产豆豉纤溶酶高产菌株的筛选及诱变育种 (2)

２００８Ｎｏ．９ＳｅｒｉａｌＮｏ．１８６

ＣｈｉｎａＢｒｅｗｉｎｇ

ＲｅｓｅａｒｃｈＲｅｐｏｒｔ

产豆豉纤溶酶高产菌株的筛选及诱变育种

许金光１，陈

丽２

（１．沈阳农业大学食品学院，辽宁沈阳１１０１６１；２．国家农产品保鲜工程技术中心，天津３０００２２）

摘

６０

要：从豆豉中筛选出１株产纤溶酶的菌株ＤＣ３３，鉴定为芽孢杆菌属，经过紫外线、Ｃｏ、硫酸二乙酯（ＤＥＳ）、亚硝基呱（ＮＴＧ）诱变

筛选得到突变株ＤＣＤＵ７，其产酶活力为６４４．７７Ｕ／ｍＬ，是出发菌株的２．４倍。对ＤＣＤＵ７菌株进行了１０代的培养，结果表明该突变株具有稳定的遗传性能。关键词：豆豉；芽胞杆菌；筛选；诱变中图分类号：Ｑ９３３文献标识码：Ａ

文章编号：０２５４－５０７１（２００８）０９－００６４－０３

ＳｃｒｅｅｎｉｎｇａｎｄｍｕｔａｔｉｏｎｏｆｓｔｒａｉｎｓｗｉｔｈｈｉｇｈｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆＤｏｕｃｈｉｐｌａｓｍｉｎ

ＸＵＪｉｎｇｕａｎｇ１，ＣＨＥＮＬｉ２

（１．ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＦｏｏｄＳｃｉｅｎｃｅ，ＳｈｅｎｙａｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈｅｎｙａｎｇ１１０１６１，Ｃｈｉｎａ；２．ＮａｔｉｏｎａｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ

ＲｅｓｅａｒｃｈＣｅｎｔｅｒｆｏｒＰｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＰｒｏｄｕｃｔｓ，Ｔｉａｎｊｉｎ３０００２２，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＡｓｔｒａｉｎＢａｃｉｌｌｕｓＤＣ３３ｗａｓｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍＤｏｕｃｈｉｗｉｔｈｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｐｌａｓｍｉｎ．ＡｍｕｔａｎｔｎａｍｅｄＤＣＤＵ７ｗａｓａｃｈｉｅｖｅｄｆｒｏｍＤＣ３３ｂｙｏｒｄｉｎａｌｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆＵＶ，６０Ｃｏ，ｄｉｅｔｈｙｌｓｕｌｆａｔｅ（ＤＥＳ）ａｎｄｎｉｔｒｏｓｏｇｕａｎｉｄｉｎｅ（ＮＴＧ）．ＴｈｅｐｌａｓｍｉｎａｃｔｉｖｉｔｙｏｆＤＣＤＵ７ｗａｓ６４４．７７Ｕ／ｍｌ，ｗｈｉｃｈｗａｓ２．４ｔｉｍｅｓｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈａｔｏｆＤＣ３３．Ｉｔｗａｓｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔｔｈｅｍｕｔａｎｔｈａｄｇｅｎｅｔｉｃｓｔａｂｌｉｔｙｏｎｐｌａｓｍｉｎｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｂｙ１０－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｄｏｕｃｈｉ；Ｂａｃｉｌｌｕｓ；ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ；ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ

现代社会，心脑血管栓塞性疾病日益严重地危害着人类的健康，而且血栓病的发病率呈现逐年增加的趋势［１］，溶栓疗法是治疗血栓病的一种常见而有效的疗法，但是目前临床上所应用的溶栓剂存在着特异性差、作用时间短、副作用大、价格昂贵、半衰期较短等缺点［２］，因此寻找选择性高、副作用小、价廉的溶栓药剂具有重大意义；应用发酵工程技术生产溶栓酶具有生产周期短、产量高、生产工艺简单、成本低等特点，代表着生物医药发展的一个重要方向［３］。

