豆豉纤溶酶生产菌发酵液营养和活性成分分析

文章篇号:1007-2764(2006)02-0058-018

豆豉纤溶酶生产菌发酵液营养和活性成分分析

王卫东，孙月娥

（江南大学食品学院，江苏无锡 214036）

摘要：本文对豆豉纤溶酶生产菌发酵液中的部分营养与活性成分进行了研究，并进行了功能实验，证明含有豆豉纤溶酶的食品具有一定的保健功能。此实验为利用豆豉开发新型溶栓药物及保健食品提供了参考依据。

关键词：豆豉纤溶酶；发酵液；营养与活性成分

Analysis of Nutrients and Bioactive Substance in the Fermented Liquid of

Fibrinolytic Enzyme-producing Strain from Douchi

Wang Wei-dong, Sun Yue-e

(School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214036, China)

Abstract: A part of nutrients and bioactive substance in the fermented liquid of fibrinolytic enzyme-producing strain from douchi were studied. The functional experiment indicated the food containing douchi fibrinolytic enzyme had certain function. The result provided experimental evidence for developing ermented soybean to produce new type of fibrinolytic medicine and health food.

Keywords: Douchi; Fermentation liquid; Ingredient

豆豉由大豆经发酵而成，是中国传统的保健食品，被我国卫生部定为第一批药食兼用品种，如中成药银翘解毒片中就含有豆豉。李时珍在《本草纲目》中说：豆豉有开胃增食、消食化滞、发汗解表、除烦平喘、祛风散寒、治水土不服等疗效，在唐代外传日本，如今在日本风行的健康食品纳豆就是我国细菌型豆豉的孪生姐妹[1]。豆豉不含胆固醇，除富含不饱和脂肪酸、多种维生素、矿物质、蛋白质、大量人体必需氨基酸等营养成分外、，还含有豆豉纤溶酶和多聚谷氨酸等生理活性成分，因此具有多种保健功能，如：溶血栓、抗肿瘤、降血压、抗菌、预防骨质疏松症、提高蛋白质的消化率、抗氧化性等。豆豉因营养丰富，又经过发酵，使许多营养物质易于消化吸收，目前，豆豉及其功能成分越来越引起人们的广泛关注。 1 材料

1.1 菌种

本实验室自行筛选 1.2 培养基

种子培养基（g/L）：蔗糖20，豆浆1000mL，KH2PO41,K2HPO4·3H2O 6，MgSO4·7H2O 0.5，CaCl2 0.2,

收稿日期：2005-10-11

作者简介：王卫东,博士研究生，研究方向为食品科学

血粉5，pH7.2-7.4，115℃灭菌20min。

发酵培养基（g/L）：蔗糖20，豆浆1000mL，KH2PO4 1，K2HPO4·3H2O 6，MgSO4·7H2O 0.5，CaCl2 0.4，pH7.2-7.4，115℃灭菌20min。 1.3 主要试剂

牛纤维蛋白原、纤维蛋白溶酶原、凝血酶、尿激酶：均购自中国药品生物制品检定所；牛血清白蛋白：Sigma公司。 2 方法

2.1 大豆处理

大豆经筛选，清洗干净，用3倍自来水浸泡24h(室温)，浸泡前后大豆的重量比为2：1。 2.2 种子液制备

挑取一环活化菌种接入装有50ml种子培养基的250ml三角瓶中，180r/min、37℃恒温振荡培养24h。 2.3 发酵液的制备

将种龄24h的种子液按2％的接种量接入发酵培养基中，在转速180r/min、温度37℃、装液量50ml/250ml、初始pH7.4的条件下，摇瓶培养72h。 2.4 发酵液中营养成分的测定

2.4.1 还原糖测定：3，5-二硝基水杨酸法[2-3] 2.4.2 蛋白浓度测定方法：Lowry法[3]

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2.5 发酵液中活性成分的测定

氨基酸测定：氨基酸定氮仪 [4-5]；VE测定：高效

液相色谱法[2，6]；VB2测定：高效液相色谱法[2，

7]；纤溶酶活性测定[8-10]：参照中华人民共和国药典2000版二部尿激酶活性测定方法。以尿激酶(标样)作纤溶活性标准曲线。 3 结果与分析

3.1 营养成分分析

按2.3方法制备发酵液，每隔12h取下一瓶发酵液按2.4方法测定还原糖、蛋白浓度以及生物量。由图1可见，豆豉纤溶酶产生菌在前24h迅速增加，24h后进入平衡期且缓慢下降。发酵过程中还原糖的消耗前急后缓，36h后趋于平缓，表明碳源在发酵过程中的作用主要是供菌体生长。随着发酵的进行，发酵液中蛋白浓度逐渐下降，但变化不明显，可能是被菌体生长利用的同时又合成新的蛋白质。

蛋白浓度（mg/ml）还原糖浓度（mg/ml）OD625

0.4

200.30度156浓100.2D6O50.10

0

0122436486072

发酵时间（h）

图1 发酵过程中营养成分变化

3.2 活性成分分析 3.2.1 氨基酸的测定

豆豉纤溶酶生产菌发酵液中氨基酸的结果如图2。

图2 利用氨基酸定氮仪测定发酵液中氨基酸的图谱

利用图2峰面积计算出各氨基酸的含量见表1。由表1可知，发酵液中含丰富的氨基酸，共18种，总量为876.83mg/L,其中7种人体必需氨基酸为467.44mg/L。食物中最主要的限制性氨基酸是蛋氨酸和赖氨酸，而该发酵液中这两种氨基酸含量较高，分别113.13mg/L 和

