植病生防芽孢杆菌的分离筛选与初步鉴定

维普资讯 http://www.cqvip.com 土壤（Ｓｏｉｌｓ），２００５，３７（１）：８５～８８　植病生防芽孢杆菌的分离筛选与初步鉴定①　张晓舟　徐剑宏　李顺鹏　（南京农业大学农业部农业环境微生物工程重点开放实验室南京２１００９５）　摘要　从山东和江苏采集的菜园土样中分离筛选得到４株芽孢杆菌Ｂ１５、ＢｌｌＯ、Ｂｌｌ３和Ｂ１２２，它们均对　植物病原真菌具有较强的拮抗能力且具有广谱性。４株芽孢杆菌可以致使黄瓜枯萎病原菌菌丝生长形态异常，出　现菌丝前端膨大或变细、菌丝扭曲、分支加剧、生成大量圆珠形囊状体和原生质凝聚等异常现象。通过对４个菌　株培养物形态特征的观察和一系列的生理生化实验得到其初步鉴定结果，其中Ｂ１５和Ｂｌｌ３为短短芽孢杆菌　（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓｂｒｅｖｉｓ），Ｂ１１Ｏ为多粘类芽孢杆菌（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓｐｏｌｙｍｙｘａ），Ｂ１２２为枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）。　关键词　中图分类号拮抗作用；芽孢杆菌：筛选：鉴定；生物防治　￥４３２．４＿４；￥４７６　植物真菌性病害是造成农业损失的主要原因之　灰霉病菌（Ｂｏｔｒｙｉｆｓ　ｃｉｎｅｒｅａ　Ｐｅｒｓｏｏｎ）、茄子黄萎病菌　【１—１，施用化学农药虽有一定效果，但价格昂贵且　（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｄａｈｌｉａｅ　Ｋｌｅｂ）和辣椒疫霉病菌　（　ｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ　ｃａｐｓｉｃｉ　ＬｅｏｎｉａＪ１）购自中国农业科学　长期使用会增加病原菌的抗性和造成环境的污染　［３１土壤是各种微生物良好的栖息环境，生存着许　院蔬菜花卉研究所。　病原真菌和芽孢杆菌均采用马铃薯葡萄糖琼脂　多具有相互拮抗作用的微生物【４】。利用植株上附生　１．２培养基　的或根际土壤中的拮抗细菌或其代谢产物调控根围　　有害微生物的平衡以达到控病保产的目的，是土传　培养基（ＰＤＡ）培养。病害防治的重要途径［５　‘ｎ，筛选高效和活性稳定的拮　１．３土样中芽孢杆菌的分离　抗菌株则是保证生物防治获得成功的先决条件。芽　将从山东惠民、莱阳，江苏南京、江阴、无锡５　孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐｐ．）是自然界广泛存在的一类细　地的菜园中植物根部采集的土样自然风干。每份土　菌，一些菌株可以产生杆菌肽、大环脂、环脂和类　样称取１０　ｇ，放入盛有９０　ｍｌ无菌水和玻璃珠的三角　ｍｉｎ后于８０℃的水浴中　噬菌体颗粒等十几种抗菌物质，在植物病害生物防　瓶中，在摇床上剧烈振荡３０　治中被广泛应用【８】。同时，芽孢杆菌作为革兰氏阳　保持１５　ｍｉｎ。然后用无菌水进行梯度稀释后涂布　ｈ左右，挑取菌　性细菌，可以形成芽孢，细胞壁不含内毒素，除个　ＰＤＡ平板，于３７℃培养箱内培养２４　　别种外绝大多数对人畜无毒，因此具有很强的环境　落形态差异明显的单菌落进入初筛。适应性和环境友好性【９ｊ。本研究从山东和江苏两地　１．４具有拮抗作用的芽孢杆菌的初筛和复筛　的菜园土样中选择性地分离和筛选具有拮抗作用的　芽孢杆菌，现将结果报道如下。　以黄瓜枯萎病菌为指示菌，采用ＰＤＡ平板对峙　生长法【】０】将进入初筛的菌株点接在距平板中央３　ｃｍ　处的４个角点上，平板中央同时移入～直径０．３　ｃｍ的　黄瓜枯萎病菌的琼脂块，置于２５℃培养箱培养３～５　天，选出对病原菌生长有抑制作用的菌株进入复筛。　１材料与方法　１．