摘要
本发明属于生物医药检测领域，具体涉及一种肿瘤特异性TIL细胞的培养方法。本发明公开了一种肿瘤特异性TIL细胞的培养方法，通过两部特异性磁珠筛选，获得了肿瘤特异性TIL细胞。本发明方法操作简单，能高效地增殖培养出肿瘤特异性TIL细胞，大大提高了TIL细胞的杀瘤效果，同时采用无血清培养解决现有技术中潜在传播病毒和其他危险的风险，为其今后的广泛应用提供了基础。
C N 1 0 5 0 8 7 4 8 5 A CN 105087485 A
权 利 要 求 书
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1.一种肿瘤特异性TIL细胞的培养方法，其包括下列步骤：
a)无菌条件下制备固体肿瘤单细胞悬液或采集恶性胸腔积液或腹水；b)采用淋巴细胞分离液离心，收集含淋巴细胞的云雾状细胞层；c)云雾状细胞层用无菌缓冲液洗一次，再用无血清培养液洗一次，离心收集细胞；d)按1×106/ml的浓度将细胞悬于无血清培养液中，接种于细胞培养瓶或培养皿中而后置于饱和湿度、37℃、5％CO2的培养箱中静置培养，24小时后取出，收集悬浮细胞；
e)悬浮细胞采用磁珠分离仪分离CD8+T细胞；
f)CD8+T细胞采用磁珠分离仪分离CD8+PD-1+T细胞；g)CD8+PD-1+T细胞用无菌缓冲液洗一次，再用无血清培养液洗一次，离心收集细胞；h)按0.5-2.0×106/ml的浓度将CD8+PD-1+T细胞悬于无血清培养液中，培养的第1天无血清培养液加入终浓度为10U/ml的IFN-γ、100ng/ml的PHA,40-50U/ml的IL-2；而后隔1～2d加入含有IL-2100U/ml的无血清培养液连续培养5-7天；
i)含有IL-21000U/ml的无血清培养液下每隔2-3天传代培养，15-20天即可收集细胞。
2.如权利要求书1所述的培养方法，其特征在于所述无血清培养液包括基础培养基、维生素类物质、微量元素、2-巯基乙醇、丙谷二肽和甘油酯。
3.如权利要求书2所述的培养方法，其特征在于所述基础培养基是Iscove's Modified Dulbecco's Media或是RPMI-1640，或是Dulbecco's Modified Eagle Medium和Ham’s-F12按照1:1的体积比例混合而成。
4.如权利要求书2所述的培养方法，其特征在于所述维生素类物质含量为生物素1-5μM；肌醇0.1-0.2mM；叶酸0.01-0.02mM；烟酸0.03-0.05mM；砒洛醇7-10μM；叶黄素0.5-1μM；硫铵7-10μM；维生素B120.3-0.9μM；泛酸钙0.01-0.03mM。
5.如权利要求书2所述的培养方法，其特征在于所述微量元素：腐胺0.01mM；乙醇胺0.1mM；亚油酸0.001mM；柠檬酸铁10mg/L；硫酸铜0.05-0.1μM；硫酸锌5-10μM；硒酸钠0.01-0.1μM；氯化铝0.05-0.01μM；碘化钾0.04-0.06μM；氯化钴0.03-0.07μM。
6.如权利要求书2所述的培养方法，其特征在于所述2-巯基乙醇的含量为1.0-5.0μg/ml。
7.如权利要求书2所述的培养方法，其特征在于所述丙谷二肽的含量为0.5-3mM。
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CN 105087485 A
说 明 书
一种肿瘤特异性TIL细胞的培养方法
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技术领域
[0001]
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种肿瘤特异性TIL细胞的培养方法。
背景技术
肿瘤过继免疫治疗(adoptive immunotherapy，ACI)是指通过向肿瘤患者输注具有抗肿瘤活性的免疫细胞，直接杀伤或激发机体免疫反应杀伤肿瘤细胞，达到治疗肿瘤的目的。它包括非特异性激活和特异性激活的效应细胞，前者是采用非特异性刺激因子(IL2、干扰素)刺激前体效应细胞，使其活化为具有抗肿瘤活性的效应细胞，如LAK细胞、肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)、细胞因子诱导的杀伤细胞(Cytokine induced kill cells，CIK)等；特异性激活的效应细胞是指采用肿瘤抗原作刺激物所诱导的抗肿瘤效应细胞，如树突状细胞(DC)，细胞毒T淋巴细胞(CD8+细胞)等。ACI在恶性实体肿瘤治疗中的应用已引起了人们的普遍关注。
