生物技术论文

现代生命科学与生物技术

论文

学院： 自动化学院 姓名： 满德虎 专业： 检测技术与自动化装置 学号： 103120311 指导教师： 黄磊

现代生物技术在环境检测中的应用

满德虎

（天津理工大学自动化学院，检测技术与自动化装置，103120311） 摘要 介绍6种应用于环境检测的现代生物技术类型和技术原理。主要包括生物

酶技术，金标免疫速测技术，P C R 技术，生物发光检测技术。生物芯片技术和生物传感器。综述了国内外相关研究的进展。分析及探讨了这些技术的优点和存在的不足。现代生物技术 应用于环境检测 具有简单，快速，灵敏．原位，高通量的特点。有着诱人的应用前景。对环境保护具有深远的意义。

关键词：环境检测； 现代生物技术； 分析化学

1 引言

随着生命科学、环境、新材料等科学的发展，生物学、信息科学、计算机技术的引入， 环境污染分析手段 进入了一个新的发展阶段。分析研究对象越来越多地 选择了 DNA、 蛋白质、手性药物和环境毒物等与生命 活动相关的物质。 分析研究体系由简单转向复杂，分析研究层次进入了单细胞、单分子水平和立体构象，隶属于分析化学的环境检测与整个分析化学 的发展 趋势相一致。生物测定技术以其简单、 快速、灵敏 、特异性强、样品量少等优势而得到迅速发展， 应用生物 酶技术、免疫技术、P CR技术、生物荧光标记技术、芯片技术 、生物传感器等现代生物技术进行环境检测， 已经成为国内外科学工作者研究的热点。 本文介绍了6种现代生物技术在环境检测中的应用。 2 生物酶技术 2 .1 生物酶抑制技术

生物酶抑制技术是利用环境污染物，如农药、重金属等在体外对特定酶具有抑制作用的原理，加入该酶催化的底物( 显色剂 ) ，显色剂是否显色以及显色程 度反应了酶是否受抑制以及抑制的程度，以此来判断检测环境污染物是否存在以及含量的多少。

目前，国内外开发了建立在显色反应基础上的酶片、 酶标签等速测产品， 酶片便携、 易操作的优点，使其成为较好的农药在线检测技术 。美国堪萨斯一研 究 所 开 发 出一 种 称 为 农 药 检 测 器 的 “酶 标 签 ( Eng yme Ti e he t ) ， 这种酶标签对乙酰胆碱酯酶 ( Ac h E) 的抑制灵敏，可用于测定水中有机磷和氨基 甲酸酯类农药，检测限为 0 ．1 —1 0 mg／k g 。中国台湾农 业试验所郑允博士利用敏感的家蝇脑 Ac h E建立生 化法( 即酶法 ) ， 并研制出与此法相匹配的专用分光光度计、专用软件，用于测定蔬菜中的有机磷等剧毒农 药， 灵敏度为 mg ／ k g级。近来，上海交通大学、上海昆虫研究所研制出简易、快速检测有机磷农药的酶片和生色基质片，灵敏度为 0 ．1～1 0 mg

／k g 。

重金属对土壤酶( 脲酶 、 H： O：酶 、转化酶) 的活性 有一定的影响， 利用土壤酶对重金属的敏感性， 以酶 的各项 指标作为 重金属 的污染指数 是可行 的。 S i l 1 a n p 等报道了利用重金属与 E DT A或 DTP A 络合后对荧光酶的抑制作用，以荧光菌放射荧光强度大小检测土壤中的重金属。

随着酶源的开发新的酶源取材方便、制备容易廉价。基于酶抑制技术及其反应原理而发展起来的 固定化酶快速检测技术、生物传感器快速检测技术 、酶联免疫检测技术等也取得了飞速的发展。其中酶 固化技术不断提高，国际专利 Wo92／21779是一项采 用固定化 乙酰胆碱酯酶对农药残留快速测定的新技 术， 通过把酶固定在一种特殊的、 不会和其活性部位发生反应的载体上面，不仅可以排除杂质对酶活性的影响，使灵敏度提高 l 0 0倍 以上，而且还增加了酶的稳定性 。 2 ．2 酶免疫测定技术

