荧光定量PCR仪使用、维护、校准标准操作规程

文件名称 AB7500荧光定量PCR仪使用、维护、校准标准操作规程 复核人： 复核日期： 版本 _____份 修订人 颁发部门 制订人： 质保部 制订日期： 批准人： 批准日期： 编号 SOP04006 执行日期 制作份数 修订记录 1.0 修订内容 发送部门 修订原因 版本 修订日期 1. 目的：

确保荧光定量PCR仪能够正确和正常的使用，保证扩增及结果分析的标准化、规范化。

2. 范围：

适用于AB7500荧光定量PCR仪的使用及维护。

3. 定义：

无

4. 职责：

荧光定量PCR仪使用人员负责本规程的实施。 质保部对本规定的有效执行承担监督检查责任。

5. 内容：

5.1 室内温度控制在15～30℃，相对湿度45～75%。 5.2 仪器操作

5.2.1 依次打开电脑显示器和电脑主机的电源开关，进入Windows界面。 5.2.2 接着打开AB7500仪器电源开关，预热10分钟。 5.2.3 点击7500 Software v2.3图标，打开软件。

5.2.4 按压仪器托盘上的按压位，待托盘弹出后，将所需检测的8联PCR反应管或者96孔PCR反应

板放入检测孔位，记下放置位置。检测8联PCR反应管用**反应孔模块，检测96孔PCR反应板用**反应孔模块。（检测8联PCR反应管需放入盖紧管盖的空8联PCR反应管配平，检测96孔PCR反应板无需配平） 5.2.5 再次按压托盘使其滑入仪器。

5.2.6 新建扩增参数模板：例如新建一个UG-63-62的模板，扩增参数是95°，10′；（95°，10″；63°，

45″）×5 cycles；（95°，10″；62°，35″）×40 cycles，在62°时收集荧光信号（HEX、FAM信号），

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20μl反应体系。

5.2.6.1 在Setup-Plate Setup-Define Targets and Samples中，将Target Name下的Target1改成FAM；

点击Add New Target，将新增的Target1改成HEX，点击Reportee下拉菜单，选择VIC。

5.2.6.2在Setup-Run Method-Graphical View中的Reaction Volume Per Well后面输入20（20μl反应

体系）。选中第一个Holding Stage，点击Delete Selected删除；在Cycling Stage中的Number of Cycles后输入5，在Step1中输入时间10秒，在Step2中输入温度63度，输入时间45秒，将63度下面收集荧光图标点掉；点击Add Stage下拉菜单选择Cycling，在Cycling Stage中的Number of Cycles后输入40，在Step1中输入时间10秒，在Step2中输入温度62度，输入时间35秒，在62度下面点击图标收集荧光。

5.2.6.3 点击Save下拉菜单下的Save As Tamplate，文件名输入UG-63-62，保存在默认

ab7500-config-tamplates文件夹内，关闭设置界面。

5.2.7 已有扩增参数模板：在软件Home界面中点击Template，选择需要的模板，点击打开。例如：

UG-63-62，其扩增参数就是95°，10′；（95°，10″；63°，45″）×5 cycles；（95°，10″；62°，35″）×40 cycles，在62°时收集荧光信号（HEX、FAM信号），Reaction Volume Per Well:20μl（20μl反应体系）。

5.2.8 在Setup-Plate Setup-Assign Targets and Samples中选择8联管摆放的位置，全部勾选Sample

1；UGT1A1*6勾选HEX，UGT1A1*28勾选FAM。

5.2.9 在Run-Amplification Plot中点击START RUN，命名为20140101-1（当日日期+当日上机次数，

例:2014年1月1日第1次上机编号为20140101-1），保存在默认文件夹中，开始运行。 5.2.10 结果分析

5.2.10.1 PCR反应结束后自动保存结果，对扩增曲线进行分析。

5.2.10.2 也可根据分析后图像调节Baseline的Start值、End值以（用户可根据实际情况自行调整，Start

值可以在3～15、End值可设在5～20），Threshold值（Rn）推荐设定为5000～15000，点击Analyze进行分析，然后到Plate窗口下记录每个反应的Ct值。

5.2.11实验结束后取出反应管（切勿打开管盖），顺序关闭AB7500软件、定量PCR仪电源，关闭电脑。 5.3 仪器维护 5.3.1 每周维护

5.3.1.1 检查计算机磁盘空间。如需要，将实验文件归档或备份。 • 至少每周检查一次计算机磁盘空间。

• 如果硬盘的可用空间不足其总容量的20%，应将较陈旧的数据传输到备份存储设备上保存。 5.3.1.2 关闭控制7500 Instrument的计算机，30秒后再次开启计算机。

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5.3.1.3 用无绒布块（不脱毛）蘸取75%酒精清洁7500 Instrument的表面。（注：切勿使用有机溶剂清

洁7500 Instrument。）

5.3.1.4 使用75%酒精浸泡反应管托架（晾干后放回仪器内）。 5.3.2 每月维护

5.3.2.1 执行背景校准。（可执行一次背景校准以检查是否存在污染物） 5.3.2.2 运行磁盘清理和磁盘碎片整理。 • 至少每月一次。

• 当Windows®操作系统显示消息提示执行碎片整理时。

• 切勿同时运行磁盘管理实用工具和7500 Real-Time PCR Software。 5.3.3 每半年（6个月）维护 5.3.3.1 检查灯具状态。

①在7500 Software中，选择Instrument→Lamp Status/Replacement以确定卤素灯的状态。 显示Lamp Status/Replacement对话框： • Condition –表示以下其中一种状况：