１供试病原真菌　黄瓜枯萎病菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ　ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、黄瓜炭　每个菌株４次重复，同样的方法培养并测量抑菌圈半　疽病菌（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ　ｏｒｂｉｃｕｌａｒｅ）、番茄早疫病菌　径（细菌菌落中心至病原菌菌丝边缘）的大小，筛　（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ　ｓｏｌａｎｉ）和辣椒炭疽病菌（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ　选出抑菌圈半径较大，被抑病原菌丝边缘平齐且拮　　ｃａｐｓｏｃｉ）为本实验室保存；番茄灰霉病菌（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ　抗作用持久的菌株。ｃｉｎｅｒｅａ）购自中国农业科学院土壤肥料研究所；草莓　１．５拮抗菌株对不同病原真菌的拮抗性能测定　①江苏省自然科学基金（ＢＫ２００１０７１）和中国科学院南京土壤研究所开放实验室基金（２０２５１０２）资助。　‘通讯作者（Ｉｓｐ＠ｎｊａｕ．ｅｄｕ．ｃａ）　维普资讯 http://www.cqvip.com 第３７卷　同样采用平板对峙生长法将不同的病原真菌接　长时间培养后都可以观察到芽孢形成的菌株１２６个，　种于ＰＤＡ平板，２５℃培养１４天后观察并记录抑菌圈　初筛出具有一定拮抗作用的菌株２２个。通过复筛，　半径的大小。　１．６拮抗机理的初步研究　得到４株抑菌圈半径较大且抗性持久的菌株Ｂ１５、　Ｂ１１０、Ｂ１１３￣［ＩＢ１２２，其平均抑菌圈半径分别为１２．５　用平板对峙生长法接种黄瓜枯萎病菌和拮抗细　ｍｍ，１１．６　ｎｌｍ，１２．６　ｍｍ和１３．５　ｍｍ；其余１８个菌株　菌，２５℃培养１４天后，挑取抑菌圈边缘生长受抑制　的抑菌圈半径均在３．３～１０．０　ｍｍ之间（详细数据未　的病原菌丝，用结晶紫染色液简单染色后于低倍显　列出）。　微镜下观察菌丝形态变化。　２．２　４株芽孢杆菌对不同病原真菌的拮抗性比较　１．７拮抗芽孢杆菌的初步鉴定　芽孢杆菌菌株的鉴定依照文献［１　１，１２１进行。　采用平板对峙生长法培养之后，４株芽孢杆菌　Ｂ１５、Ｂ１１０、Ｂ１１３和Ｂ１２２对８种病原真菌的拮抗作　用见图１。　２结果与分析　２．１　拮抗芽孢杆菌的分离筛选　从图１可以看出，４株芽孢杆菌均对不同的病原　真菌表现出广谱的拮抗作用，但各菌株对不同病原　从ＰＤＡ平板上选择性地挑出外观有明显差别且　菌表现出的拮抗强度有所差别，这可能是由于不同　（图１中各平板中细菌菌落依次为：上：ＢＩ５：下ｔ　ＢＩ１３：左：ＢＩ１０：右：Ｂ１２２，各平板接种的病原真菌依次为，Ａ：辣椒疫霉病菌；　Ｂ：辣椒炭疽病菌：Ｃ：黄瓜枯萎病菌：Ｄ：番茄早疫病菌：Ｅ：番茄灰霉病菌：Ｆ．草莓灰霉病菌：Ｇ：茄子黄萎病菌：Ｈ：黄瓜炭疽病菌）　图１　４株芽孢杆菌对不同病原真菌的拮抗作用　Ｆｉｇ．１　Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｆｏｕｒ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｏｆ　ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐｐ．ｏｎ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ　ｆｕｎｇｉ　的病原真菌的菌丝体构造等有所不同所造成的。其　２．３拮抗作用机理的初步研究　中，４个菌株对番茄灰霉病菌拮抗作用最弱；菌株　菌、番茄灰霉病菌及草莓灰霉病菌的抑菌作用较弱；　对峙生长培养后，黄瓜枯萎病菌丝体受不同拮　从图２可以看出，与对照组相比，Ｂ１５处理过　Ｂ１２２对辣椒疫霉病菌、辣椒炭疽病菌、番茄早疫病　抗菌株作用后的异常形态见图２。　