[0003] TIL细胞是特异性杀伤肿瘤细胞的效应细胞，其杀瘤活性较LAK细胞强50～100倍；TIL细胞疗法是一种特异性免疫活性细胞疗法，尽管其用于肿瘤治疗领域已有20多年的历史，但至今一直有新技术、新成果在不断报道。2004年Steve Rosenberg教授在PNAS上发表文章指出：肿瘤特异性的TIL治疗转移性黑色素瘤的临床有效率大于50％，35个病人中18名病人有响应，其中4人完全响应。TIL因其对肿瘤细胞具有较强的特异性杀伤作用，因而一直是国内外恶性肿瘤生物治疗的热点之一。[0004] 但是TIL细胞制备技术复杂，通常需要筛选上百个甚至几百个T淋巴细胞克隆才能得到肿瘤特异性的TIL细胞，同时目前，体外培养TIL细胞主要还是用含有人血清或FBS的培养基，使用动物血清的缺点是有潜在传播传染病的风险，以及由于异种蛋白导致过敏症的发生，而使用人AB血清的供应量有限，而且也存在传播传染病的风险。这些因素严重地限制了其的应用和有效性。
[0002]
发明内容
本发明的目的在于提供简便、有效的肿瘤特异性TIL细胞的培养方法，以克服现
有技术的缺陷。[0006] 为此，本发明公开了一种肿瘤特异性TIL细胞的培养方法，其包括下列步骤：[0007] 无菌条件下制备固体肿瘤单细胞悬液或采集恶性胸腔积液或腹水；[0008] 采用淋巴细胞分离液离心，收集含淋巴细胞的云雾状细胞层；[0009] 云雾状细胞层用无菌缓冲液洗一次，再用无血清培养液洗一次，离心收集细胞；[0010] 按1×106/ml的浓度将细胞悬于无血清培养液中，接种于细胞培养瓶或培养皿中而后置于饱和湿度、37℃、5％CO2的培养箱中静置培养，24小时后取出，收集悬浮细胞；
[0005]
悬浮细胞采用磁珠分离仪分离CD8+T细胞；
+++
[0012] CD8T细胞采用磁珠分离仪分离CD8PD-1T细胞；
++
[0013] CD8PD-1T细胞用无菌缓冲液洗一次，再用无血清培养液洗一次，离心收集细胞；
[0011]
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CN 105087485 A[0014]
说 明 书
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按0.5-2.0×106/ml的浓度将CD8+PD-1+T细胞悬于无血清培养液中，培养的第1天无血清培养液加入终浓度为10U/ml的IFN-γ、100ng/ml的PHA,40-50U/ml的IL-2；而后隔1～2d加入含有IL-2 100U/ml的无血清培养液连续培养5-7天；[0015] 含有IL-2 1000U/ml的无血清培养液下每隔2-3天传代培养，15-20天即可收集细胞；
[0016] 所述无血清培养液包括基础培养基、维生素类物质、微量元素、2-巯基乙醇、丙谷二肽和甘油酯；
[0017] 其中基础培养基是Iscove's Modified Dulbecco's Media、或者是RPMI-1640，或者是Dulbecco's Modified Eagle Medium和Ham’s-F12按照1:1的体积比例混合而成的。[0018] 在一些实施例中，其中维生素类物质含量为生物素1-5μM；肌醇0.1-0.2mM；叶酸0.01-0.02mM；烟酸0.03-0.05mM；砒洛醇7-10μM；叶黄素0.5-1μM；硫铵7-10μM；维生素B12 0.3-0.9μM；泛酸钙0.01-0.03mM。[0019] 微量元素：腐胺0.01mM；乙醇胺0.1mM；亚油酸0.001mM；柠檬酸铁10mg/L；硫酸铜0.05-0.1μM硫酸锌5-10μM；硒酸钠0.01-0.1μM；氯化铝0.05-0.01μM；碘化钾0.04-0.06μM；氯化钴0.03-0.07μM。
[0020] 其中2-巯基乙醇的含量为1.0-5.0μg/ml；[0021] 其中丙谷二肽的含量为0.5-3mM。[0022] 本发明方法操作简单，能高效地增殖培养出肿瘤特异性TIL细胞，大大提高了TIL细胞的杀瘤效果，同时采用无血清培养解决现有技术中潜在传播病毒和其他危险的风险，为其今后的广泛应用提供了基础。附图说明
[0023]
图1,不同培养基体外CD8+PD-1+T细胞增殖比较。
具体实施方式