– Good –灯具工作良好，不需要更换。单击Close。

– Failed –必须更换灯具。单击Close，然后按照5.3.4.3步骤更换卤素灯。

– Change Soon –灯具使用超过2000小时；生产商建议将其更换。单击Close，然后决定是否更换灯具。如果决定更换，请按照5.3.4.3步骤更换卤素灯。 • Usage (Hours) –灯具已照明的总小时数。

• Lamp Current –灯具的输出电流，以安培为单位(A)。低电流意味着灯具可能将要失效。 • Date Last Replaced –上次更换灯具的日期。

②在执行一次运行之前或期间，7500 Software可能显示以下警告：

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消息 描述 Warning – Cannot detect sufficientcurrent from 在运行开始时，灯具电流低于可接受水平。在lamp. Either lamp is notinstalled properly or 按照5.3.4.3步骤更换卤素灯具之前，无法继needs to bereplaced. 续该运行。 Warning – Cannot detect sufficientcurrent from 7500 Software停止了该次运行，因为在运行lamp. Either lamp is notinstalled properly or 中灯具电流下降到可接受水平之下。在按照needs to bereplaced. 5.3.4.3步骤更换卤素灯具之前，无法继续该运行。在消息框中单击OK，检查仪器日志，然后更换灯具。 Warning - The lamp usage hasexceeded 2000 在运行开始时，灯具使用时间超过2000小时。hr. We recommendreplacing the lamp soon to 单击Cancel Run，然后更换灯具，或者单击ensure optimal assay performance. Continue Run。重新运行ROI、背景、光学和染料校准。 5.3.3.2 执行目标区（ROI）校正。 5.3.3.3 执行背景校准。 5.3.3.4 执行光学校准。 5.3.3.5 执行染料校准。

5.3.3.6 执行RNase P仪器验证试验。 5.3.4 其它维护任务（需要时执行） 5.3.4.1 样本块污染清除。

执行以下程序，去除7500 Instrument样本块的荧光污染。荧光污染是导致背景运行失败的常

见原因，在此情况下，一个或多个反应孔会持续表现出异常的高信号。

注意！切勿移去设备上的盖板。7500 Instrument中没有用户可安全维修的组件。如果怀疑存在问题，请联系生产商服务代表。

①全程戴上一次性无粉手套操作。

②找到样本块中受污染的反应孔（参阅5.4.2.13 “如何确定污染”）。 ③从7500 Real-Time PCR Instrument中取出反应板和托盘支架。 a.按压托盘门，将其打开。 b.取出反应板和托盘支架。

c.关闭托盘门。以一定角度向托盘右侧施加压力。

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④手动降低样本块：

a.在7500 Software中，选择 Instrument→Instrument Maintenance Manager。

b.在Instrument Maintenance Manager的ROI选项卡中，单击Start Manual Calibration。 c .在ROI Inspector对话框中，单击Move Block。

d.当ROI Inspector对话框显示“Block Down”时，单击Done。

⑤关闭7500 Real-Time PCR Instrument，然后拔下其电源电缆。允许仪器冷却15分钟。 ⑥打开7500 Real-Time PCR Instrument的检查门。

a.将薄型螺丝刀插入检查门边缘处的键销孔内，然后推动以解开门栓。 b.打开仪器前门。

⑦抬起门栓，然后将受热的护盖门推到仪器的背面。

⑧使用少量的双蒸水，清洁样本块中被污染的反应孔： a.用移液管吸取少量双蒸水并滴入每个受污染的反应孔中。

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b.抽吸并滴入反应孔中的双蒸水数次，以冲洗反应孔。 c.将用过的双蒸水水吸入废液瓶中。

d.使用棉花拭子，擦试每个被污染的反应孔的内壁。 e.使用无绒布料，吸出残余的双蒸水。

⑨7500 Real-Time PCR Instrument将受热的护盖门拉到仪器的正面。抬起门栓，然后将受热的护盖门紧固到交叉杆。

⑩打开7500 Real-Time PCR Instrument的检查门。

⑪插上电源插头并开启7500 Instrument。

⑫通过执行背景校准运行确认已消除污染（参阅5.4.2 “背景校准”）。

⑬如果污染仍然存在，重复步骤②至⑦，然后使用95%乙醇溶液清洁样本块中受污染的反应孔： a.用移液管吸取少量95%乙醇溶液并滴入每个受污染的反应孔中。 b.抽吸并滴入反应孔中的溶液数次，以冲洗反应孔。

