食品微生物能力验证试验中大肠杆菌O157∶H7的检测

２０１７年第６期　文章编号：１００５—３３８７（２０１７）０６—００３８—３９　食品微生物能力验证试验中大肠杆菌Ｏ１５７：Ｈ７的检测　江礼华王国胜丁宁钟碧旋　５１７０００）　（河源出入境检验检疫局，河源摘一要：探讨食品微生物能力验证样品试验中大肠杆菌Ｏ１５７：Ｈ７的检验方法及注意事项。采用ＧＢ／Ｔ　４７８９．３６—２００８第　法常规培养法，同时挑取可疑特征菌落进血平板培养试验，通过生化试验和血清试验，同时采用ＡＰＩ２０Ｅ生化鉴定系统，力ｆｌ　强检验阳性菌株的准确性。将可疑菌落经过血平板培养后，使阳性菌株鞭毛发育更完全，有助于判断阳性样品动力问题。　关键词：大肠杆菌Ｏ１５７：Ｈ７；能力验证试验　中图分类号：Ｑ９３９．１　文献标识码：Ａ　ＩＭ３Ｉ：１０．１６４２８／ｊ．ｃｎｋｉ．ｃｎｌＯ－１４６９／ｔｂ．２０１７．０６．０１３　０　引言　大肠杆菌Ｏ１５７：Ｈ７是肠出血性大肠埃希氏菌　（ＥＨＥＣ）众多血清型中非常重要的一组。自１９８２　年美国首次发生Ｏ１５７：Ｈ７型肠出血性大肠杆菌　Ｏ１５７（ＥＨＥＣ）引起的食物中毒后，该菌引起的食品　限公司），血平板（广东环凯微生物科技有限公司），　革兰氏染色液（广东环凯微生物科技有限公司）半　固体琼脂（广东环凯微生物科技有限公司），ＡＰＩ　２０Ｅ生化鉴定盒（法国梅里埃公司），大肠艾希氏菌　诊断血清Ｏ１５７（宁波天润生物药业有限公司），大　肠艾希氏菌诊断血清Ｈ７（宁波天润生物药业有限　公司），磷酸盐缓冲液（自制）。　１．３试验仪器　ＬＲＨ一２５０Ａ生化培养箱（韶关市泰宏医疗器械　中毒在美国、德国及澳大利亚等地方不断发生，　Ｏ１５７：Ｈ７的感染因具有暴发流行趋势、强烈的致　病性与致死性以及抗生素治疗可能会加剧病情等特　点．已成为全球性的公共卫生问题［１　］．Ｏ１５７：Ｈ７　具有很强感染性，其感染人的最低剂量为１０ｃｆｕ／ｇ。　有限公司）、生物安全柜（苏州安泰空气技术有限公　司）、三目生物显色镜（蔡司光学仪器国际贸易有限　公司）、高压灭菌锅（Ｈｉｒａｙａｍａ公司）及其他微生物　常规设备　１．４试验方法及原理　１．４．１样品处理　在我国动物肉制品中检出率较高，在广东、北京等省　市的多种食品中都检测到了Ｏ１５７：Ｈ７［２－３］．因此．　加强食品大肠杆菌Ｏ１５７：Ｈ７检验工作十分重要。　为了提高实验室对致病菌的检验鉴定能力．确保检　验结果的可靠性。２０１６年９月份，河源出入境检验　按照ＩＱＴＣ１６Ｂ０９食品中大肠杆菌Ｏ１５７的检验　检疫综合实验室参加了由广东出入境检验检疫局检　验检疫技术中心组织的食品中大肠杆菌Ｏ１５７能力　验证，本文就能力验证检验中大肠杆菌Ｏ１５７：Ｈ７　的分离鉴定和结果进行总结。　参试作业指导书的要求．在生物安全柜内，用５ｍＬ　磷酸盐缓冲液水花样品，待溶解后，吸出转入　２２５ｍＬ改良ＥＣ肉汤中，用１７．５ｍＬ的稀释液分次清　洗西林瓶内壁，回收清洗液加入至上述的２２５ｍＬ改　良ＥＣ肉汤中。