[0024] 除非另有指示或定义，否则所有所用术语均具有本领域中的通常含义，该含义将为本领域技术人员所了解。[0025] 参考例如标准手册，为进一步详细描述在本发明的实践中所使用的常规技术，实践者可参看有关细胞生物学、组织结构学以及胚胎学的标准的教科书及评论。包括Teratocarcinomas and embryonic stem cell:A practical approach[E.J.Robertson编，IRL出版有限公司,1987]；Guide to techniques in Mouse Development[P.M.Wasserman等编，学术出版社,1993]；Embryonic Stem Cell Differentiation in Vitro[M.V.Wiles,Meth.Enzymol.225:900,1993]；Properties and uses ofEmbryonic Stem Cells:Prospects for Application to Human Biology and Gene Therapy[P.D.Rathjen等，Reprod.Fertil.Dev.10:31,1998]。[0026] 细胞生物学、蛋白质化学、和抗体技术可以在“蛋白科学中的当前方案”[J.E.Colligan等编辑，Wiley&Sons]、“细胞生物学中的当前方案”[J.S.Bonifacino等，Wiley&Sons]和“兔疫学功时当亦方案”[J.E.Colligan等编辑，Wiley&Sons]中找到。与本发明相关的试剂、克隆载体、和基因操作试剂盒可从商业供应商那得到，例如BioRad、
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说 明 书
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Stratagene、Invitrogen、ClonTech以及sigma-Aldrich公司。[0027] 细胞培养方法通常在“动物细胞培养：基本技术手册”最新版本(R.I.Freshney编辑，Wiley&Sons)；“细胞培养一般技术”(M.A.Harrison和I.F.Rae,剑桥大学出版)；和“胚胎干细胞：方法和操作规定”(K.Turksen编辑，Humana出版)中有描述。组织培养基和试剂可从商业供应商那得到，例如Gibco/BRL、Nalgene-Nunc International、Sigma Chemical Co.、以及ICN Biomedicals。以及本文中引用的一般现有技术；[0028] 此外，除非另有说明，否则未具体详述的所有方法、步骤、技术及操作均可以且已经以本身已知的方式进行，该方式将为本领域技术人员所了解。亦参考例如标准手册、上述一般现有技术及其中引用的其他参考文献.以下结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。[0029] 一、材料与方法[0030] (一)材料收集
[0031] 从上海医院收集6例晚期肿瘤患者(2例肺癌、1例肝癌、1例胃癌、1例十二指肠腺癌)的胸腔积液或腹水各200ml(肝素抗凝5U/ml)，立即进行分离制备试验。上述标本均为临床治疗过程中的废弃物。[0032] (二)实验方法
[0033] 1.肿瘤特异性TIL细胞的分离和FACS检测
[0034] 无菌收集经肝素抗凝的恶性胸腔积液或腹水100ml，经2000r/min离心10min，沉淀细胞用无菌缓冲液洗涤2次后悬于20ml的缓冲液中；
[0035] 而后将100％的淋巴细胞分离液5ml加入15ml的无菌离心管中，再小心加入10ml上述细胞悬液，经2000r/min离心20min，在100％的淋巴细胞分离液界面上收集云雾状的细胞层细胞即为肿瘤细胞与TIL细胞的混合体，1500r/min，离心5min，按1：10的体积比加入红细胞裂解液，吹打混匀后置4℃冰箱静置8min，1500r/min，离心5min，沉淀细胞用无菌缓冲液洗一次，再用
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[0036] 按1×10/ml的浓度将细胞悬于培养液中，接种于细胞培养瓶或培养皿中而后置于饱和湿度、37℃、5％CO2的培养箱中静置培养，24小时后取出，收集悬浮细胞；
+
[0037] 悬浮细胞采用磁珠分离仪分离CD8T细胞；
+
[0038] CD8T细胞采用磁珠分离仪分离CD8+PD-1+T细胞；
++
[0039] CD8PD-1T细胞用无菌缓冲液洗一次，再用培养液洗一次，离心收集细胞。[0040] 2.TIL细胞的培养
6++
[0041] 按0.5-2.0×10/ml的浓度将CD8PD-1T细胞悬于无血清培养液中，培养的第1天无血清培养液加入终浓度为10U/ml的IFN-γ、100ng/ml的PHA,40-50U/ml的IL-2；而后隔1～2d加入含有IL-2 100U/ml的无血清培养液连续培养5-7天；[0042] 含有IL-2 1000U/ml的无血清培养液下每隔2-3天传代培养；[0043] 所述无血清培养液包括基础培养基、维生素类物质、微量元素、2-巯基乙醇、丙谷二肽和甘油酯；
其中基础培养基是Iscove's Modified Dulbecco's Media、或者是RPMI-1640，或