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c.将用过的乙醇溶液吸入废液瓶中。

重要！使用漂白剂溶液或乙醇溶液清洁反应孔之后，应始终使用双蒸水冲洗反应孔。 ⑭重复步骤⑧至⑫，以冲洗样本块的反应孔，并验证已清除掉污染物。

⑮如果污染仍然存在，重复步骤②至⑦，然后使用10%漂白剂溶液清洁样本块中受污染的反应孔：

a.用移液管吸取少量10%漂白剂溶液并滴入每个受污染的反应孔中。 b.抽吸并滴入反应孔中的溶液数次，以冲洗反应孔。 c.将用过的漂白剂溶液吸入废液瓶中。

重要！使用漂白剂溶液或乙醇溶液清洁反应孔之后，应始终使用去离子水冲洗反应孔。 ⑯重复步骤⑧至⑫，以冲洗样本块的反应孔，并验证已清除掉污染物。如果仍有污染，请与生产商技术支持联系。

⑰确保受热盖门完全关闭并上闩。如果没有，则7500 Software显示错误消息。

5.3.4.2 移动PCR仪。（更换或移动光学器件的任何部件后，必须执行ROI校准、背景校准、光学校准、

染料校准以及RNase P仪器验证。）

5.3.4.3 更换卤素灯。

①全程戴上一次性无粉手套操作。

②关闭7500 Instrument，然后拔下其电源电缆。允许仪器冷却15分钟。

a.注意！灼热。7500 Instrument和灯具灼热！灯具在使用中会变得非常灼热。在处理灯具之前，应允许灯具冷却15分钟，并戴上无粉防护手套。

b.重要！为避免灼伤及缩短新灯具的使用寿命，处理灯具时请戴上一次性无粉手套。 c.注意！7500 Instrument按设计仅可使用12V、75W的卤素灯。 ③打开 7500 Instrument 的检查门。

a.将薄型螺丝刀插入检查门边缘处的键销孔内，然后推动以解开门栓。 b.打开仪器前门。

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④从仪器中取出灯具： a.向下滑动灯具释放杆。

b.用手紧紧地抓住卤素灯并向上提，使灯具从安装槽口中脱出。

a b

⑤查看灯具并确定有无故障迹象（有故障的灯具内壁上通常有碳黑层）。

⑥将新灯具安装至仪器上：

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a.向上滑动灯具释放杆。

b.用手紧紧地握住灯具，将灯具放入带槽口的安装座内，然后小心地向下滑动灯具，使其到位。

⑦关闭仪器前门。

⑧插上电源插头并开启7500 Instrument。 ⑨打开 ROI Inspector对话框：

a.在 7500 Software 中，选择 Instrument→Instrument Maintenance Manager。 b.在Instrument Maintenance Manager的ROI选项卡中，单击Start Manual Calibration。 ⑩在ROI Inspector对话框中，选择Lamp Control→Idle。

⑪当仪器运行时，通过检查门上的缝隙观察，确保灯具发光，然后单击Done。

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⑫如果灯具发光，在7500 Software中选择Instrument→Lamp Status/Replacement，单击Reset Lamp Timer，然后单击OK。如果灯具不发光，则替换的卤素灯可能有缺陷。重新更换灯具。如果再次更换灯具后仍不发光，检查仪器的保险丝是否存在故障（参阅第 71 页）。 ⑬更换灯具后，按顺序执行以下校准。请参阅： • 5.4.1 目标区（ROI）校准 • 5.4.2 背景校准 • 5.4.3 光学校准 • 5.4.4 染料校准 • 5.4.5 验证仪器性能

5.3.4.4 更换7500 Instrument保险丝。

①保险丝损坏时，更换7500 Real-Time PCR Instrument保险丝。（注意！为在长时间内防止火灾，更换保险丝时请使用类型和额定值与仪器原始保险丝相同的经认可的保险丝。） ②全程戴上一次性无粉手套操作。 ③关闭仪器电源，并拔下电源插头。

④使用平口螺丝刀从仪器上旋松并卸下保险丝座。

⑤将每一个保险丝从其保险丝座中取出，然后检查是否损坏。损坏的保险丝内部通常有炭黑覆盖。

⑥使用12.5A、250V、5×20mm保险丝更换损坏的保险丝。

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注：电压和电流额定值见保险丝座。 ⑦安装保险丝座。

⑧插上电源插头，然后开启仪器。如果仪器接通了电源，说明保险丝已安装成功。

注：保险丝损坏可能是由仪器供电电源波动导致。为了防止继续出现故障，可以考虑安装电气保护设备，例如UPS或其他电涌保护器。

5.3.4.5 更新Windows®操作系统。 5.3.4.6 更新7500 Software。

5.3.4.7 监控仪器状态（使用Function Test对话框对主要7500 Instrument组件执行高级诊断。一般情

况下不需要执行功能测试，除非怀疑有硬件故障，或者Life Technologies代表指示这样做。） ①在7500 Software中，选择Instrument→Function-Test。 ②根据需要执行功能测试。要测试：

 所有组件–单击All Tests，然后等候软件执行所有功能测试。  一个或多个特定组件–单击以下其中一项或多项。

• USB–测试 7500 Real-Time PCR Instrument和计算机之间的通用串行总线(USB)连接。如果7500 Software能够和7500 Real-Time PCR Instrument建立通信，则表示测试通过。