酶免疫测定技术是生物酶技术 、免疫技术应用于 环境检测领域的一门新技术， 主要依据抗原和抗体之间的特异性反应来进行以环境污染物作为抗原，免疫动物获得特异性抗体，该抗体与抗原在动物体外也可以进行特异性的反应，引入一种酶作为示踪物，常用辣根过氧化物酶等 以揭示微量抗原与抗体的免疫学反应进行情况。其中酶联免疫吸附测定技术( E L I S A) 使用最广泛，它将具 高度特异性的抗原抗体反应结合酶对底物的高度催 化效应， 对受检样品中的酶标免疫反应的实验结果采 用现代光学分析仪器进行光度测定。 在 EL I S A检测 过程中， 酶催化具有高度的放大作用， 许多种酶分子 每分钟能催化生成 l 0 分子以上的产物， 使测定更为 灵敏 、准确，检测极限达 0 ．0 l～0 ．1 mg ／ k g。

目前，国内外已报道 了杀虫剂、杀菌剂 、除草剂等农药以及多氯联苯 、 抗菌素等污染物的酶联免疫分析方法，其中用于现场快速分析的酶联免疫试剂盒已商品化 。 Br u mme l 报道了一种光纤传感器， 该传感器以竞争性免疫为理论基础， 以荧光酶作底物， 对环戊二烯类杀虫剂的检测极限达 ／~ g ／k g级； Ha r r i s 介绍了抗体与大分子蛋白或微小的有机配体相络合用于对环境 中化妆品、食物中有机污染的检测 。

将 E LI S A应用于对特定微生物的跟踪检测和菌种的鉴定和量化， 其灵敏性可与 PC R技术相比，免疫荧光技术与激光共聚焦扫描相结合特别适用于对复 合的环境样品的检测。Hammock等报道了以竞 争性免疫技术和非竞争性免疫技术， 通过酶的级联放 大检测环境中高毒重金属汞、 铅、镉、生物污染物和其 他有害分子， 检测极限达 p g／k g级或 n g／k g级。 此外，上海交通大学以竞争性免疫为理论基础， 开发研制了 呋喃丹酶联免疫试剂盒用于检测蔬菜中的呋喃丹残留，此技术具有快速灵敏 、特异性强和适于现场大量 样品分析等优点。

3 金标免疫速测技术

速测试纸条技术是 2 0世纪 9 0年代以来在单克 隆技术、 胶体金免疫层析技术和新材料基础上发展起 来的一项新型速测技术。 将特异性的抗原( 或抗

体 ) 以 条带状固定于硝酸纤维素膜， 将胶体金标记试剂吸附到结合垫上， 当待测样品加到试纸条一端的样品垫 后， 通过毛细作用向前移动， 溶解 固化在结合垫上的 胶体金标记试剂后相互反应， 再移动至固定 的抗原 ( 或抗体 ) 的区域时， 待测物和金标试剂的复合物又与 之发生特异性结合而被截留， 聚集在检测带上， 通过 可 目测的胶体金标记物得到直观的显色结果。

目前， 该技术在医学检测和毒品检测中已得到广 泛应用 。 美国泛普公司毒 品类金标一步法快速检 测试条， 检测极限为 2 0 0 n g ／ mL。 国内报道了将该技术 应用于对环境中饲料添加剂残留、 牛奶中抗生素残留 进行检测的有关研究。 上海交通大学已将该技术成功 应用于农药的快速检测， 以竞争性免疫为理论基础， 用胶体金标记特异性抗体并固化在玻璃纤维上， 样品 中的农药与固化在硝酸纤维素膜上的抗原与胶体金 标记抗体竞争性的结合， 以固化抗原的检测点是否显 色及显色的深浅来判断是否有农药及农药的含量。 该 方法具有特异性强、 交叉反应极少、 稳定性高、 批内及 批问差异小、 结果判断明确 、 检测时间快的优点， 用于 环境检测， 其准确性和特异性与 EL I S A方法相同， 灵 敏度稍低，检测极限为 0 ．0l～0 ．2 5 mg ／ k g 。 但以胶体金 作为标记物代替酶， 降低了对温度的依赖性， 且操作 简便、 成本低廉， 特别适合对环境污染物的在线检测。 4 PCR技术

