枯草芽孢杆菌是革兰氏阳性细菌，是a-淀粉酶高产菌株之一，其菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。需氧菌。可利用蛋白质、多种糖及淀粉，在遗传学研究中应用广泛。其芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。广泛分布在土壤及腐败的有机物中，易在枯草浸汁中繁殖，故名。广泛生长在中性的的含淀粉多的环境中，如富含淀粉的面粉厂、土壤等。
淀粉酶是一种用途极为广泛的生物催化剂，可应用于面包制作业、淀粉的糖化和液化、纺织品脱浆、造纸、清洁剂工业、化学、临床医学的分析和制药业等。淀粉酶家族包括α- 淀粉酶、β- 淀粉酶和葡萄糖淀粉酶。α-淀粉酶为内切酶，以无规则的方式切开淀粉分子内部的α- 1，4 糖苷键，而使淀粉生成糊精和低聚糖，是一种钙离子依赖性酶。β- 淀粉酶从非还原性末端顺次切下麦芽糖，为外切酶。葡萄糖淀粉酶是一种作用于α- 1，4 糖苷键的外切酶，从非还原糖末端切下葡萄糖分子。
a-淀粉酶是一种胞外酶，由于酶纯化等操作往往导致酶活性和稳定性都受影响，而利用细胞固定化可以很好的解决这一问题，其中α -淀粉酶的固定化交联法是目前比较理想的方法。另可尝试探索用一定浓度的凝胶包埋枯草芽孢菌或用吸附法、交联法将枯草芽孢杆菌固定化，使菌体不能流动而酶可以存在反应液里。凝胶柱底部可选用一定大小的半透膜使酶和淀粉不能流出反应凝胶柱，而产物可以流出。
【实验一】
一、a-淀粉酶生产菌种的分离与培养、筛选
二、【实验原理】
大多数枯草芽孢杆菌好氧，最适生长温度为32℃,PH为7.2，转速为140r/min，接种量为9％，芽孢率生长最适温度36℃，最适PH为7.2，最适转速120r/min。在以淀粉为碳源的固体培养基上用划线法分离纯化出产a-淀粉酶的菌株，根据是否可产生透明圈来筛选。透明圈越大，产酶能力越强。
三、【实验仪器和材料】
1、试剂：0.1%吕氏(Loeffier)美蓝染液
配制方法：A 液：美蓝(methylene blue, 又名甲烯蓝)0.3 g, 95%乙醇30 ml； B 液：0.0l% KOH l00ml。
混合A 液和B 液即成，根据需要可配制成稀释美蓝液。 2、淀粉酶筛选富集培养液（细菌）
淀粉10 g、硫酸铵10 g、氯化钠5 g、硫酸亚铁0.5 g、磷酸氢二钾1 g、牛肉膏1 g，定容1 L，调至
pH 为7，取300ml分装 9 ml 于小试管中，高压蒸汽灭菌于，115 ℃，20 min。 3、淀粉酶筛选培养基I（细菌）
淀粉3g、硫酸铵3g、氯化钠1.5g，用无机酸碱调pH值至7.0左右，加蒸馏水定容至300 ml，再加琼脂5.4g，装入三角瓶，塞上棉塞，用报纸包扎瓶口。高压蒸汽灭菌，于115 ℃，20 min，冷却至50-55℃左右时倒入无菌平皿。
4、淀粉酶筛选培养基II（细菌）
淀粉10 g、硫酸铵10 g、氯化钠5 g、硫酸亚铁0.5 g、磷酸氢二钾1 g、牛肉膏1 g，定容1 L，调至
pH 为7，再加18g琼脂，取300ml分装 9 ml 于小试管中，高压蒸汽灭菌于，115 ℃，20 min。 5、器材
烧杯、玻璃棒、三角瓶、培养皿、试管、吸管、移液枪、漏斗、瓷缸、接种环、刮铲、载玻片、显微镜 、酒精灯、高压蒸汽灭菌锅、载玻片、盖玻片
1
四、【实验步骤】
1、富集培养（第1天）：取标本于90 ml无菌水，放置于摇床150 rpm，摇晃5 min，取出后稍静置。用无菌枪头吸取上清液1 ml接入9 ml的富集培养液中，同时做一个不接菌液的空白对照管一起培养。置30℃培养箱中培养20-24小时（第2，3天）。
2、观察：用无菌操作法取少许菌液置于载玻片中央的0.l%美蓝染色液中，混匀后加盖玻片制成水浸片，先用低倍镜后换高倍镜观察菌的形态和出芽生殖情况。活酵母菌可使美蓝还原，从而使菌体不着色，用此方法可判断酵母菌的死活。（第2天）