然后。再将与西林瓶相同编码的基　质样品加入到上述２２５ｍＬ改良ＥＣ肉汤巾，充分均　１材料与方法　１．１样品　质混匀。得到样品编号ＰＴ２８、ＰＴ９４两个样舳原液，　３６ｑＣ培养２４ｈ。同时做阳性对照。　注意：所有操作中，必须在无菌环境下完成。　１．４．２分离　能力验证组织方（广东出入境检验检疫局检验　检疫技术中心提供样品）。　１．２培养基及试剂　ＥＣ肉汤（广东环凯微生物科技有限公司），山　将上述两个样品ＰＴ２８、ＰＴ９４分别划线接种山　梨醇麦康凯琼脂平板和ＣＨＲＭＡＧＡＲ　Ｏ１５７显色平　板，３６。【＝培养２４ｈ。　梨醇麦康凯琼脂基础（广东环凯微生物科技有限公　司），ＣＨＲＭＡＧＡＲ　Ｏ１５７显色培养基（上海欣中生物　工程有限公司），ＬＳＴ—ＭＵＧ（广东环凯微生物科技有　一结果：样品ＰＴ２８在山梨醇麦康凯琼脂平板为红　３８一　色菌落；在ＣＨＲＭＡＧＡＲ　０１５７显色平板为绿色菌落，　样品ＰＴ９４在山梨醇麦康凯琼脂平板上为圆形、光滑、　无色菌落：样品ＰＴ９４在ＣＨＲＭＡＧＡＲ　Ｏ１５７显色平板　上为淡紫色菌落。初步可以判断样品ＰＴ２８为非大肠　杆菌０１５７：Ｈ７；样品ＰＴ９４为可疑大肠杆菌Ｏ１５７。　菌落。　１．４．３生化试验及镜检　标有样品ＰＴ９４的山梨醇麦康凯琼脂平板和　ＣＨＲＭＡＧＡＲ　Ｏ１５７显色平板上分别挑取可疑特征　菌落接种ＴＳＩ、ＭＵＧ—ＬＳＴ、血平板、营养琼脂斜面，于　３６　培养２４ｈ。　注意：可疑特征菌落在山梨醇麦康凯琼脂平板　上为圆形、光滑、较小的无色菌落：可疑特征菌落在　ＣＨＲＭＡＧＡＲ　０１５７显色平板上为较小的淡紫色　表１　经血平板培养后的可疑特征菌落，穿刺接种半　固体琼脂，以及一系列的生化试验（表１和表２）。　ＶＰ　靛基质　西蒙氏　纤维　棉子糖　ＭＵＧ—　半固体　柠檬酸　二糖　Ｉ５Ｔ　传统生化反应结果　ＴＳＩ　斜面和　底层黄　色．　产　气、不产　硫化氢　氧化酶　革兰氏　赖氨酸　鸟氨酸　ＭＲ　染色　ＰＴ９４　菌株　＋　＋　＋　＋　＋　有动力　斜面和　Ｏ１５７　底层黄　阳性　色，　产　菌株　气、不产　硫化氢　＋　＋　＋　＋　＋　有动力　注：“一”代表阴性，“＋”代表阳性。　表２　ＯＮ　Ａ　Ｄ　ＰＧ　Ｈ　Ｌ　Ｄ　Ｃ　Ｏ　Ｄ　Ｃ　Ｃ　Ｉ　Ｔ　Ｈ　２　Ｓ　ＡＰＩ２０Ｅ生化反应结果　Ｕ　Ｒ　Ｅ　Ｔ　Ｄ　Ａ　Ｉ　Ｎ　Ｄ　Ｖ　Ｐ　Ｇ　Ｅ　Ｌ　Ｇ　Ｌ　Ｕ　Ｍ　Ａ　Ｎ　Ｉ　Ｎ　０　Ｓ　０　Ｒ　Ｒ　Ｈ　Ａ　Ｓ　Ａ　Ｃ　Ｍ　Ｅ　Ｌ　Ａ　Ｍ　Ｙ　Ａ　Ｒ　Ａ　０　Ｘ　ＰＴ９４菌株　＋　＋　＋　＋　＋　＋　＋　＋　＋　Ｏ１５７阳性菌株　＋　＋　＋　＋　＋　＋　＋　＋　＋　注：“一”代表阴性，“＋”代表阳性。　１．４．４血清学试验　用载玻片分别滴加两滴Ｏ１５７血清和Ｈ７血清，　将从上述标记ＰＴ９４的血平板上挑取纯化的菌落分　别和Ｏ１５７血清和Ｈ７血清混匀，查看凝集现象。　为：样品ＰＴ２８未检出大肠杆菌Ｏ１５７：Ｈ７；样品　ＰＴ９４检出大肠杆菌Ｏ１５７：Ｈ７。