者是Dulbecco's Modified Eagle Medium和Ham’s-F12按照1:1的体积比例混合而成的。
[0044]
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CN 105087485 A[0045]
说 明 书
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其中维生素类物质含量为生物素0.001-1.005mM；肌醇0.1-0.2mM；叶酸0.01-0.02mM；烟酸0.03-0.05mM；砒洛醇0.007-0.01mM；叶黄素0.0005-0.001mM；硫铵0.007-0.01mM；维生素B12 0.0003-0.0009mM；泛酸钙0.01-0.03mM；[0046] 微量元素：腐胺0.01mM；乙醇胺0.1mM；亚油酸0.001mM；柠檬酸铁10mg/L；硫酸铜0.00005-0.0001mM；硫酸锌0.0005-0.001mM；硒酸钠0.00001-0.0001mM；氯化铝0.000005-0.00001mM；碘化钾0.00004-0.00006mM；氯化钴0.00003-0.00007mM；[0047] 2-巯基乙醇的含量为1.0-5.0μg/ml；[0048] 丙谷二肽的含量为0.5-3mM。
++
[0049] 培养的过程中观察CD8PD-1T细胞增殖速度，培养2周后测定其对人肺腺癌A549细胞的杀瘤效应。同时，采用相同方法培养CD8+T细胞，培养2周后测定其对人肺腺癌A549细胞的杀瘤效应。[0050] 此外，同时采用含有10％的胎牛血清的RPMI 1640完全培养基取代上面无血清培养基，培养CD8+PD-1+T细胞，进行细胞增殖对比。[0051] 4.人肺腺癌A549细胞的培养
[0052] 人肺腺癌A549细胞置于含有10％的NBS的RPMI 1640完全培养基中进行培养，每隔1～2d天弃上清全量换液。待培养的过程中见细胞生长接触，采用0.25％的胰蛋白酶消化贴壁细胞，进行传代培养。
[0053] 5.TIL细胞对人肺腺癌A549细胞的杀瘤效应的检测[0054] 按效靶比为20：1的比例，取培养的效应细胞即TIL 1×105约100ul与人肺腺癌A549细胞5×103约100ul混合加入96孔板中，每组样品设3个复孔；将培养板置饱和湿度、37℃、5％CO2孵箱内培养20h，每孔加入MTT(5mg/ml)20μl，继续培养4h，而后离心，弃上清，每孔加入二甲基亚砜(DMSO)150μl，振荡5min，待沉淀物完全溶解后用酶联免疫检测仪(波长490nm)测吸光度A值，计算杀伤率。公式如下：杀伤率(％)＝[A(靶)+A(效)-A(效+靶)]/A(靶)×100％。[0055] (三)结果[0056] 1、不同培养基下，CD8+PD-1+T细胞扩增倍数的比较[0057] 在含10％FBS RPMI1640和本发明无血清培养基下，CD8+PD-1+T培养后均发生明显增殖，细胞聚集成团生长，形成很大的细胞集落，但在增殖速度上含10％FBS RPMI1640组增殖速度低于本发明无血清培养基组，两组差异显著意义，P<0.05(图1)。[0058] 2、CD8+PD-1+T细胞和CD8+T细胞对靶细胞杀伤活性比较(MTT法)
++
[0059] 表2显示两种方法培养获得TIL细胞对靶细胞杀伤活性的比较。可见CD8PD-1T细胞对人肺腺癌A549细胞的抗瘤活性明显高于CD8+T细胞的抗瘤活性，二者比较差异有显著意义，P＜0.05。
[0060] [0061] [0062]
表2.两种TIL细胞对靶细胞杀伤活性的比较(％；n＝6)
％；n＝6)
Table2.Cytotoxic activity of TILs on target cells(
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说 明 书
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本发明所涉及的多个方面已做如上阐述。然而，应理解的是，在不偏离本发明精神之前提下，本领域专业人员可对其进行等同改变和修饰，所述改变和修饰同样落入本申请所附权利要求的覆盖范围。
[0063]
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说 明 书 附 图
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图1
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