日本的须见洋行等［４－６］１９８８年从日本纳豆食品中分离到溶血栓酶，命名为纳豆激酶（ｎａｔｔｏｋｉｎａｓｅ），通过分离纯化及药效研究，证明了纳豆激酶是一种良好的溶栓剂，豆豉是我国的传统发酵食品，具有风味优美、安全性好等优点，已使用２０００年左右，与日本纳豆同属于微生物发酵产品，本文从豆豉中筛选出１株产纤溶酶的菌株，并通过诱变使其产酶能力得到提高，为进一步构建工程菌打下了基础。１材料与方法１．１试剂

牛血纤维蛋白原、凝血酶、标准激酶：中国药品生物制品检定所；冻干牛血纤维蛋白原：上海莱士血制品有限公司；其他试剂为国产分析纯或进口分装。１．２培养基

富集培养基：葡萄糖１２ｇ／Ｌ，酵母膏５ｇ／Ｌ，水１０００ｍＬ，血粉２０ｇ，ｐＨ７．２￣７．５。

初筛培养基：２．０％纤维蛋白，１．０％蛋白胨，０．５％ＮａＣｌ，

收稿日期：２００７－０９－１９

２．０％琼脂，ｐＨ７．２￣７．４。

复筛培养基：３％麦芽糖，０．７％胰蛋白胨，０．１５％酵母粉，０．０２％二水氯化钙；０．２５％的磷酸氢二钾，０．０５％的五水硫酸镁，０．０５％的磷酸二氢钾，ｐＨ７．２￣７．４［７］。

血琼脂培养基：３％酵母膏，１％蛋白胨，５％氯化钠，０．５％磷酸氢二钠，１％甘露醇，１．５％琼脂，结晶紫１０ｍｇ／ｋｇ［８］。１．３菌种的分离与鉴定

将收集到的豆豉制成悬浮液，取适量放入富集培养基１２０ｒ／ｍｉｎ摇床上培养７ｄ，从第３ｄ起开始取样，中，在３７℃、经过适当的稀释后涂于初筛平板，培养４８ｈ后，挑选水解圈与菌落直径比值较大的菌种接种于复筛培养基上，３７℃、１２０ｒ／ｍｉｎ摇床上振荡培养５ｄ，静置１０ｍｉｎ，取其上清液根据相关文献进行菌种的鉴定，经鉴定为枯草芽孢杆菌［９－１１］，然后将其转接种于斜面培养基上备用。１．４菌株的诱变

取对数生长期的培养物，３０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ后，去掉上清液，将收集到的菌体用０．１ｍｏｌ／Ｌ的磷酸氢二钠－磷酸二氢钾的缓冲溶液洗涤，倒入小三角瓶中，恒温振荡５ｍｉｎ，过滤后测定菌体的浓度，并将其稀释到１０５个／ｍＬ￣

６０

１０６个／ｍＬ，然后分别用紫外线、Ｃｏ、亚硝基呱、硫酸二乙

酯进行化学和物理诱变，先做出诱变剂对菌株的致死曲线，选择合适的诱变参数对菌株进行诱变，以期提高该菌株产纤溶酶的能力。１．５高活性纤溶酶的菌株的筛选

将经过每一诱变后的菌株接入液体培养基进行

作者简介：许金光（１９８０－），男，河北邯郸人，助教，研究方向为食品生物技术。

研究报告

中国酿造

２００８年第９期总第１８６期・６５・

表１初筛菌株的理化实验特征

３７℃、１２０ｒ／ｍｉｎ培养２４ｈ后，离心取其上清液，经平板检测，选取酶活最大的菌株进行下一步诱变，最后将得到的复合诱变后的菌株在斜面中保存、备用。１．６突变株的遗传稳定性实验

将诱变处理后的高产菌株在斜面培养基上连续传代１０次，每传代１次在相同条件下摇瓶发酵测定其产纤溶酶的活力，分析传代次数对产酶性能的影响，进而研究突变株是否具有遗传稳定性。１．７纤溶酶活性的测定

参照文献［１２］，将０．１５ｇ琼脂糖和０．４５ｇ纤维蛋白粉末及０．９ｍＬ（１ＢＰ／ｍＬ）凝血酶混匀后倒入平板，进行打孔点样，然后３７℃保存１８ｈ，以尿激酶做标准曲线，通过测定水解圈的大小，计算其面积，进行纤溶酶活性的测定。２实验结果