０处理过的菌　而菌株Ｂ１５、Ｂ１１０和Ｂ１１３对绝大多数病原菌都表现　的病原菌丝体扭曲，缢缩或膨大；Ｂ１１出很强的拮抗作用。从拮抗菌株对病原菌的平板抑　丝顶端出现圆珠形囊状体，菌丝体扭曲分节，原生　　菌作用可以看出，４个菌株向菌落周围的培养基中分　质凝聚；Ｂ１１３处理过的菌丝顶端扭曲、异常分生，２２处理过的菌丝扭曲　泌释放某种拮抗物质，从而明显抑制了病原菌丝的　菌丝体膨大，原生质凝聚；Ｂ１生长和发育。　盘结，明显变细。　维普资讯 http://www.cqvip.com 第１期　张晓舟等：植病生防芽孢杆菌的分离筛选与初步鉴定　８７　（Ａ和Ｂ：正常的黄瓜枯萎病菌丝：Ｃ和Ｄ：受ＢＩ５抑制的菌丝：Ｅ和Ｆ：受ＢＩ１０抑制的菌丝；　Ｇ和Ｈ：受Ｂｌｌ３抑制的菌丝；Ｉ和Ｊ：受Ｂ１２２抑制的菌丝）　图２黄瓜枯萎病菌丝体受拮抗菌作用后的异常形态（２００ｘ）　Ｆｉｇ．２　Ａｂｎｏｒｍａｌ　ｆｏｒｍｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｆｕｓａｒｉｕｍ　ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ　ｈｙｐｈａ　ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ　ｂｙ　ｔｈｅ　ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐｐ．（２００ｘ）　４个拮抗菌株对病原真菌均具有广谱拮抗作用，　２．４．１　形态特征和培养特征　却各不相同。菌株Ｂ１５和Ｂ１１３处理过的病原菌丝　果见表１和表２。　形态变化有一定的相似性。这也表明各菌株可能是　２．４．２生理生化特征　分泌了不同的抗生物质而起到抑菌效果的。　２．４　４株芽孢杆菌的初步鉴定结果　表１　４株芽孢杆菌的形态特征和培养特征　Ｔａｂｌｅ　１　Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ　ｆｅａｔｕｒｅｓ　ａｎｄ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｆｏｕｒ　ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐｐ．ｓｔｒａｉｎｓ　各菌株细胞个体　但是病原菌丝受拮抗菌分泌物质作用后的形态变化　形态观察和ＰＤＡ平板培养２４ｈ后的菌落形态观察结　４株芽孢杆菌的生理生化　特征见表３。　注：“＋’’表示阳性，“．”表示阴性，“　ｒＩ’’表示未测定。　维普资讯 http://www.cqvip.com ８８　土　壤　第３７卷　２．４．３菌株的鉴定　综合上述个体形态、菌落特　土壤有机氯农药残留规律．土壤学报，２００４，４１（３）：４１４　征观察结果及生理生化特征，结合相关文献　】，　４１９　可以初步确定以上４个菌株的分类地位：菌株Ｂ１５和　３　刘颖，徐庆，陈章良．抗真菌肽ＬＰ一１的分离纯化及特性　Ｂ１１３为短短芽孢杆菌（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ　ｂｒｅｖｉｓ），菌株　分析．微生物学报，１９９９，３９（５）：４４１～４４７　Ｂ　１　１０为多粘类芽孢杆菌（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐｏｌｙｍｙｘａ），菌株Ｂ１２２为枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）。　５　４　吴建峰，林先贵．土壤微生物在促进植物生长方面的作　用．土壤，２００３，３５（１）：１８～２１　Ｙａｏ　Ｑ，Ｑｉｎｇ　Ｌｉ　Ｘ。