水一碘液浸片的观察：在载玻片中央加一小滴革兰氏染色用碘液，然后在其上加3小滴水，取少许酵母菌液放在水一碘液中混匀，盖上盖玻片。 3、镜检：取少许富集的菌液观察菌的形态。（第2天）
4、菌液稀释：用无菌枪头吸取0.5 ml富集菌液，加入装有4.5 ml无菌水的试管中，吹吸几次，让菌液混合均匀，稀释成10-1稀释液。再用1 ml无菌枪头，吸取10-1稀释液0.5 ml，移入装有4.5 ml无菌水的试管中，吹吸混匀，即成10-2稀释液。同样做法再一次，做成10-3稀释液。
5、倒平板培养（第2天）：倒筛选培养基I平板，凝固待用。用无菌枪头分别吸取10-2、10-3
浓度的稀释液0.1 ml于平板上，用涂布棒将菌液在平板上涂抹均匀。平放桌面30 min，使菌液渗透入培养基内，然后将平板倒转，置30~32 ℃再培养24 h或稍长(过长则霉菌长出) （第3，4
天）。
6、纯化：从长有单菌落的平板中选取典型的大的透明圈菌落，用接种环挑取一环的菌，在筛选培养基I平板中采用划线分离法分离菌。并同时制片做纯度检查。若不纯，应进一步挑取该菌落采用划线分离，直至获得纯培养体为止。涂片镜检，菌落观察。（第4，5天）
7、菌种保藏：将分离的酵母菌转接于筛选斜面培养基上培养（从第6步中的每个平板保藏8~10株），待长好后置于冰箱内4 ℃下保存。（第4，5天）
8、将保藏的菌株接种到筛选培养基II平板中，每个板接8～10株，培养1-2天后，选择4-5株高产菌株保藏备份并分别进行摇瓶培养，进行酶活测定。
五、酶活测定方法
（1）DNS法
筛选出高酶活菌株。标本本实验设定40 ℃时在5 min 内水解淀粉释放1 mg 麦芽糖所需的酶量为1 个酶活力单位（U）。计算酶活力的公式为:酶活力单位=C 酶× V 酶× n。
式中C酶为酶液中麦芽糖的浓度；V酶为提取酶液的总体积；n 为酶液的稀释倍数。利用麦芽糖梯度标 准液绘制标准曲线，用SPSS 12.0 统计软件包计算回归方程，求出相关系数和标准误
注：DNS法测还原糖 - DNS-二硝基水杨酸
DNS即二硝基水杨酸法是利用碱性条件下，二硝基水杨酸（DNS）与还原糖发生氧化还原反应，生成3-氨基-5-硝基水杨酸，该产物在煮沸条件下显棕红色，且在一定浓度范围内颜色深浅与还原糖含量成比例关系的原理，用比色法测定还原糖含量的。因其显色的深浅只与糖类游离出还原基团的数量有关，而对还原糖的种类没有选择性，故DNS方法适合用在多糖（如纤维素、半纤维素和淀粉等）水解产生的多种还原糖体系中。
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DNS法测还原糖 - DNS试剂的制备
将6.3克DNS和262ml 2mol/L氢氧化钠，加到500ml含有182克酒石酸钾钠的热水溶液中，再加上5克重苯酚和5克亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加水定容到1000ml，即制成3,5-二硝基水杨酸试剂，贮于棕色瓶中备用。
DNS法测还原糖 - 葡萄糖标准曲线的绘制
分别取葡萄糖标准液（1mg/ml）0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml于25 ml试管中，分别准确加入DNS试剂2ml，沸水浴加热2min，流水冷却，用水补足到15ml刻度。在540nm波长下测定吸光度。
DNS法测还原糖 - 样品的测定
样品液适当稀释，使糖浓度为0.1-1.0mg/ml，取稀释后的糖液1.0ml于15ml刻度试管中，加DNS试剂2.0ml，沸水煮沸2min，冷却后用水补足到15ml刻度，在540nm波长下测定吸光度。从标准曲线查出葡萄糖mg/ml数。求出样品中糖含量。
六、【注意事项】
1、美兰染色浓度和时间严格掌握；
2、平板培养时间不宜过长，过长则霉菌长出。 【实验二】