２．１尿激酶标准曲线

吸取５μＬ不同浓度的尿激酶标准品溶液，将其加入到纤维蛋白平板上，３７℃保温１８ｈ，用游标卡尺测定纤溶圈的直径，以尿激酶活力单位为横坐标，溶菌圈面积为纵坐标，绘制尿激酶溶解纤维蛋白标准曲线，见图１。

３００溶菌圈面积／ｍｍ２２７０２４０２１０１８０１５０

２００

４００

８００

１６００

３２００

３

５７９１１项目Ｖ．Ｐ．反应厌氧生长革兰氏染色产酸，Ｄ－葡萄糖产气，Ｄ－葡萄糖水解明胶水解柠檬酸盐Ｔａｂｌｅ１．Ｐｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｓｏｆｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙｓｅｌｅｃｔｅｄｓｔａｉｎ

枯草芽待鉴定孢杆菌菌种＋＋－－＋＋＋＋－－＋＋＋＋项目水解酪蛋白溶菌酶硝酸盐还原石蕊牛奶还原苯丙氨酸脱氨卵磷脂酶运动性枯草芽待鉴定孢杆菌菌种＋＋＋＋＋＋＋＋－－－－＋＋２．３菌株的筛选结果

将分离出的具有明显溶菌圈的菌株分别接种于富集培养基中，进行复筛，通过纤维蛋白平板法测定其纤溶活力，筛选出１株具有明显溶解纤维蛋白能力的菌株ＤＣ３３，其产酶的活力达到２７３．２１Ｕ／ｍＬ。２．４物理和化学诱变２．４．１紫外线诱变

首先制备浓度约为１０６个／ｍＬ的单孢子悬液，然后用紫外灯照射，紫外灯的功率为１５Ｗ，距离为３０ｃｍ，时间为３ｍｉｎ￣１１ｍｉｎ，然后计算不同照射时间下紫外线对孢子的致死率。从表２中可以看出，紫外线照射时间越长，致死率越大，照射７ｍｉｎ时纤溶酶孢子的致死率约７１．１％，正突变率达到最高（３８．６％），故选用紫外线诱变时间为７ｍｉｎ。

表２菌株经紫外线诱变的结果

Ｔａｂｌｅ２．ＳｃｒｅｅｎｉｎｇａｆｔｅｒＵＶｍｕｔａｔｉｏｎ

紫外线照射时间／ｍｉｎ

菌株致死率／％

３９．４

２１．１７１．１７９．２８６．２

正突变率／％３０．７２１．１３８．６＊１９．２７．３

尿激酶酶活（／Ｕ・ｍＬ－１）

图１尿激酶溶解纤维蛋白标准曲线

Ｆｉｇｕｒｅ１．Ｓｔａｎｄａｒｄｃｕｒｖｅｏｆｆｉｂｒｉｎｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｂｙｕｒｏｋａｎａｓｅｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ

２．２菌种鉴定２．２．１菌落特征

筛选出的菌株经固体平板培养后，菌落为灰白色，不规则形，有褶皱，表面粗糙，中间有规则的环形凸起，边缘叶状，有光泽，不透明，用接种针挑起时，呈拉丝状，有时内部湿润；幼龄菌落为半透明。２．２．２菌体形态

通过显微镜观察表明，菌体呈杆状，长１μｍ￣３μｍ，宽０．３μｍ￣０．９μｍ，个体微小，两端钝圆，革兰氏染色呈阳性反应，芽孢较为明显，孢囊膨大，呈圆形或椭圆形，多为两端均匀染色。２．２．３菌种理化特征

以枯草芽孢杆菌作对照，对筛选出的菌株进行生理生化实验，结果见表１。以伯杰氏鉴定手册为对照，可推断该菌株为芽孢杆菌属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ．ｓｐ）。

２．４．２

６０

Ｃｏ诱变

制成浓度约为１０６个／ｍＬ的单孢子悬液后，计算不同剂量下６０Ｃｏ辐照１０ｍｉｎ时对菌株的致死率。由表３可知随着６０Ｃｏ辐照剂量的增加，菌株的致死率也逐渐增加，而当辐照剂量为９Ｇｙ时，菌株的致死率为８７％，正突变率达到最高（４１．３％），故实验中的诱变剂量选用９Ｇｙ。

