第九章 生物技术在园林植物遗传改良中的应用
本章教学目的和要求
1 ．了解园林植物生物技术研究的主要内容。
2 ．掌握植物组织培养、基因工程等技术在园林植物遗传育种中的应用。
本章教学重点和难点
重点：组织培养与基因工程在园林植物遗传育种中的作用。
难点：园林植物生物技术的原理与操作方法。
教学内容：
生物技术（ biotechnology ）是指按照人们的意愿采取一定的技术手段，直接或间接地利用生物有机体（从微生物直至高等动植物）或其组成部分（器官、组织、细胞等），发展新的生产工艺，创造新的生物品种或生物制品的一种科学技术体系。
包括组织培养、细胞工程、基因工程、发酵工程、蛋白质工程等。
第一节 植物组织培养
一、植物组织培养的相关概念
植物组织培养（ plant tissue culture ）：在无菌条件下，将离体的植物材料培养于人工培养基上，并给以适宜的培养条件，使之形成完整植株或生产出具有一定经济价值的生物产品的技术。
包括分生组织、输导组织、薄壁组织等离体组织，根、茎、叶、花、果实等各种器官，细胞、胚、胚珠、子房、胚乳等的离体培养。
外植体（ explant ）： 用于培养的离体材料。
继代培养（ subculture ）： 由最初培养新增殖的组织，继续转入新的培养基上培养的过程。
无性繁殖系： 由同一外植体反复进行继代培养后，所得到的一系列无性繁殖后代。
单细胞无性系： 在细胞培养中，由单细胞形成的无性系。
愈伤组织（ callus ）： 在培养过程中，从植物各种器官、组织的外植体增殖而形成的一种无特定结构和功能的细胞团。
胚状体（ embryoid ）： 由外植体或愈伤组织产生的，与正常受精卵发育方式类似的胚胎结构体。
二、植物组织培养的基本程序
1 ．培养用具的准备
2 ．培养基的制备
基本成分（大量元素、微量元素、有机成分、铁盐）、碳源（蔗糖、葡萄糖等）、凝固剂（琼脂、卡拉胶等）、植物生长调节剂（生长素、细胞分裂素等）、其他附加成分（活性炭、 LH 、 CH 、椰乳等）、 pH 值
3 ．外植体的选择
4 ．接种（无菌操作）
5 ．离体培养
初代培养、继代培养
愈伤组织诱导、不定芽分化（体胚再生）、增殖培养、生根培养等
培养条件、培养方式
6 ．炼苗移栽
三、植物组织培养的内容
1 ．植株培养
2 ．茎尖与分生组织培养
3 ．胚培养（ embryo culture ）
4 ．离体器官培养（ organ culture ）
5 ．花药与花粉培养（ anther & pollen ）
6 ．胚珠和子房培养（ ovule & ovary ）
7 ．胚乳培养（ endosperm culture ）
8 ．细胞培养（ cell culture ）
9 ．离体授粉受精（ in vitro fertilization ）
四、植物组织培养在园林植物育种中的应用
• 快速繁殖植物品种、珍稀植物
• 脱除病毒，培养无病毒苗木
• 进行种质资源的长期保存和远距离运输
• 离体诱发和筛选突变体
离体辐射或化学诱变；体细胞无性系变异的选择
• 获得倍性不同的植株
花药（粉）培养获得单倍体；胚乳培养获得三倍体
• 克服种子发育和萌发中的障碍
兰花种子萌发；胚抢救等
• 克服远缘杂交困难
离体授粉受精
• 提供育种中间材料
第二节 植物原生质体培养与细胞融合
一、概念
原生质体：被去掉细胞壁的具有生活力的裸露细胞。
原生质体培养：将去掉了细胞壁的裸露细胞培养成植株的技术。
原生质体融合（细胞融合、体细胞杂交）：将不同种、甚至属间细胞人工融合为杂种细胞，并使其再生成植株的技术。
二、原生质体培养与细胞融合的方法步骤
1 ．原生质体的制备
获得大量有活力的原生质体。
• 原生质体的分离
机械分离法
酶解分离法：分离材料的准备（离体叶片、悬浮细胞等）
酶解（果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶等）
2 ）原生质体的收集与纯化
过滤－离心法（沉淀法）
漂浮法
界面法
3 ）原生质体的活力测定：形态、活性染色、荧光染料活性染色等方法
影响原生质体活力的因素：
• 分离材料的生理状态
• 酶解条件：酶质量、浓度、酶解温度、酶解时间、酶溶液的渗透压
• 分离条件：离心次数、离心速度、纯化方法、分离持续时间
• 环境条件：操作环境的温度、分离用具的影响
2 ．原生质体的培养
培养原生质体的基本营养同一般组培；对某些组分，如钙和碳源的水平要求更为严格。在培养基中保持一定的渗透压极为重要。
常用的培养基有： MS 培养基、 N-T 培养基、 B5 培养基等。
注意原生质的湿度及培养时的温度和光照。
培养方法：固体培养法；浅层液体培养法；双层培养法
3 ．细胞融合
1 ）原生质体融合
PEG 法、电融合法、高 pH －高浓度钙离子法、 NaNO 3 法等；
2 ）杂种细胞的筛选
突变细胞遗传互补选择法
营养互补选择法
根据原生质体特性差异的机械选择法
3 ）体细胞杂种植株的鉴定
形态学方法、细胞学方法，同工酶法，分子标记法等。
融合体的类型：
对称融合
非对称融合
三、原生质体操作在育种中的应用
• 培育新品种
• 创造新种质
• 克服远缘杂交不亲和、杂交不育等障碍
• 作为基因工程的良好受体
• 进行突变体筛选的优良原始材料
第三节 植物基因工程
一、植物基因工程的概念及其研究概况
植物基因工程（ plant genetic engineering ）是指按照人们的意志，通过一定的程序，将具有遗传信息的 DNA 片段，在离体条件下，用工具酶加以剪切、组合和拼接，再将人工重组的基因，引入适当的植物受体中进行复制和表达的技术。
1972 年，构建第一个重组 DNA 分子。
1983 年，世界上获得首例转基因植物。
1985 年，创建叶盘法进行植物的遗传转化。
迄今，已成功获得大量的转基因植物，园林植物包括矮牵牛、金鱼草、菊花、非洲菊、香石竹、满天星、月季、百合、唐菖蒲、郁金香、仙客来、石蒜、水仙、花叶芋、吊兰、长春花、南非菊、风铃草、半边莲、六出花、夏堇、草原龙胆、蔓陀罗、长寿花、秋海棠、蝴蝶兰、石斛、结缕草、高羊茅、山茶、连翘、杜鹃花、杨树、桉树、刺槐、美国枫香、欧洲白桦、挪威云杉、松类等。
二、植物基因工程的一般程序与方法
1 ．目的基因的分离与克隆
PCR 技术
转座子标签技术
基因组相减技术
cDNA 差异显示技术等
2 ．植物表达载体的构建
1 ）启动子的选择
组成型启动子： 35S
特异性启动子：组织特异性、诱导特异性
2 ）终止子
3 ）选择标记基因： npt-II 、 hpt 、 bar 等
3 ．植物的遗传转化
1 ）农杆菌介导法
2 ）基因枪法
3 ）花粉管通道法
4 ）其他方法： PEG 法、电激法、显微注射法、激光法、脂质体法、超声波法、真空浸润法、碳硅纤维介导法
4 ．转化细胞的筛选及转基因植物的鉴定
1 ）转化体的筛选
抗性筛选：利用选择标记基因
利用报告基因： GUS 、 GFP
2 ）转化体的鉴定
PCR 检测
Southern 杂交
Northern 杂交
Western 杂交
5 ．转基因植物的安全性评价与商业释放
二、基因工程在园林植物育种中的应用
1 ．植物基因工程育种的优点
• 从基因水平上修饰植物的遗传物质，定向改造植物的遗传性状，提高了育种的目的性和精确性；
• 打破物种之间的生殖隔离障碍，实现了基因资源在生物界的共享，大大地扩展了育种的范围；
• 在很大程度上缩短了育种周期。
2 ．基因工程在园林植物遗传改良中的应用
• 修饰花色
• 改良花型
• 增加花香
• 延缓衰老
• 延长花期
• 改变株形
• 创造不育
• 提高抗病虫能力
• 改善抗逆性
• 抗除草剂
• 改善生长特性
• 治理环境污染
第四节 分子标记及其在育种中的应用
一、常见 DNA 分子标记技术
基于 DNA-DNA 杂交的 DNA 标记： RFLP
基于 PCR 技术的 DNA 标记： RAPD 、 ISSR ； SSR 、 SCAR
基于限制性酶切和 PCR 的 DNA 标记： AFLP 、 CAPS
基于单个核苷酸多态性的 DNA 标记： SNP
1 ． RFLP 标记
限制性片段长度多态性（ Restriction Fragment Length Polymorphism 1 ）工作原理：
）
由于单碱基的替换、 DNA 片断的插入、缺失、易位、倒位等，引起同源 DNA 序列上限制性内切酶的识别位点或位点间的 DNA 区段不同，从而导致酶切片段的多态性。
2 ）基本程序：酶切→电泳后转膜→预杂交 / 杂交→放射自显影。
3 ）特点：
共显性标记，不受显隐性、环境和发育阶段的影响；多态性丰富，重复性稳定性好。
实验过程中需对探针进行标记，操作繁琐，耗时费力； DNA 需求量大。
目前已较少使用。
2 ． RAPD 标记
随机扩增多态性 DNA （ Random Amplified Polymorphic DNA ）
1 ）工作原理：
利用一系列不同的随机引物（ 9-10 bp ）对所研究物种的基因组 DNA 进行扩增，模板 DNA 序列上引物的结合位点不同，导致扩增产物 DNA 片段的多态性。
2 ）基本程序：引物筛选→ PCR 扩增→琼脂糖凝胶电泳→谱带分析。
3 ）特点：
操作简单易行，一套引物可用于不同物种的基因组分析；多态性高，所需 DNA 量少。
显性标记，不能区分显性纯合和杂合基因型；实验结果易受实验条件的影响，重复性较差。
应用较多：品种分类、种质鉴定、遗传多样性分析等。
3 ． SSR 标记
微卫星简单重复序列（ Microsatellite Simple Sequence Repeats ）
1 ）工作原理：
以 2-6 个核苷酸为基本单元的简单串联重复序列称为微卫星或简单序列重复； SSR 座位两侧具有保守的单拷贝序列，不同物种或品种，所含 SSR 各异（重复次数不同）
2 ）基本程序：设计特异引物→ PCR 扩增→聚丙稀酰胺凝胶电泳→多态性分析。
3 ）特点：
操作简便，稳定可靠；具有大量的等位差异，多态性十分丰富。
依赖 SSR 的克隆和测序设计引物，开发成本较高。
应用前景好：遗传作图、种质鉴定、品种分类
4 ． AFLP 标记
限制性扩增片段长度多态性（ Amplified Fragment Length Polymorphism ）
1 ）工作原理：
通过对基因组 DNA 酶切片段的选择性扩增来检测 DNA 酶切片段长度的多态性。 PCR 与 RFLP 相结合的产物。多态性来自酶切位点和其后的选择性碱基的变异。
2 ）基 本程序：总 DNA 酶切，寡聚核苷酸连接头的连接→ PCR 扩增→聚丙稀酰胺凝胶电泳→检测。
3 ）特点：
具有 RFLP 的可靠性和 PCR 的高效、灵敏性；一次反应能扩出 50 ～ 100 条谱带，具有丰富的多态性。
需对引物进行标记，相对比较费时耗财。
目前应用不多。
二、分子标记在育种中的应用
• 种质资源及遗传多样性分析
• 利用分子标记进行基因定位
• 构建分子遗传图谱
• 资源评价与品种鉴定
• 分子标记辅助选择
本章思考题：
1 ．植物组织培养在园林植物育种中的作用有哪些？
2 ．结合实例谈谈园林植物基因工程改良的应用前景。
3 ．常见 DNA 分子标记的种类及其工作原理。
因篇幅问题不能全部显示，请点此查看更多更全内容