Ｃｈｒｉｓｔｉｎｅ　Ｒ　Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｐａｒｉｎｇｌｙ　ｓｏｌｕｂｌｅ　ｐｈｏｓｐｈａ￣ｂｙ　ｒｅｄ　ｃｌｏｖｅｒｉｎ　ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　Ｇｌｏｍｕｓ　ｍｏｓｓｅａｅ　ａｎｄ　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ．Ｐｅｄｏｓｐｈｅｒｅ，２００２，１２　３结语　本试验从分离到的１２６个芽孢杆菌菌株中筛选　出的４个菌株不但对黄瓜枯萎病菌具有较强的抑菌　作用；这同时也说明了土壤中存在着大量我们可以　株是来源于菜园土中的土壤微生物，所以应该易于　在土壤中定居，其中Ｂ１５和Ｂ１　１３两个菌株形成的　抑菌圈边缘清晰且作用时间持久，是很有希望值得继续研究和开发的菌株。本研究虽然对各菌株作了　（２）：１３１～１３８　　作用，而且对另外７种病原真菌都有着广谱的抑制　６　吴建峰，林先贵．我国微生物肥料研究现状及发展趋势．土壤，２００２，３４（２）：６８～７２　利用和改造的有益微生物资源。我们分离得到的菌　７　孙红霞，武琴，郑国祥，王振忠．ＥＭ对茄子、黄瓜抗连　作障碍和增强土壤生物活性的效果．土壤，２００１，３３（５）：　２６４～２６７　８　刘焕利，潘小玫，张学君，王金生．产抗菌蛋白芽孢杆　菌的筛选及抗菌蛋白的性质．中国生物防治，１９９５，ｌｌ　（４）：１６０～１６４　些初步试验和鉴定，并发现它们具有作为生物农　药的潜力，但是对它们的盆栽试验效果、抑菌有效　９　彭清忠。张惟材，朱厚础．枯草杆菌表达系统的研究进　组分的分离、结构鉴定、发酵条件优化和安全性试　展．生物技术通讯，２００１，１２（３）：２２０～２２５　验等方面的研究工作还有待进一步深入研究。　参考文献　１　Ｃｏｒｎｅｌｉｓｓｅｎ　Ｂ．Ｍｅｌｃｈｅｒｓ　ＬＳ．Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ　ｆｏｒ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｏｆ　１ｏ　纪明山，王英姿，程根武，李博强，张国辉，李艳丽，回　文广．西瓜枯萎病拮抗菌株筛选及田问防效试验．中国　生物防治，２００２，１８（２）：７１～７４　ｌｌ　戈登ＲＥ，海恩斯ＷＣ，帕格ＣＨＮ著（蔡妙英等译）．芽　孢杆菌属．北京：农业出版社，１９８３，１０６～１０８　ｆｕｎｇａｌ　ｄｉｓｅａｓｅｓ　ｗｉｔｈ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｐｌａｎｔｓ．Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏ１．，１９９３，　１０１（３）：７０９～７１２　１２　东秀珠，蔡妙英．常见细菌系统鉴定手册．北京：科学　２　安琼，董元华，王辉，王霞，王梅农，郭宗祥．苏南农田　出版社。２００１。５９～６３　ＩＳｏＬＡＴＩｏＮ．ＳＣＲＥＥＮＩＮＧ　ＡＮＤ　ＰＲＥＬＩＭＩＮＡＲＹ　ＩＤＥＮＴＩＦＩＣＡＴＩｏＮ　ｏＦ　ＰＬＡＮＴ　ＰＡＴＨｏＧＥＮＩＣ　ＦＵＮＧＩ　ＢＩｏＣｏＮＴＲｏＬ　ＳＴＲＡＩＮＳ　ｏＦ　Ｃ，　【　ＳＰＰ．　ＺＨＡＮＧ　Ｘｉａｏ－－ｚｈｏｕ　ＸＵ　Ｊｉａｎ··ｈｏｎｇ　ＬＩ　Ｓｈｕｎ··ｐｅｎｇ　（Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ｆＡｇｒｏｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ，ＭＯＡ，Ｎａｎｊｉｎｇ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ　２１００９５）　Ａｂｓｔｒａｃｔ　Ｆｏｕｒ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｏｆ　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐｐ．Ｂ１５，Ｂ１　１０，Ｂ１　１３　ａｎｄ　Ｂ１２２　ｗｅｒｅ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｆｒｏｍ　ｇａｒｄｅｎ　ｓｏｉｌ　ｓａｍｐｌｅｓ，　ｗｈｉｃｈ　ｗｅｒｅ　ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ　ｒｏｍ　Ｓｈａｎｄｏｎｇ　ａｎｄ　ｆＪｉａｎｇｓｕ　Ｐｒｏｖｉｎｃｅｓ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｓｈｏｗ　ｔｈｅｙ　ａｌｌ　ｈａｄ　ｓｔｒｏｎｇ　ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ　ｅｆｆｅｃ￣　ｏｎ　ａ　ｂｒｏａｄ　ｓｐｅｃｔｒｕｍ　ｏｆ　ｐｌａｎｔ　ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ　ｆｕｎｇｉ．Ｔｈｅ　ｆｏｕｒ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｏｆ　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐｐ．ｃｏｕｌｄ　ｉｎｄｕｃｅ　ｄｅｆｏｒｍｅｄ　ｇｒｏｗｔｈ　ｏｆ　ｈｙｐｈａｅ　ｏｆ　Ｆｕｓａｒｉｕｍ　ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ．Ｗｉｔｈ　ｔｈｅｉｒ　ｔｉｐｓ　ｂｕｌｇｅｄ　ｏｒ　ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ，ｔｈｅ　ｈｙｐｈａ　ｒｅｗ　ｔｇｗｉｓｔｙ，ｒａｍｕｌｏｓｅ，ｙｉｅｌｄｅｄ　ａ　ｌｒｇｅ　ａｎｕｍｂｅｒ　ｏｆ　ｒｏｕｎｄ　ｃｙｓｔｉｄｓ　ａｎｄ　ｔｈｅｉｒ　ｐｒｏｔｏｐｌａｓｍ　ａｇｇｌｏｍｅｒａｔｅｄ．Ｔｈｒｏｕｇｈ　ｏｂｓｅｒｖｍｉｏｎ　ｏｆ　ｈｅｉｔｒ　ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ　ｆｅａｔｕｒｅｓ　ａｎｄ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｓ　ａｎｄ　ａ　ｓｅｒｉｅｓ　ｏｆ　ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ａｎｄ　ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ，Ｂ　１　５　ａｎｄ　Ｂ　１　１　３　ｗｅｒｅ　ｉｄｅｎｔｉｉｆｅｄ　ａｓ　Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ　ｂｒｅｖｉｓ，Ｂ　１　１０　ａｓ　Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐｏｌｙｍｙｘａ　ａｎｄ　Ｂ　１２２　ａｓ　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ　Ａｎｔａｇｏｎｉｓｍ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐｐ．，Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，Ｉｄｅｎｔｉｉｆｃａｔｉｏｎ，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｃｏｎｔｒｏｌ