第二章 真菌检验基本技术

意义：1、有诊断意义；2、代表组织相；3、判断某些真菌的致病性。 取材：皮屑：75%酒精消毒皮损 选皮损边缘、疤壁、脓液处 刮取皮屑 10%KOH涂片+沙保弱琼脂培养两周 甲屑：取病甲于正常甲交界处，贴近甲床部甲屑

10%~20%KOH溶液溶解标本，镜检 75%酒精浸泡干燥后，沙保弱琼脂（加放线菌酮及氯霉素）培养四周 染色方法:

1、革兰染色：各种真菌均为革兰阳性，深紫色

2、乳酸酚棉蓝染色：适用于各种真菌的直接检查、培养物涂片检查及小培养标本保存等。

3、墨汁染色：用于检查有荚膜的真菌，如新生隐球菌。

4、荧光染色:通常有三种染色方法：直接涂片染色、培养物涂片染色及组织切片染色。 常见深部真菌的荧光反应

菌种名称 白假丝酵母菌 新生隐球菌 组织胞浆菌 曲霉 皮炎芽生菌 荧光反应 黄绿色 红色 红黄色 绿色 黄绿色 5、糖原染色：原理是真菌细胞壁由纤维素和几丁质组成，含有多糖。染色后真菌及组织内的多糖成分均为红色，核为蓝色，背景为淡绿色。 6、其他:瑞氏染色法，常用于组织或骨髓标本中组织胞浆菌和马尔尼菲青霉菌等真菌的检查。嗜银染色法（GMS法）。黏蛋白-卡红（MCS）染色法用于新生隐球菌的鉴别。 二、培养与鉴定技术 常用真菌培养基及用途

培养基名称 沙保弱培养基 常规培养 放线菌酮-氯霉素琼脂 玉米粉聚山梨脂-80琼脂 马铃薯葡萄糖琼脂 尿素琼脂 （红色廯菌和石膏样廯菌） 心脑浸液葡萄糖血琼脂 深部真菌培养 念珠菌菌种鉴定 白色念珠菌 念珠菌显色培养基 克柔念珠菌 热带念珠菌 其他不产色素 培养方法：

1、试管培养法：一般用于菌种穿戴接种于保存。不易污染。

绿色 粉色 蓝色 白色 观察白假丝酵母菌的厚膜孢子 观察真菌菌落色素，用于鉴别 用生化反应鉴别真菌 培养基用途 2、大培养法：易污染，对球孢子菌、组织胞浆菌等传染性强的真菌培养不合适。

3、小培养法：是观察真菌结构及生长发育的有效方法。分为玻片培养、小型盖片直接培养法及琼脂方块培养法。

生长现象：生长速度、菌落大小、表面形态、菌落性质、菌落颜色、菌落边缘、菌落底部。 鉴定试验

1、毛发穿孔试验：石膏样小孢子菌穿孔试验阳性，红色毛癣菌穿孔试验阴性。 2、明胶液化试验

3、芽管形成试验：试验要设阳性（白假丝酵母菌）和阴性对照（热带假丝酵母菌），并注意控制培养时间。

4、厚膜孢子形成试验：白假丝酵母菌在Tween-80培养基上能产生厚膜孢子。

5、酚氧化酶试验：此酶为新生隐球菌所特有。用已知新生隐球菌和浅白隐球菌分别做阳性和阴性对照。

6、脲酶试验：石膏样癣菌、狗小孢子菌、新生隐球菌产生脲酶。 7、糖同化或发酵试验：发酵试验是检测真菌最常用的生化试验。同化试验原理是某些真菌在不含碳源而仅含氮源的合成固体培养基上不生长。 药物敏感试验:

目的：1、提供两种以上有相当活性的、敏感的抗真菌药物；2、检测

体内药物活性，预测治疗效果；3、监控耐药性菌株的发生；4、预期抗真菌药物的治疗效能和抗真菌药物的研发。

推荐抗真菌药物敏感试验的方法有：稀释法、纸片扩散法。 三、其他非培养检验技术

免疫学检验技术：皮肤试验、血清学测定

隐球菌乳胶抗原凝集试验：1、99%中枢神经系统感染患者阳性；2、早期、快速检测隐球菌病；3、滴度可反应治疗效果及预后。 分子生物学检验技术

G试验和GM试验：G试验可早期诊断多种临床常见的侵袭性真菌感染疾病，但不能用于检测隐球菌和接合菌感染。GM试验能够作为侵袭性曲霉菌感染的早期依据。