表３菌株经６０Ｃｏ诱变的结果

Ｔａｂｌｅ３．Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇａｆｔｅｒ６０Ｃｏｍｕｔａｔｉｏｎ

６０

Ｃｏ辐照剂量／Ｇｙ

３

６９１２

菌株致死率／％

２８５３８７９３

正突变率／％７．６１９．１４１．３＊３２

（ＤＥＳ）诱变２．４．３硫酸二乙酯

制成浓度约为１０６个／ｍＬ的单孢子悬液后，计算浓度为２．５％的ＤＥＳ在不同处理时间时对菌株致死率的影

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ＲｅｓｅａｒｃｈＲｅｐｏｒｔ

响，由表４可知，随着ＤＥＳ作用时间的延长，菌株的致死率也逐渐增加，当处理时间为３０ｍｉｎ时，正突变率达最高，故采用３０ｍｉｎ的处理时间。（４８．４％）

表４菌株经ＤＥＳ诱变的结果

力菌株具有非常重要的意义，而芽孢杆菌是食品、发酵工业中重要的蛋白酶酶原，被公认是较为安全的食品发酵菌株，同时，芽孢杆菌也是新型纤溶酶的重要来源。３．２分离样品的前处理

为了提高分离效率，减轻工作量，对样品分离进行了前处理，即首先对样品稀释液煮沸１０ｍｉｎ，以灭活一些非芽孢菌，然后稀释和涂布于酪蛋白作为唯一氮源的平板，通过测量酪蛋白的溶解圈大小，快速筛选出产蛋白酶菌株，然后利用纤维蛋白平板法，通过测定菌株产纤溶酶活力，提高了筛选效率和通量。３．３纤溶酶活力测定方法比较

实验比较了纤维蛋白平板法和血清板法，结果发现，前者适合粗酶的粗测，纤维蛋白块的溶解时间较快，有较大的分辨率，但随着灵敏度的提高，溶解时间的判定则显得较为困难，同时测定多个样品也比较困难；而血清板法可以同时测定多个样品，操作较为简单、快捷，样品的消耗比较小，成本较低。

Ｔａｂｌｅ４．ＳｃｒｅｅｎｉｎｇａｆｔｅｒＤＥＳｍｕｔａｔｉｏｎ

ＤＥＳ处理时间／ｍｉｎ

１０

２０３０４０６０

菌株致死率／％

１９．８６４．４８７．４＊９１．１９６．０

正突变率／％７．６２３．４４８．４＊３７．９＊２４．４

２．４．４亚硝基呱诱变

用０．５ｍｇ／ｍＬ的亚硝基呱（ＮＴＧ）于３７℃分别处理５ｍｉｎ、１０ｍｉｎ、１５ｍｉｎ、２０ｍｉｎ、２５ｍｉｎ、３０ｍｉｎ，随着处理时间的延长，菌株的致死率也是呈现逐渐增加趋势，在处理时间为２０ｍｉｎ时，菌株的正突变率达到最高（３９．７％），见表５。故所以选择０．５ｍｇ／ｍＬ亚硝基呱于３７℃处理２０ｍｉｎ。

表５菌株经ＮＴＧ诱变的结果

Ｔａｂｌｅ５．ＳｃｒｅｅｎｉｎｇａｆｔｅｒＮＴＧｍｕｔａｔｉｏｎ

亚硝基呱处理时间／ｍｉｎ

５

１０１５２０２５３０

菌株致死率／％

３０．５４９．９８４．６９２．０９４．７９９．８

正突变率／％

１０．９２５．７２１．４３９．７３６．５２４．９

参考文献：

［１］董明盛，江晓，刘诚，等．胞外纤溶酶产生菌的筛选及其产酶条件２００１，２７（１）：２３－２７．研究［Ｊ］．食品发酵工业，

［２］应蓓文．血栓溶解药研究进展［Ｊ］．国外医学，１９９９，２２（１）：１９－２３．［３］杜

冰，姚汝华．血栓溶解酶研究进展［Ｊ］．广东药学院学报，２０００，１６（４）：２９１－２９３．

［４］ＳＵＭＩＨ，ＨＡＭＡＤＡＨ，ＴＳＵＳＨＩＭＡＨ，ｅｔａ１．Ａｎｏｖｅｌｆｉｂｒｉｎｏｌｙｔｉｃｅｎｚｙｍｅ（ｎａｔｔｏｋｉｎａｓｅ）ｉｎｔｈｅｖｅｇｅｔａｂｌｅｃｈｅｅｓｅＮａｔｔｏ：ａｔｙｐｉｃａｌａｎｄｐｏｐｕｌａｒｓｏｙｂｅａｎｆｏｏｄｉｎｔｈｅＪａｐａｎｅｓｅｄｉｅｔ［Ｊ］．Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉｓ，１９８７，４３（１０）：１１１０－１１１１．［５］ＦＵＪＩＴＡＭ，ＮＯＭＵＲＡＫ，ＨＯＮＧＫ，ｅｔａ１．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆａｓｔｒｏｎｇｆｉｂｒｉｎｏｌｙｔｉｃｅｎｚｙｍｅ（ｎａｔｔｏｋｉｎａｓｅ）ｉｎｔｈｅｖｅｇｅｔａｂｌｅｃｈｅｅｓｅＮａｔｔｏ，ａｐｏｐｕｌａｒｓｏｙｂｅａｎｆｅｒｍｅｎｔｅｄｆｏｏｄｉｎＪａｐａｎ［Ｊ］．ＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｐｈｙＲｅｓＣｏｍｍｕｎ，１９９３，１９７（３）：１３４０－１３４７．

［６］ＳＵＭＩＨ，ＨＡＭＡＤＡＨ，ＮＡＫＡＮＩＳＨＩＫ．Ｅｎｈａｎｃｅ．ｍｅｒｉｔｏｆｔｈｅｆｉｂｒｉｎｏｌｙｔｉｃａｃｔｉｖｉｔｙｉｎｐｌａｓｍａｂｙｏｒａｌａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎｏｆｎａｔｔｏｋｉｎａｓｅ［Ｊ］．ＡｃｔａＨａｅｍａ－ｔｏｌ，１９９０，８４（３）：１３９－１４３．

［７］李荣萍，李晶，越晓详，等．一种具有纤溶活性的枯草杆菌蛋白激酶的研究［Ｊ］．生物技术，１９９６，６（３）：２１．

［８］路福平，王敏，王建玲，等．血栓溶解酶产生菌及其培养条件的研究［Ｊ］．氨基酸和生物资源，１９９７，１９（２）：１８．

［９］布坎南ＲＥ，吉本斯ＮＥ，等．中国科学院微生物研究所译，伯杰细菌鉴定手册（第八版）［Ｍ］．北京：科学出版社，１９８４．

２．５复合诱变结果

经过一系列的复合诱变，最终获得突变株ＤＣＤＵ７，其酶活达到了６４４．７７Ｕ／ｍＬ，是出发菌株ＤＣ３３酶活的２．４倍。２．６遗传稳定性实验

ＤＣＤＵ７连续传代１０次，然后同批发酵后，测其酶活，结果（图２）表明突变株ＤＣＤＵ７遗传性状较为稳定。

８００７００酶活（／Ｕ・ｍＬ－１）６００５００４００３００２００１０００１

２３

４５６７

传代次数

８

９１０

海恩斯ＷＣ，帕格ＣＨＮ．蔡妙英，等译．芽胞杆菌属［Ｍ］．［１０］戈登ＲＥ，

北京：农业出版社，１９８３．

［１１］中华人民共和国卫生部药典委员会编．中华人民共和国药典［Ｍ］．

北京：化学工业出版社，广东科技出版社，１９９５：３２０－３２１．

［１２］ＡＳＴＲＵＰＴ，ＭＵＬＬＥＲＴＺＳ．Ｔｈｅｆｉｂｒｉｎｐｌａｔｅｍｅｔｈｏｄｆｏｒｅｓｔｉｍａｔｉｎｇ

ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｔｉｃａｃｔｉｖｉｔｙ［Ｊ］．ＡｒｃｈＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｐｈｙ，１９５２（４０）：３４６－３５１．梁剑光，熊强．纳豆激酶液体发酵条件的优化９［Ｊ］．食品与发［１３］熊晓辉，

酵工业，２００４，３０（１）：６２－６６．

图２传代次数对菌株稳定性的影响

Ｆｉｇｕｒｅ２．Ｅｆｆｅｃｔｏｆｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅｔｉｍｅｓｏｎｓｔａｂｉｌｉｔｙｏｆｓｔｒａｉｎ

３讨论

３．１分离样品的选择

高活力菌株的选育是整个发酵过程最为关键的环节，是发酵工业的基础和支撑，如何快速、高通量的选择高活