28.82mg/L，氨基酸除营养作用外，还有呈味与增香作用，发酵液中谷氨酸含量为47.52 mg/L，谷氨酸经聚合后生成的γ-多聚谷氨酸是豆豉特有粘丝的最主要成分，因此，豆豉纤溶酶产生菌发酵液营养非常丰富。对豆豉的风味和功能起着重要的作用。

表1 发酵液种氨基酸含量（mg/L）

Asp Glu Ser His Gly Thr 19.0147.52

10.66

27.79 10.92 18.05 Arg Ala Cys-sVal Met Trp 18.38

6.9 2.5 190.38 113.13 84.2

Phe Ile LeuLys Pro Tyr 4.94 21.77

90.35

28.82 16.99 64.52

3.2.2 VE（生育酚）的测定

用高效液相色谱对发酵前后的VE（生育酚）进行测定，结果发现：发酵前后生育酚的量基本无变化，但发酵前后发酵液抑制脂肪氧化的能力大大提高，这表明：发酵液中的抗氧化性不是源于游离的VE，而可能是豆豉纤溶酶产生菌在发酵过程中产生某种能促进VE和异黄酮等发挥抗氧化作用的物质。阚健全[11]等对豆豉类黑精深入研究，发现毛霉型豆豉非透析类黑精具有较强消除自由基能力，在干燥物系中对猪油有较明显抗氧化作用。 3.2.3 VB2的分析

FLD1 A, Ex=450, Em=520 (20050523\\VB200002.D) FLD1 A, Ex=450, Em=520 (20050523\\VB2SAM20.D)LU 14LU 7779120..71 2.5100280601.540120486982050.5..567. 7 0024681012m

02.557.51012.515mi 图3 VB2标样图谱 图4 培养基中VB2图谱

FLD1 A, Ex=450, Em=520 (20050523\\VB2SAM11.D)LU 889.31 2.521.51040875.350279.0.5 217.510 .. 67 051015mi

图5 发酵液中VB2图谱 图6 豆豉纤溶酶粗酶液的体外

溶栓作用

VB2具有多种生理功能，不仅可以黄素辅酶的形式参与机体的生物氧化，还参与人体细胞的正常生长。但人体不能自身合成，必须靠食物来供给。近年来动

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物实验证明它有抑癌作用[12] ，世界卫生组织（WTO）将其列为评价人体生长、发育和营养状况的六大指标之一[13]。将样品按文献方法处理后用高效液相色谱法测得VB2图谱见图3-图5。

利用峰面积计算出培养基和发酵液中VB2分别为0.014mg/L和0.029mg/L，即发酵后为发酵前的2倍，说明豆豉纤溶酶生产菌在发酵过程中产生VB2。由于核黄素是参与生物氧化的重要物质，若缺乏会引起唇炎、角膜血管增生等并影响视力[14]，因此服用豆豉产品不仅可提高人体对核黄素的摄入量，而且由于它富含豆豉纤溶酶和蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶等多种生物酶，因此其营养价值和保健价值远远超过大豆。 3.2.4 豆豉纤溶酶的测定

3.2.4.1 液体发酵产酶动态分析

将种子液接种发酵培养基，37℃，180r/min进行摇瓶发酵，定时取样测定生物量，纤溶酶活，动态变化结果见图7。由图7可见，随着发酵的进行，豆豉纤溶酶生产菌的生物量逐渐增加，24h后进入平衡期且缓慢下降，发酵4h后开始产酶，产酶量随着细菌的生长而增加，当细菌进入平衡期数量不再增加后酶的合成还延续较长时间，72h出现产酶高峰，此时酶活最大。因此，液体发酵过程中，豆豉纤溶酶的合成模式为延续合成型，该酶所对应的mRNA是相当稳定的，可在生长平衡期以后相当的一段时间内继续用于酶的合成。

0.5OD660溶圈面积（mm2）300

0.42500200m2m60.3D6150（积O0.2100面0.1圈50溶00

0

12

24

36

48

60

72

84

96

发酵时间（h）

图7 液体发酵产酶动态分析

3.2.4.2 豆豉纤溶酶粗酶液的体外溶栓作用：[15-17]

豆豉纤溶酶是豆豉发酵过程中产生的一种重要丝氨酸蛋白酶，可以水解纤维蛋白成小分子肽和氨基酸。按2.5测定豆豉纤溶酶的溶栓功能。如图7所示：豆豉纤溶酶具有溶解血栓的功能，而且溶栓功能随着豆豉纤溶酶浓度的增加而增强。 4 讨论

对发酵前后的液体培养基进行营养与活性成分分析显示：发酵液具有多种活性成分和生理功能，每升

60

发酵液中VB2含量为0.029mg，从而能促进皮肤、小肠粘膜损伤的修复，保证机体生物氧化的正常进行。豆豉中氨基酸含量丰富，共18种氨基酸，总量为876.83 mg/L,其中7种人体必需氨基酸含量为467.44mg/L，γ-多聚谷氨酸是豆豉粘液的主要成分，在发酵过程中γ-多聚谷氨酸随发酵时间的增加而增加。当细菌进入平衡期数量不再增加后酶的合成还延续较长时间，从而证明液体发酵过程中，豆豉纤溶酶的合成模式为延续合成型。体外溶栓实验表明，豆豉纤溶酶具有溶解血栓的功能，有望开发成新一代保健食品。 参考文献

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