广东出入境检验检　疫局检验检疫技术中心对本实验室参加能力验证计　划结果评价：满意。　结果：Ｏ１５７血清凝集，Ｈ７血清凝集。符合大肠　杆菌Ｏ１５７：Ｈ７血清学特征。　注意：本试验采用血平板纯化菌落。而国标ＧＢ／Ｔ　４７８９．３６—２０ｏ８采用营养琼脂平板纯化菌落，两者纯化　３讨论　由于能力验证样品为冻干粉。因此，进行试验时　先用改良ＥＣ肉汤进行前增菌十分重要。若直接选　择生理盐水或者磷酸盐缓冲液增菌，可能不能很好　方式经过对比，笔者认为采用血平板纯化可疑菌落，　动力试验和血清学试验更容易观察和判断结果。　的激活待测菌株生物学特性，动力试验和血清学试　验容易造成误判，出现假阴性结果。　据报道，９８％以上的大肠杆菌０１５７：Ｈ７为不　发酵山梨醇，所以，用山梨醇麦康凯（下转第２１页）　一２结果　能力验证两份样品ＰＴ２８、ＰＴ９４，最后鉴定结论　３９—　员进一步测试，更换变压器或固态继电器。　现输出图表有规律性波动，则是热导池内有沾污，需　要将热导池内部使用乙醚清洗。　３．２仪器只检测出氮。氧未出峰　检查氧红外检测池输出。如没有输出或输出是　个很大的值，说明红外发射源已坏，需要更换新红　外发射源　４ｊ。　一４结论　综上所述。虽然脉冲加热惰气熔融红外吸收法　测定氧、热导法测定氮的方法已经非常成熟，但是实　际使用过程中，要保证钢中氧氮测定结果的准确性，　还必须在坩埚的选择和使用、分析功率、脱气功率、　载气的净化、比较器水平的选择、样品的制备等方面　严格控制，熟悉所用仪器，及时准确判断仪器状态及　３．３检出氮含量偏高　稀土氧化铜失效，造成有部分ＣＯ未被氧化，导　致其进入热导池，与Ｎ，一起被热导池检测。此时更　换稀土氧化铜即可。　氧化铜下方碱石棉及高氯酸镁失效，无法完全　吸收ｃＯ　及Ｈ　０，导致其与Ｎ　一起被热导池检测。　故障原因，对整个操作过程标准化，才能提高结果的　此时更换这两种试剂即可＿４］。　如果测量时还伴随着出峰拖尾的情况，此时需　要检查气体流量，一般是气路堵塞造成流量低，检查　次级过滤器、试剂管固定块、电磁阀等位置，发现堵　塞。清理后即可恢复正常。　３．４氮的精密度变差　由于氦气不纯导致氮的精密度变差的例子很　多．所以首先更换一瓶高纯氦气排除氦气不纯的　因素。　通过环境窗口检查氮热导池输出（ｍＶ），如发　（上接第３９页）　琼脂平板上初步分离大肠杆菌Ｏ１５７：Ｈ７，典型菌　落为不发酵山梨醇的圆形、光滑、较小的无色菌落，　中心呈现较暗的灰褐色；发酵山梨醇的菌落为红　色［５］。样品ＰＴ２８在山梨醇麦康凯琼脂平板的菌落　为红色．因此。可以初步判断样品ＰＴ２８为非大肠杆　菌Ｏ１５７：Ｈ７。所以。利用这一特性，在检验中可以　初步判断样品是否可疑菌株。　本次能力验证采用传统分离方法和ＡＰＩ２０Ｅ生　化鉴定系统相结合进行检测。结果准确和可靠。因　此．ＡＰＩ２０Ｅ生化鉴定系统不仅快速、简单，而且结果　准确性可靠。