P C R技术( P o l y me r a s e C h a i n Re a c t i o n ) 即聚合 酶链式反应， 是在体外合成特异性 DNA片段的方法。 PCR技术的应用提高了在分子水平上分析 DNA 突 变的速度， 一般说来应用 P CR技术检测环境 中的生 物污染( 病原菌、 病毒及其他一些有害生物 ) ，主要包括模板核酸的提取， P CR扩增靶序列， PC R扩增产 物的检测与分析。 Ni e d r h a u s e r 利用 P CR技术检测 了食品中易导致人类脑膜炎的单核细胞生利斯特氏 菌，分析只需几个小时便可完成，大大缩短了分析周 期( 传统方法需 l 0 d) 。Ll o p等 利用 P CR技术检测 了植物中致病菌， 该方法与苯酚一氯仿标准检测方法 相 比更加灵敏， 对穗状 花序样品中致病菌的检 出达 l 0 一1 0 c f u ／ mL。 P CR技术的高灵敏度和专一性可用 于检测大量平行的样品，藉由 P CR和其他的已知方 法相结合扩增特定的基因序列，用于检测环境中有传 染性的寄生性孢菌 ； 不仅如此， P CR技术还可以跟 踪检测环境 中基因工程菌株， 测定基因表达和根据基 因序列的诊断来检测环境中的特异性种群。随着 P C R技术不断发展， 又相继建立了套式 P CR、 反向 P CR、 复式P CR等。 5 生物发光检测技术

自然界中许多生物具有发光现象，如细菌、 真菌 、昆虫等，发光菌是一类能运动的革兰氏阴性兼性厌氧 杆菌。 从环境 中选择 自身具有发射荧光特性的细菌作 为指示菌， 土壤中重金属的存在会影响该指示菌的生 理指标， 以其放射荧光的强度大小作为环境检测的指 标。 该发射荧光特性的细菌也可以用于对土壤中 樟脑球和其他混合毒物 的检测。

目前， 国外报道了以荧光细菌作为敏感材料的生 物传感器用于检测污泥中的重金属 Zn和 Cu， 结果 灵敏直观 。 在这些发光菌中催化生物发光反应的酶 称为荧光脂酶， 而编码荧光脂酶的生物发光基 因一 l u x基因已全部得

到克隆和表达。 一些细菌长期生 活在含某种化学物质的自然环境 中， 产生了适应现 象， 细菌基因组中含对该化学物具有特异性的诱导基 因及降解基 因。 将这些基因与 l u x基因融合构成重组 体， 在特异 的化学物存在时产生诱导作用， 启动诱导 基因并导致 l u x基 因表达。 构成的基因工程菌可用来 检测环境中存在的萘、 P CB、 汞、 苯系物 、 氮等特异的 化学污染物， 由重组体的发光与否就可得知某化学物 是否存在。 借助于适宜的载体将重组体导人宿主细 菌， 将荧光基 因作为一报告基因， 可将其导人应用基 因工程微生物中， 从而只需通过对光线的检测就可对 微生物在环境 中的生长、 活性 、 分布等进行实时在线 监测。 Gl o v e r将控制萤火虫荧光脂酶的 l u x基因与 淡水藻青菌基因融合， 通过在线监测藻青菌的发光强度快速检测环境中的除草剂。 与常规检测方法 比较， 生物发光检测技术灵敏度高、 特异性强、 检测快速方便。 如今生物发光检测技正与生物传感器技术、 细胞固定化技术以及计算机技术 紧密结 合，内容 逐步 完善 ，自动化水 平也 日提 高 。 6 生物芯片技术

生物芯片技术是 2 0世纪 9 0年代中期以来影响 最深远的重大科技进展之一， 其中基因芯片进行的表 达水平检测可 自动、 快速地检测出成千上万个基因的 表达情况。 在环境污染物的影响下， 敏感生物个体细 胞的基因表达丰度会发生相当程度的变化， 分析基 因 组 D NA中的变化序列以筛选出 DNA突变和多态性 变化， 寻找与正常表达的差异， 单独地或混合地确定毒物质对敏感生物基因水平上的影响以及影响的程度， 以此来检测环境中的污染物及其生物效应。

根据芯片上固定的样品探针不同， 生物芯片可分 为基因芯片、蛋白质芯片、 芯片、 组织芯片。上海交通 大学程金平、 王文华 通过分析即刻早期基因( I EG) 在甲基汞神经毒性机制中的作用， 得出即刻早期基因 能作为甲基汞神经毒性检测和评价的效应指标， 并指 出利用基因芯片技术能够初步筛选出甲基汞对大鼠 脑基因表达影响的相关基因。 F r i t z s c h e 用纳米金 标记 DNA-芯片检测环境中的污染物， 芯片耐用、 可 靠、具备更好的稳定性和专一性， 而且转化为光学信 号时受环境影响较小、易操作。此外， Ru d o l p h 报道 了一种新颖的可提供潜在的、 高通量信息的细胞芯片 和组织芯片， 与基因芯片和蛋白质芯片相比，可以提 供更多的、 复杂的应答信息， 为应用于环境检测提供了可能。

目前， 环境科学家已经意识到将生物芯片技术引 入环境科学研究中的重大意义：“环境基 因学”已成为 国外基 因学研究中的新概念和新方向，而生物芯片正 是研究“ 环境基因学” 的重要手段， 能快速反映环境因 素对人类基因的影响。 国内这方面的工作报导很少， 但科技部和国家 自然科学基金委都已经将此列为前 沿课题项目。 7 生物传感器

随着生物技术及 电子科技的迅速发展， 生物传感 技术已逐渐形成一个新兴的高科技领域 。 由于传感器 具有高度 自动化、 微型化与集成化的特点， 能提供有 效而快速的分析手段而代替传统的实验室技术， 从而 为生物医药 、 环境监测、食品工业等领域带来新的技 术革命 。近年来利甩生物传感器检测环境

中的污染 物，特别是用于现场检测 日益为人们所青睐。

生物传感器是由分子识别单元( 敏感材料 ) 和转 换器 2个部分构成， 以生物分子去识别被测 目标， 然 后通过信号系统将生物分子所发生的物理或化学变 化转化为相应的电信号予以输出放大， 从而得到检测 结果。根据敏感材料的不同相应地分为酶传感器 、微生物传感器、细胞传感器和免疫传感器。 在前述生物 酶技术 、免疫技术的基础上，将酶与底物或金标试纸 条显色反应的颜色深浅转化为电信号放大， 进一步缩 短 了检测时间，提高了灵敏度，具有成本低、操作简便 、测定速度快等优点。

Re s h e t i l o v 报道了生物化学传感器在环境检测中的应用。其中的电位型传感器， 根据离子选择性膜两边 电解质浓度或组成的差异所产生的电位差来测定物质浓度， 用固化酶的 p H 电极检测农药残留；安培型生物传感器是将生物酶固化到灵敏的感光膜上检测铵离子和尿素； 此外还介绍了以假单孢菌为指示的微生物传感器检测环境中残留的萘 、 联苯和安息香酸盐。 No g u e用一种固化了醛脱氢酶的酶传感器检测有机磷和氨基 甲酸酯农药， 其最小检 出量为9 ng ／ k g， 而传统方法的最小检 出量 为 40 0 ng ／ k g。T u r d e a n 开发出一种以固化酶抑制为基础的生物电极电流计。 电流计的针型生物电极由一个存在于用铂一铱金属丝分隔开的聚四氯乙烯中的空腔组成， 聚合体通过该空腔捕获乙酰胆碱酯酶， 该生物 电极可选择性地检测低浓度有机磷农药。Ki m 将荧光细胞与中国大颊鼠的卵细胞重组 的细胞序列( E F C一 5 0 0和 KF C— A1 0) 用于检测环境 中的丝裂霉素 C、Y一 射线、 2 、 2 一对羟苯基丙烷、 尼龙 降解物、 福美锌 、 甲基溴化物等通常对哺乳动物细胞 有害的毒物。 与经典的细菌传感器相比， 该方法对化 学药物的检测灵敏度提高了 2—5 0倍， 可以监测环境 中的毒物对哺乳动物 内分泌的影响。 S t e n g e r 将便 携的细胞传感器中活细胞的生理变化转化为电信号、 光学信号， 可适用于检测环境中的毒药、 病原体和其 他毒物， 并预测了随着功能基因工程和芯片技术的发 展， 细胞传感器将应用于环境毒物检测和评价等更宽 广的领域。 此外， 基于 PCR技术、 芯片技术制作的生 物传感芯片、 各种生化分析仪研制刚刚开始， 但以其 体积小 、 便于携带、 分析速度快、 准确灵敏等诸优点， 在生物技术应用于环境检测中将得到更快发展。 8 结语

迄今为止， 现代生物技术用于环境检测， 由于受 到生物材料和方法本身的限制， 都存在一定的局限 性。 如生物酶抑制技术保证了对污染物检测的特异性 和敏感性， 实现了在线单份样本检测， 但必须要求开 发廉价的酶源， 并有待进一步提高酶的固化技术； E LI S A的灵敏度相对其他方法较高， 但对温度的依赖 性强， 不便于在线检测； 金标试纸条的开发解决了这 个问题， 但同时该方法和 E LI S A一样受特异性强的 抗体的限制， 只能检测单一的污染物； 生物发光检测 技术受荧光生物体本身生理状况的限制较大而影响 方法的重复性； PCR、 芯片技术的应用在于它的信息 量远高于其他技术， 但这需要建立大量的有关毒理基因信息库。 依托以上技术， 便携、 灵敏、 快速、 稳定的生 物传感器是将来的发展趋势。 9 参考文献

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