• CCD–测试7500 Real-Time PCR Instrument内的CCD摄像机。如果摄像机能够拍摄图像，则表示测试通过。

• Filter Wheel–测试7500 Real-Time PCR Instrument内的过滤轮。如果过滤轮控制器运行正确版本的固件，则表示测试通过。

• Shutter–测试7500 Real-Time PCR Instrument的光学快门。如果快门控制器运行正确版本的固件，则表示测试通过。

• Lamp–测试7500 Real-Time PCR Instrument的卤素灯。如果灯具控制器运行正确版本的固件，则表示测试通过。

• Thermal Cycler–测试7500 Real-Time PCR Instrument内的热循环仪样本块。如果热循环仪的控制器运行正确版本的固件，则表示测试通过。

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当7500 Software完成一项测试时，软件报告该测试的通过/失败状态，并提供结果描述。

③结束测试时，单击Close。

5.4 仪器校准

5.4.1 目标区（ROI）校准

5.4.1.1 全程戴上一次性无粉手套操作。

5.4.1.2 从贮存在冷冻柜内的光谱校准套件中取出ROI校准反应板。

5.4.1.3 让ROI校准反应板温度上升至室内温度（约需5分钟）。在立即运行反应板之前，不要从包装袋

内取出ROI校准反应板。反应孔中的荧光染料具有光敏感特性。长时间曝光可降低染料在反应板中的荧光。

5.4.1.4 从包装袋中取出ROI校准反应板。将光学薄膜留在反应板上。不要丢弃存放ROI校准反应板的

包装袋。若贮存于原始包袋中，反应板最多可重复使用三次。

5.4.1.5 振荡ROI校准反应板5秒钟。

5.4.1.6 用板式离心机将反应板离心2分钟。ROI校准反应板必须充分混合并离心。

5.4.1.7 确认ROI校准反应板每个反应孔中的液体均位于反应孔底部。如果不是，则以更高的转速及更

长的时间离心反应板。

5.4.1.8 按压托盘门，将其打开。将反应板装入仪器中的反应板架。确保放置时反应板在反应孔板适配器

中被正确对齐。（装入标准反应板，使A12凹口位置位于托盘的右上角。）

5.4.1.9 以一定角度向托盘右侧施加压力，从而关闭托盘门。 5.4.1.10 执行自动ROI校准

①在7500 Software中，选择Instrument→Instrument Maintenance Manager。 ②在Instrument Maintenance Manager的ROI选项卡中，单击Start Calibration。

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③按照向导的指示，完成校准。ROI Calibration对话框显示三个选项卡：

• Setup–显示ROI校准设置说明。单击Next提示可以打开Run选项卡。

• Run–单击START RUN可以开始校准流程并显示处理消息。单击Next提示可以打开Analysis选项卡。

• Analysis–指明校准状态（Passed/Failed）。

如果校准失败，请参阅5.4.1.13 “排除ROI校准故障”。

5.4.1.11 执行手动ROI校准

①在7500 Software中，选择Instrument→Instrument Maintenance Manager。

②在Instrument Maintenance Manager的ROI选项卡中，单击Start Manual Calibration。 ③在ROI Inspector对话框中（如图1）：

a.在Exposure Time字段中，输入2048。 b.选择Filter A（滤光器1）。

图1

④单击Snapshot，生成一张ROI图像。

⑤确定ROI图像是否可接受（下图所示为未饱和以及过饱和的图像）。可接受图像中的反应孔：

• 在不过饱和的前提下，必须尽可能明亮。（生成ROI校准时，如果反应孔过饱和，则显示一条警告。）

• 可以含有但不是必须含有红色像素（表示饱和）。

未饱和 正常饱和 过度饱和 .

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可接受 不可接受 ⑥如果ROI图像可接受，转至步骤⑦。如果ROI图像过饱和，将Exposure Time降低一半，

然后单击Snapshot。重复执行，直至获得可接受的ROI图像。如果无法获得可接受的图像，请参阅5.4.1.13 “排除ROI校准故障”。

⑦单击Generate Calibration。7500 Software采集一张截图，然后显示一个消息框或ROI图

像：

如果软件显示： 执行： a. 单击OK。 b. 将Exposure Time降低一半（参阅5.4.1.11步骤③a）。 或 c. 重复步骤③和⑤。 ROI 图像非常模糊或者无法成功校准。 请参阅5.4.1.13 “排除ROI校准故障”。 可接受的校准图像 注：在所有反应孔周围出现绿色圆圈，表示反应孔成功校准。 验证以下各项： •Wells Found值为96。 成功校准–Wells Found必须.

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为96。 •在ROI图像上每个反应孔区的周围显示绿色圆圈。 注：绿色圆圈表示反应孔位置的目标区已足够亮。 ⑧单击Save Calibration。