以传统分离鉴定方法为主，ＡＰＩ２０Ｅ生　化鉴定系统为辅，能得出准确地鉴定结果。　４小结　本次食品微生物能力验证试验中将可疑特征菌　落经过血平板培养．用ＡＰＩ２０Ｅ生化鉴定系统辅助　试验，有助于大肠杆菌０１５７：Ｈ７能力验证试验结　果的准确报告。　准确性　参考文献　［１］　宋卫良．冶金仪器分析［Ｍ］．北京：冶金工业出版　社．２００８　『２］　ＧＢ／Ｔ１１２６１—２００６钢铁氧含量的测定脉冲加热惰气　熔融一红外吸收法　［３］ＧＢ／Ｔ２０１２４—２００６钢铁氮含量的测定惰性气体熔融　热导法（常规方法）　［４］张之果，等．固体无机材料中气体成分（Ｏ、Ｎ、Ｈ）分析　技术［Ｍ］．北京：中国质检出版社，２０１３　参考文献　［１］王燕琴，朱建勇．肠出血性大肠杆菌Ｏ１５７：Ｈ７检测方　法研究进展［Ｊ］．内蒙古农业科技，２０１０（３）　［２］Ｒｉｌｅｙ　Ｌ　Ｗ，Ｒｅｍｉｓ　Ｒ　Ｓ，Ｈｅｌｇｅｒｓｏｎ　Ｓ　Ｄ，ｅｔ　ａ１．Ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ　ｃｏｌｉｔｉｓ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ａ　ｒａｒｅ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ　ｓｅｒｏｔｙｐｅ［Ｊ］．　Ｎ　Ｅｎｇｌ　Ｊ　Ｍｅｄ，１９８３，３０８（１２）　［３］金婷婷，马福金，袁耀武．免疫捕获ＬＡＭＰ法快速检测　大肠埃希氏Ｏ１５７：Ｈ７的研究［Ｊ］．食品科技，２０１３　（８）　［４］ＤＩＫＩＣＩｉ　Ａ，ＫＯＬＵＭＡＮ　Ａ，ＣＡＬＩＣＩＯＧＬＵ　Ｍ．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｏｆ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｍｉｌｄ　ｈｅａｔ　ｃｏｍｂｉｎｅｄ　ｗｉｔｈ　ｌａｃｔｉｃ　ａｃｉｄ　ｏｎ　Ｓｈｉｇａ　ｔｏｘｉｎ　ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ　Ｅｓｅｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｏ１５７：Ｈ７，Ｏ１０３，Ｏ１　１　１，　０１４５　ａｎｄ　０２６　ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ　ｔｏ　ｓｐｉｎａｃｈ　ａｎｄ　ｓｏｙｂｅａｒｌ　ｓｐｒｏｕｔ　［Ｊ］．Ｆｏｏｄ　Ｃｏｎｔｒｏｌ，２０１５，５０　［５］林彩华，蔡颖，曾梅锦，杨梓坚，陈冠武．能力验证试验　中大肠杆菌Ｏ１５７：Ｈ７的分离与鉴定［Ｊ］．中国卫生　检验杂志，２００８（１１）　『６１　ＧＢ／Ｔ　４７８９．３６—２００８食品卫生微生物学检验大肠埃　希氏菌Ｏ１５７：Ｈ７／ＮＭ检验　一２１—