IPTG诱导蛋白表达的原理及实验步骤

摘要：在原核蛋白表达体系中，如E.coli（大肠埃希菌）系统，外源基因通常需要诱导剂的诱导才能进行表达，本文详细讲述了常用诱导剂IPTG对外源蛋白诱导表达的原理以及实验步骤。原核生物绝大多数的基因按功能相关性成簇地排列，且密集于染色体上，共同形成一个转录单位——操纵子（元），也称基因表达的协同单位(acoordinatedunitofgeneexpression)。E.coli的乳糖操纵子（元）含Z、Y及A三个结构基因，分别编码β-半乳糖苷酶（β-galactosidase）、通透酶（permease）和乙酰基转移酶（transacetylase)；此外还有调控基因：操纵序列O（operator）、启动序列P（promoter）；而I(编码Lac阻遏物，Lacrepressor)不属于乳糖操纵子。乳糖操纵子结构基因Lac阻遏物是一种具有4个相同亚基的四级结构蛋白，都有一个与诱导剂结合的位点。在没有乳糖存在时，lac操纵子（元）处于阻遏状态，Lac阻遏物能与操纵基因O结合，阻碍RNA聚合酶与P序列结合，抑制转录起动。而当有诱导剂与阻遏蛋白结合后，其蛋白构象就发生变化，导致阻遏物从操纵基因O上解离下来，RNA聚合酶不再受阻碍，发生转录。在这个操纵子（元）体系中，真正的诱导剂并非乳糖本身。乳糖进入细胞，经β-半乳糖苷酶催化，转变为半乳糖——即生理上的诱导剂。而在实验中，通常选用异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）作为诱导剂，IPTG是一种作用极强的诱导剂，不被细菌代谢而十分稳定，因此被实验室广泛应用。网址：www.detaibio.com活性蛋白整体方案IPTG诱导表达原理图实验方法

材料

LB（Luria—Bertani）培养基酵母膏(Yeastextract)5g蛋白胨(Peptone)10gNaCl10g琼脂(Agar)1-2%蒸馏水(Distilledwater)1000mlpH7.02gIPTG溶于10mL蒸馏水中，0.22μm滤膜过滤除菌，分装成1mL/份，-20℃保存50mmol/LTris-CI(pH6.8)50mmol/LDTT2%SDS（电泳级）0.1％溴酚蓝10％甘油IPTG贮备液凝胶电泳加样缓冲液实验方案

1)2)3)4)用适当的限制性内切核酸酶消化载体DNA和目的基因；按连接步骤连接目的基因和载体，并转化到转化DH5α感受态细胞中；分别挑取单菌落接种于5mLLB(0.1g·L-1氨苄青霉素)中，37℃培养过夜；以2%体积比转接于2mlLB(0.1g·L-1氨苄青霉素)中，37℃继续培养2.5hr，至细菌对数生长期，加0.1网址：www.detaibio.com活性蛋白整体方案mmol/LIPTG2µl诱导3-4hr，同时设立不加IPTG诱导作为对照；5)取上述菌液1mL，12000rpm离心10min，收菌沉淀；6)重悬于冰的100µlPBS中，加入PMSF至终浓度为10mmol/L。震荡器震荡混匀，加入2×加样缓冲液，煮沸10min变性，12,000rpm离心10min；7)分别取诱导前和诱导后的样品10µl进行SDS-PAGE电泳分析。（PS：如果表达载体的原核启动子为PL启动子，则在30-32℃培养数小时，使培养液的OD600达0.4-0.6，迅速使温度升至42℃继续培养3-5h；如果表达载体的原核启动子为tac等，则37℃培养细菌数小时达到对数生长期后加IPTG至终浓度为1mmol/L，继续培养3-5h）网址：www.detaibio.com