二、菌株的鉴定
一、【实验目的】
学习酵母菌的鉴定方法，熟悉使用分子生物学手段进行微生物鉴定。 二、【实验原理】
微生物鉴定是科研及生产过程中非常重要的工作。可以通过菌落形态、细胞形态、生化分析及分子生物学手段进行鉴定。
三、【实验仪器和材料】 A、DNA提取需要配置的试剂 高盐的TE buffer
终浓度 配制50 ml 10 mM Tris.Cl, pH 8.0 0.5 ml(1M 母液) 0.1 mM EDTA, pH 8.0 0.01 ml(0.5M 母液) 1 M NaCl 1.8 g 室温可保存几年 CTAB提取液
3
终浓度 配制200 ml 2%(W/V) CTAB 4 g
100 mM Tris.Cl, pH8.0 20 ml(1 M 母液) 20 mM EDTA, pH8.0 8 ml(0.5M 母液) 1.4 M NaCl 10.22 g 室温可保存几年
10×CTAB/NaCl溶液(10%CTAB/0.7 M NaCl)
在80 ml H2O中溶解4.1 g NaCl，缓慢加入10 g CTAB，同时加热并搅拌。如果需要，可加热至65℃溶解。定容至100 ml。
其它化学试剂：异丙醇、乙醇、液氮、Taq酶、dNTPs、引物。 B、仪器
移液枪（10、100、1000μl）,0.2 ml PCR管，枪头，2 ml eppendorf管，饭盒。 四、【实验步骤】 1.形态学鉴定：（第7天） A．菌落形态观察
按普通微生物实验指导书观察所分离的细菌菌落特征。 B. 细胞形态学观察
按普通微生物实验指导书简单制片法观察，先低倍镜，后高倍镜观察并绘制细胞形态图。 2.分子生物学鉴定：
（1）菌体DNA的提取（CTAB法提取真菌基因组DNA）（第7,8天）
1) 取少量酵母菌落连同部分培养基一起放入研钵中，加入液氮粉碎，然后加入800 μl 2% 65℃保温的2×CTAB抽提液，混匀，65℃保温30～60 min。
2) 加入800 μl的氯仿/异戊醇（24：1），轻缓颠倒混匀，10000 r/min，离心5 min。 3) 取上清(约600 μl)，加入1/10体积（约60 μl）的65℃的CTAB/NaCl溶液，颠倒混匀。 4) 用等体积(约600 μl)的氯仿/异戊醇（24：1）抽提，10000 r/min，离心5 min。 5) 取上清(约450 μl)，加入0.8 V的异丙醇沉淀核酸，颠倒混匀，（如沉淀可见，继续做下步，否则，-20℃保温10~20 min）。
6) 4℃，12000 r/min，离心10 min。
7) 去上清，用高盐的TE buffer重悬（约100μl）。（可65℃保温30 min，至大部分溶解）。 8) 加入0.8体积的异丙醇沉淀核酸，充分混匀（如没有沉淀，-20℃保温10~20 min），4℃，12000 r/min，离心15 min。
9) 去上清，70%乙醇洗涤沉淀，干燥，用尽可能少的TE buffer重悬（30~60μl）。
（2）DNA质量检测（第7,8天）
以1%琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA大小及提取质量；紫外分光光度计法检测DNA纯度（将DNA稀释50倍后分别测OD260和OD280，并计算OD260/OD280的比值）。
DNA浓度计算：
4
（3）PCR扩增（第9天）
核糖体 DNA 普遍存在于生物中, 真核生物的核糖体 RNA 中包括 26S、 18S、 5.8S 和 5S 4 种不同沉降系数的核糖体 RNA 片段, 它们分别对应的基因片段既具有遗传上的相对稳定性, 同时由于各种原因具有一定的突变, 使它们作为一种良好的生物分类鉴定材料得到广泛的重视。 早期一般选取大小适中的 18S 序列作为鉴定的标准, 随后 26S 的 D1/D2 区序列和 ITS 序列也被用于应用于鉴定工作中(图1)。本实验使用ITS 序列进行鉴定，包括ITS1和ITS2 两个转录间隔区。PCR反应引物使用ITS1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3' )和ITS4 (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3' )。
图1 真核生物钟编码核糖体的序列（5'- 3'）
取一PCR管，按下述PCR体系加入PCR扩增所需的试剂：
ddH2O
10×PCR buffer（without MgCl2） MgCl2 (25 mM) dNTP(10 mM) 5’primer(10 mM) 3’primer(10 mM)
Template（50 -500 ng/μl） Taq DNA polymerase(5U/μl) Total
34.6 μl 5 μl 4 μl 1 μl 2 μl 2 μl 1 μl 0.4 μl 50 μl
将上述加样后的PCR管放到小离心机低速甩一下，放入PCR扩增仪进行扩增。扩增反应程序按如
下设定：
94℃预变性 5 min 94℃变性 30 sec
52℃退火 30 sec 40个循环 72℃延伸 60 sec 72℃延伸 5 min
4℃保温（到达此温度时停止PCR扩增，将PCR管取出）
（4）PCR扩增检测
以1.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增是否有所想要的大小的目标条带，大概浓度如何。 （5）测序
将符合要求的样品（选5-6个），按公司测序订单要求填写。（测序一般可以分为将PCR扩展目标DNA连接到T载体上和直接利用PCR产物测序两种方法，本方法采用直接利用PCR产物测序，需要自己提供测序引物）
（6）生物信息学分析方法演示（第10天）
使用软件Bioedit 除去测序不可靠部分及无用的部分，然后登陆NCBI网站，进行在线比对分析。 五、【注意事项】
1.
PCR扩增时PCR反应缓冲液，特定公司的特种型号的Taq酶会自带自己所需的PCR反应
缓冲液，不同的公司的产品（Taq酶与PCR反应缓冲液）之间一般不可以混用；
2. 加入。
5
观察PCR反应缓冲液是否包含Mg2+，如果包含，则不需要另加入；如果不包含，则必须
六、【思考题】
进行微生物物种鉴定时为什么使用不同的鉴定方法综合进行鉴定？ 【实验三】 诱变育种
进行诱变后，计算致死率，并进行筛选，同时用原始菌株做产酶能力对照。 【实验四】
四、a-淀粉酶的固定化技术
一、实验目的和原理
目的：学会交联法制备固定化酶的操作技术
内容：制备固定化酶的方法很多，利用双功能试剂或多功能试剂在酶分子间，酶分子与惰性蛋白间，或酶分子与载体间进行交联反应，以共价键制备固定化酶的方法称为交联法，本实验即采用这种方法。交联剂为戊二醛，载体为甲壳素。
二、实验器材 1．恒温水浴锅 2．恒温振摇仪 三、实验试剂 1. 5%戊二醛 2. 甲壳素
3. 碘原液：称取碘1.1g。碘化钾2.2g，置于小烧杯中，加10ml蒸馏水使之溶解，然后转入容量瓶中。再加少量的蒸馏水洗涤烧杯数次，洗涤液均转入容量瓶中，最后定容至50ml。摇均后放于棕色试管中备用。
4. 比色稀碘液：取碘原液2ml，加碘化钾20g，再用蒸馏水定容至5000ml。
5. 2%淀粉溶液：称取2g可溶淀粉，放入小烧杯中，加少量蒸馏水做成悬浮液。然后在搅拌下注入沸腾的蒸馏水中，继续煮沸一分钟，冷却后加蒸馏水定容至100ml。
6. pH6磷酸氢二钠——柠檬酸缓冲液：称取磷酸二氢钠（Na2HPO4.12H2O）45.23g,柠檬酸（C6H8
6
O7.H2O）8.07g,先在烧杯中使之溶解，然后转入容量瓶中定容至1000ml。
7. 标准终点色溶液，A液：精确称取氯化钴（CoCl.6H2O）40.2493g和重洛酸钾（K2GrO7）0.4878g，用蒸馏水定容至500ml.
B液:：精确称取络黑T40mg，用蒸馏水定容至100ml.
同时取A液40ml、B液5ml、混合后置于冰箱中待用。混合液在15天内使用有效。 四、实验操作
（一）酶液的制备精确称取α-淀粉酶2g，先用少量40℃pH6的磷酸二氢钠——柠檬酸缓冲液溶解，溶解过程中轻轻用玻璃棒捣研。将上层液小心倾入100ml容量瓶，沉渣部分再加入少量上述缓冲液，如此反复捣研3—4次。最后，将溶液与残渣全部移入容量瓶中，用缓冲液先定容摇匀后，通过四层纱布过滤，溶液供测定使用。（二）固定化酶的制备1. 称取50mg粉末甲壳素，加入5%戊二醛10ml，调节pH=8.5，搅拌均匀后，于25℃，恒温振摇1小时。取出后，倾去戊二醛，然后以蒸馏水洗涤，倾去清夜，以除去多余的交联剂。2. 取前面制备的酶液10ml，与上述处理的甲壳素混合均匀，25℃，恒温振摇1小时，然后4℃冰箱放置过夜。1.取出后，4000rpm离心分离，倾去清液，蒸馏水洗涤，可得固定化酶。（三）固定化α-淀粉酶活力测定及活力回收率的计算1. 首先用吸管取1ml的标准终点色溶液，加至白瓷板的空穴内，作为终点参照的标准。2. 固定前总酶活力测定：取20ml 2%的可溶淀粉液与5mLpH6的磷酸氢二钠——柠檬酸缓冲液，加入一支大试管中。将试管置于60℃水浴5分钟。然后加入前面制备的酶液0.5ml。摇匀后，立即用秒表记录时间。此后，每经一段时间，用吸管吸出0.2ml反应液，加入预先盛入稀碘液的白瓷板中。当穴内颜色反应由紫色逐渐变为红棕色并与标准色相同时，即为反应终点，记录反应到达终点时的时间。3. 固定化酶活力测定：取20ml 2%的可溶淀粉液与5mLpH6的磷酸氢二钠——柠檬酸缓冲液，加入一支大试管中。将试管置于60℃水浴5分钟。然后加入前面制备的固定化酶。摇匀后，立即用秒表记录时间。此后，不断振摇，每经一段时间，用吸管吸出0.2ml反应液，加入预先盛入稀碘液的白瓷板中。当穴内颜色反应由紫色逐渐变为红棕色并与标准色相同时，即为反应终点，记录反应到达终点时的时间。4. 酶活力计算：以60℃、pH6的条件下，每小时水解1g淀粉的酶量为一个活力单位。固定前原酶活力单位 = 60/T×20×2%×n/0.5固定后的酶活力单位 = 60/T×20×2%×n/10T：反应到终点时的时间（分）n：酶粉稀释的倍数5. 固定化后酶活力回收率计算：酶活力回收率=（固定后的酶活
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力单位/固定前原酶活力单位） × 100%五、注意事项测定酶制剂时，应先在40℃水浴中悬浮2小时，再用纱布过滤。每次操作所用的纱布数要一致。
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