软件保存滤光器1新产生的ROI校准。在ROI Inspector的Filter Masks Loaded区域，“OK”出现在滤光器1旁边。

⑨对其余滤光器重复步骤③至⑧，对每个滤光器执行校准之前，将Exposure Time重置为

2048。当所有滤光器的Filter Masks Loaded都显示OK时，ROI校准完成。

当所有滤光器的Filter Masks Loaded都是OK时，校准完成。

⑩点击 Done。

5.4.1.12 拆卸反应板（注意！灼热。仪器工作期间，样本块温度可能超过100°C。若刚使用过仪器，

在样本块恢复至室温之前，请勿触摸样本块。） ①取出校准反应板： a.按压托盘门，将其打开。 b.取出校准反应板。 c.按压托盘门，将其关闭。

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②将校准反应板放入其包装套中。如果要执行背景和光学校准：

a.在接下来的8小时，将ROI校准反应板置于室温下。光学校准使用ROI校准反应板。 b.第二天将放入包装套的反应板放回贮存在冷冻柜内的光谱校准套件中。

c.重要！不要丢弃校准反应板。如果将反应板装在其原始包装套内贮存，在打开其包装后最多可重复使用反应板3次。

d.重要！执行ROI校准后，也必须执行背景校准、光学校准、染料校准以及仪器验证。

5.4.1.13 排除ROI校准故障

问题/症状 ROI 校准失败 ROI 图像模糊 可能原因 样本块可能位于降低的位置。 行动 1.如果ROI Inspector的CCD Control/Settings显示“Block Up”，则单击Block Up将样本块升高。 2.检查确认受热的盖组件已被全程向前拉出，以确保托盘可以被正确推入。如果7500 Instrument安装了受热盖栓，检查确认盖栓处于锁定位置。 3.如果ROI校准仍然失败，检查7500 Instrument内的卤素灯状态（参阅5.3.3.1 “监控灯具状态”），然后，如果需要时，更换灯具（参阅5.3.4.3 “更换卤素灯”）。 5.4.2 背景校准

5.4.2.1 全程戴上一次性无粉手套操作。

5.4.2.2 从贮存在冷冻柜内的光谱校准套件中取出准备好的背景反应板。 5.4.2.3 让背景反应板温度上升至室温（至少需要5分钟）。

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5.4.2.4 从包装袋中取出背景反应板。（重要！不要丢弃存放反应板的包装袋。若将背景反应板贮存在其

原始包装套内，背景反应板最多可重复使用三次。）

5.4.2.5 振荡反应板5秒钟。

5.4.2.6 用板式离心机将反应板离心2分钟。反应板必须充分混合并离心。确认反应板每个背景反应孔

中的液体均位于反应孔底部。如果不是，则以更长的时间离心反应板。

5.4.2.7 按压托盘门，将其打开。将反应板装入仪器中的反应板架。确保放置时反应板在反应孔板适配器

中被正确对齐。以一定角度向托盘右侧施加压力，从而关闭托盘门。（注：如果无法打开托盘，样本块可能位于其“升高”位置，锁定了托盘门位置。要降低样本块，选择 Instrument→Calibrate，然后退出ROI Inspector。）

5.4.2.8 在7500 Software中，选择Instrument→Instrument Maintenance Manager。在Instrument

Maintenance Manager中，选择Background选项卡。在Background选项卡中，单击Start Calibration。

5.4.2.9 按照向导的指示，完成校准。Background Calibration对话框显示四个选项卡：

• Overview–显示校准相关信息。

• Setup–显示背景校准设置说明。单击Next提示可以打开Run选项卡。

• Run–单击START RUN可以开始校准流程并显示处理消息。单击Next提示可以打开Analysis选项卡。

• Analysis–指明校准状态(Passed/Failed)。

如果校准失败，请参阅5.4.2.12 “排除背景校准故障”。

注：开始校准之前，仪器可能暂停一段时间（最多可达10分钟），以允许受热的护盖达到正确温度。

5.4.2.10 校准完成后，取出校准反应板：

①按压托盘门，将其打开。 ②取出校准反应板。

③按压托盘门，使其滑入仪器。

5.4.2.11 将校准反应板放入其包装套内，并将包装好的反应板放回冷冻柜内的光谱校准套件中。（重要！

不要丢弃校准反应板。如果将反应板装在其原始包装套内贮存，在初次打开其包装后最多可重复使用反应板3次。）

5.4.2.12 排除背景校准故障

问题/症状 背景校准失败 .

可能原因 背景反应板上的一个或多行动 1.使用相同的背景反应板重复执行校准。 精品文档

个反应孔产生的光谱超过仪器的最高限度。 2.若校准再次失败，请使用另一不同的背景反应板重复执行校准。 3.若校准再次失败，请按下文“如何确定污染”的说明，确定污染源。 5.4.2.13 如何确定污染

若信号超过正常背景荧光的限度，则表明校准反应板或样本块上存在荧光污染物。常见污染物

包括记号笔中残存的油墨、一次性手套洒落的粉末及灰尘。 欲确定污染来源和位置：

①在查看原始数据时，选择反应板布局中数块连续的较小区域，以找出受污染反应孔 的位置。

②将背景反应板旋转180°，然后再次执行背景校准。

③重复步骤①以找出污染物的位置。如果步骤①和③中找到的包含污染物的反应孔位置： • 相同–则表明样本块中含有污染物。请按照“5.3.4.1 样本块污染清除”的说明，除去样本块中的污染物。

• 相反–则表明背景反应板中含有污染物。丢弃当前使用的背景反应板，并使用新背景反应板执行背景校准程序。

如果更换背景反应板并且取出样本块的污染后校准失败： ④将用黑纸覆盖的反应板装入7500 Instrument。 ⑤按照本章的说明，执行背景校准程序。 ⑥校准完成后，选择反应板布局中的所有反应孔。 ⑦查看光谱图谱中的峰值。如果峰值：

• 可见–则表明7500 Instrument的光学部件可能已被污染。请与生产商联系。

• 不存在–则表明样本块已被污染。请按照“5.3.4.1 样本块污染清除”的说明，除去样本块中的污染物。

5.4.3 光学校准

5.4.3.1 全程戴上一次性无粉手套操作。

5.4.3.2从贮存在冷冻柜内的光谱校准套件中取出ROI校准反应板。 5.4.3.3 让ROI校准反应板温度上升至室温（至少需要5分钟）。

5.4.3.4 从包装袋中取出ROI校准反应板，振荡反应板5秒钟。（重要！不要丢弃存放反应板的包装袋。

若将ROI校准反应板贮存在其原始包装套内，ROI校准反应板最多可重复使用三次。） （如果执行ROI校准后，将ROI校准反应板保持在室温，则跳到步骤5.4.3.5，以减少在反应

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板在室温时形成的冷凝。如果ROI校准反应板位于冷冻柜中，转至步骤5.4.3.2。

5.4.3.5 用板式离心机将反应板离心2分钟。ROI校准反应板必须充分混合并离心。确认ROI校准反应

板每个反应孔中的液体均位于反应孔底部。如果不是，则以更长的时间离心反应板。

5.4.3.6 按压托盘门，将其打开。将反应板装入仪器中的反应板架。确保放置时反应板在反应孔板适配器

中被正确对齐。以一定角度向托盘右侧施加压力，从而关闭托盘门。

5.4.3.7 在7500 Software中，选择Instrument→Instrument Maintenance Manager。在Instrument

Maintenance Manager中，选择Optical选项卡。在Optical选项卡中，单击Start Calibration。

5.4.3.8 按照向导的指示，完成校准。Optical Calibration对话框显示四个选项卡：

• Overview–显示校准相关信息。

• Setup–显示光学校准设置说明。单击Next提示可以打开Run选项卡。

• Run–单击START RUN可以开始校准流程并显示处理消息。单击Next提示可以打开Analysis选项卡。

• Analysis–指明校准状态(Passed/Failed)。

如果校准失败，请参阅5.4.2.12 “排除背景校准故障”。

注：开始校准之前，仪器可能暂停一段时间（最多可达10分钟），以允许受热的护盖达到正确温度。

5.4.3.9 取出校准反应板：

①按压托盘门，将其打开。 ②取出校准反应板。

③按压托盘门，使其滑入仪器。

5.4.3.10 将校准反应板放入其包装套中。将放入包装套的反应板放回贮存在冷冻柜内的光谱校准套件

中。（重要！不要丢弃校准反应板。如果将反应板装在其原始包装套内贮存，在打开其包装后最多可重复使用反应板3次。）

5.4.4 染料校准

5.4.4.1 全程戴上一次性无粉手套操作。

5.4.4.2 从冷冻柜中取出光谱校准套件，并从套件内取出所有染料反应板。 5.4.4.3 将光谱校准套件放回冷冻柜贮藏。

5.4.4.4 让染料反应板温度上升至室内温度（约需5分钟）。

（重要！在立即运行之前，请勿从包装袋内取出染料反应板。在每个染料反应板上，反应孔中的荧光染料具有光敏感特性。长时间暴露在光线中会降低反应板的荧光信号强度。）

注：如果将7500 Real-Time PCR Instrument染料反应板贮存在其原始包装内并放在冷冻柜中，

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则在打开包装后6个月内可以校准7500 Real-Time PCR Instrument最多3次。

5.4.4.5 在7500 Software中，选择Instrument→Instrument Maintenance Manager。在Instrument

Maintenance Manager中，选择Dye选项卡。在Dye屏幕上，选择System Dye Calibration。单击Start Calibration。

5.4.4.6 按照向导的指示，完成每个反应板的校准。（重要！在每个校准中，向导将单独指示。必须独立

设置、运行和分析每个染料反应板。）Dye Calibration对话框显示四个选项卡： • Overview–显示校准相关信息。当软件提示获取需要的材料时，选择要校准的染料。 • Setup–显示染料校准设置说明。单击Next提示可以打开Run选项卡。当软件提示装入染料反应板时，按照步骤5.4.4.10所述准备并装载反应板。

• Run–单击START RUN可以开始校准流程并显示处理消息。单击Next提示可以打开Analysis选项卡。

• Analysis–指明校准状态(Passed/Failed)。当软件提示分析从每个染料反应板采集的光谱时，核实校准的状态：

• Passed－7500 Instrument校准通过。转到步骤5.4.4.11的②。

• Failed－7500 Instrument校准失败。请参阅5.4.4.15 “排除染料校准故障”。

注：开始校准之前，仪器可能暂停一段时间（最多可达10分钟），以允许受热的护盖达到正确温度。

5.4.4.7 将软件所需的染料反应板从其包装中取出。振荡反应板5秒钟。（重要！不要丢弃存放反应板的

包装袋。若贮存于原包袋中，反应板最多可重复使用3次。

5.4.4.8 用板式离心机将反应板离心2分钟。反应板必须充分混合并离心。确认反应板每个背景反应孔

中的液体均位于反应孔底部。如果不是，则以更长的时间离心反应板。

5.4.4.9 检查并确保要装入的染料反应板与在7500 Software中选取的荧光匹配。

5.4.4.10 按压托盘门，将其打开。将反应板装入仪器中的反应板架。确保放置时反应板在反应孔板适配

器中被正确对齐。关闭托盘门。以一定角度向托盘右侧施加压力。（注：如果无法打开托盘，样本块可能位于其“升高”位置，锁定了托盘位置。要降低样本块，选择Instrument→Calibrate，然后退出ROI Inspector。）

5.4.4.11 因为向导对每个染料校准单独提供指示，所以请对校准的每个染料执行以下程序。

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① ②a ②b ③ ①验证校准状态：

• Passed－7500 Instrument校准通过。转到b）。

• Failed－7500 Instrument校准失败。请参阅5.4.4.15 “排除染料校准故障”。 ②核实染料光谱的分组：

a.在反应板布局中，选择反应板的孔。 b.检查原始数据。对于每个光谱，请确认峰值： • 位于7500 Instrument的可检测范围内。 • 无不规格光谱峰值。 • 出现在染料的正确通道上。

如果某光谱不符合上述标准，请参阅5.4.4.15 “排除染料校准故障”。

注：在含有相同染料的各反应孔中，光谱位置和峰值位置的差异是由于不同反应孔之间的光学属性及激发能存在细微差异而引起的。 ③若所有光谱均可接受，则单击Next。

5.4.4.12 取出校准反应板：（注意！ 灼热。仪器工作期间，样本块温度可能超过 100°C。若刚使用过

仪器，在样本块恢复至室温之前，请勿触摸样本块。） ①按压托盘门，将其打开。 ②取出校准反应板。 ③按压托盘门，将其关闭。

④将校准反应板放入其包装套中。将放入包装套的反应板放回贮存在冷冻柜内的光谱校准套件中。（注：如果将7500 Real-Time PCR Instrument染料反应板贮存在其原始包装内并放在

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冷冻柜中，则在打开包装后6个月内可以校准7500 Real-Time PCR Instrument最多3次。）

5.4.4.13 在按照指示将染料反应板取出后，单击Finish。 5.4.4.14 按照5.4.4.1开始操作，准备并运行下一个反应板。 滤光器 1 峰值(nm) -520 染料/光谱 FAM染料 SYBR Green染料 2 -550 JOE染料 VIC染料 3 -580 CY3染料 NED染料 TAMRA染料 4 -610 ROX染料 TEXAS RED染料 5 -670 CY5 染料 .

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5.4.4.15 排除染料校准故障

问题/症状 可能原因 行动 1.卸载 7500 Instrument 并查看光谱校准反应板的反应孔。若反应孔中的液体不是： – 位于反应孔底部，请将反应板离心更长时间，然后重复执行校准。 – 体积相等，则表明反应板未密封致使试剂挥发。请将其丢弃，并运行另一反应板。 2.若光谱校准反应板显示正常， 则丢弃该反应板并运行另一块反应板。 3.如果问题依然存在，请与生产商联系。 注：若正运行定制光谱校准反应板，请创建另一反应板但要增加产生不足信号的染料的浓度。 请按照5.4.2 “背景校准”操作，以确认是否存在污染物。若背景校准未显示样本块含有污染物，则光谱校准反应板可能含有污染物。 注：若正运行定制光谱校准反应板，请创建另一反应板但要降低超过可检测限量的染料的浓度。 一个或多个原始光•光谱校准反应板未充分离谱达到或低于校准心。 的可检测阈值。 •光谱校准反应板含有陈旧试剂或试剂体积不足。 •若正运行定制光谱校准反应板，染料可能浓度不足。 一个或多个原始光•样本块或光谱校准反应板含谱超过7500 有荧光污染物。 Instrument的最高•若正运行定制光谱校准反应限量。 板，染料可能浓度过大。 光谱在一个以上的样本块或光谱校准反应板含滤光器中含有峰有荧光污染物。 值。 5.4.5 验证仪器性能

5.4.5.1 全程戴上一次性无粉手套操作。

5.4.5.2 冷冻柜中取出TaqMan ® RNase P 96-Well Instrument Verification Plate，然后让反应板温度上

升到室温（大约需要5分钟）。

5.4.5.3 从包装袋中取出RNase P反应板。振荡反应板5秒钟。

5.4.5.4 用板式离心机将反应板离心2分钟。反应板必须充分混合并离心。确认液体位于反应板每个反

应孔底部。如果不是，则再次以更长的时间离心反应板。（重要！注意不要让RNase P反应板的底部染上尘污。反应板底部沾上的液体和其它污染物可污染样品区组，导致异常高的背景信号。）

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上图为RNase P反应板上标准和未知种群的分布情况。RNase P反应板包括五个重复组的标准物（1250、2500、5000、10,000和20,000拷贝）、两个未知重复组（5000和10,000拷贝）和阴性对照反应孔(NC)。

5.4.5.5 按压托盘门，将其打开。将反应板装入仪器中的反应板架。确保放置时反应板在反应孔板适配器

中被正确对齐。关闭托盘门。以一定角度向托盘右侧施加压力。

5.4.5.6 开始运行反应板：在7500 Software中，选择Instrument→Instrument Maintenance Manager。

在Instrument Maintenance Manager中，选择RNase P选项卡。在RNase P屏幕，单击Start RNase P Run。

5.4.5.7 按照向导的指示，完成校准。RNase P对话框显示四个选项卡：

• Overview–显示校准相关信息。

• Setup–显示RNase P运行设置说明。单击Next提示可以打开Run选项卡。

• Run–单击START RUN可以开始运行流程并显示处理消息。单击Next提示可以打开 Analysis选项卡。

• Analysis–指明运行状态(Passed/Failed)。

注：开始运行之前，仪器可能暂停（最长10分钟），以允许受热的护盖达到正确温度。 注：7500 Software完成RNase P运行后，会自动分析运行，并在Analysis屏幕显示结果。

5.4.5.8 在RNase P Run向导的Analysis屏幕上，确认运行状态：

• Passed–7500 Instrument RNase P运行通过。转到步骤5.4.5.12。

• Failed–7500 Instrument RNase P运行失败。请转至步骤5.4.5.9复查数据以查找异常值。 若运行失败，则自动分析中可能已包括了导致初始分析失败的异常值。实验性错误可能会导致某些反应孔扩增不充分或根本不扩增。这些孔通常产生和相关复本孔的平均值差异很大的CT值。如果在计算中包括这些偏差值（异常值），则会得出错误的测量结果。

5.4.5.9 在Amplification Plot中，从Plot Type下拉列表中选择Ct vs. Well。

5.4.5.10 通过比较CT值的分组，确认反应板上每个重复组（对照品、标准品和未知重复组）的均一性。

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①在反应板布局中，选择含有10,000份未知重复组的反应孔（反应孔F、G和H行）：

②在图中，确认重复组的CT等同。

注：图谱X轴上的数字，对应于反应板的反应孔。从反应孔A1开始，反应孔从左至右、从上至下编号。

③若所选组中出现一个异常值，则选择反应板布局中的相应反应孔，然后单击Omit以从分析中除去该反应孔。（重要！如果异常值的数量超过前表中的限制，订购另一个RNase P反应板，然后重复实验。）

可除去的最多反应孔个数 仪器 未知重复组 5000份 7500 6 10000份 6 标准物 （STD） 0 阴性对照 （NC） 0 ④为反应板上的每个重复组（未知重复组、标准物和阴性对照）重复步骤5.4.5.10 ①至5.4.5.10③。

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5.4.5.11 单击Reanalyze，在不使用异常值的情况下分析运行。若执行步骤5.4.5.9至5.4.5.11后，RNase

P运行的状态为Failed，请用另一不同的RNase P反应板重复RNase P实验。如果问题依然存在，请生产商联系。

5.4.5.12 查看标准曲线：

①选择 Standard Curve （标准曲线）选项卡。 ②单击 Plate Layout 的左上角以选择所有反应孔。 ③确认 R 2 值大于或等于 0.990。

若R2值小于0.990，请用另一不同的RNase P反应板重复RNase P实验。如果问题依然存在，请生产商联系。

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5.4.5.13 单击Next，然后移除校准反应板。（注意！灼热。仪器工作期间，样本块温度可能超过100°C。

若刚使用过仪器，在样本块恢复至室温之前，请勿触摸样本块。） ①按压托盘门，将其打开。 ②取出校准反应板。

③按压托盘门，使其滑入仪器。

5.4.5.14 丢弃反应板。

5.4.5.15 单击Finish，当提示保存实验时单击Yes。 5.4.5.16 排除RNase P实验故障

问题/症状 可能原因 行动 联系生产商服务和销售代表，并订购一套替换用的TaqMan ® RNase P Instrument Verification Plate。如果替换的RNase P反应板运行后仍失败，请与生产商技术支持或服务代表联系，以获取进一步帮助。 1.从仪器中取出RNase P反应板： a.按压托盘门，将其打开。 b.从托盘中取出RNase P反应板。 c.推压托盘，使其滑回仪器中。 2.拿起反应板并放在一个光源上观察，确保所有反应孔中包含相同容积的液体。 如果液体的容积不同，检查较少容积的反应孔的热密封，查 看有无损坏或蒸发迹象。 在RNase P数据•可能有污染 中的异常值数量超•反应孔内容物异常 过最大数量 RNase P验证反应•离心不足 板失败 •反应板密封有缺陷 .

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同时， 比较一下包含较少容积的反应孔的位置与已从反应板上删除忽略的异常值位置是否相同。 如果这些反应孔位置吻合，则表明反应板上的热密封可能已损坏，并使相应反应孔中的样本蒸发。 3.联系生产商服务和销售代表，并订购一套替换用的TaqMan ® RNase P Instrument Verification Plate。如果替换的RNase P反应板运行后仍失败，请与生产商技术支持或服务代表联系，以获取进一步帮助。

6. 相关文件：

FM-PD-05-01 设备档案卡 FM-PD-05-03 设备管理台账 FM-PD-05-04 设备使用记录 FM-PD-05-05 仪器设备维修记录 FM-PD-05-06 设备检修、保养记录 FM-PD-05-07 设备事故报告记录 FM-PD-05-08 设备清洁记录 FM04033-温控仪器温度校准记录

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