质粒提取试剂配制和操作步骤
试剂配制(小量）
1. 1M（M代表摩尔浓度即mol∕L)NaOH （400ml ）： 分子量为40，秤取16g NaOH, 溶于400ml DDW中。
2. 2M Tris—HCl （500ml）： 分子量为121.14, 秤取121.14g Tris，放入干净的500ml烧杯中，加400 ml DDW，置于搅拌器上搅拌溶解,用HCl调节pH值为8.0（首先直接加12M的浓盐酸约20ml，接近8。0时再用1M HCl 调节)， 定容至500ml，4℃保存。
3. 10%SDS (200ml）： 称量20gSDS，放入干净的烧杯中，加100 ml DDW，定容到200ml,室温保存。（SDS具有较强的刺激性，称量时一定带好口罩，动作轻柔）。
4。 Buffer P1 (500ml): 用50ml离心管量取10ml 0。5M的EDTA，然后量取12。5ml 2M 的Tris-HCl,放入干净的烧杯中,加入300ml DDW，置于搅拌器上搅拌溶解，用HCl调节pH值为8。0（大约加12M的浓盐酸1ml ），定容至500ml，4℃保存。
5. Buffer P2（100ml): 20ml 1M NaOH和10ml 10％SDS放入200ml的玻璃瓶中,然后加入70ml DDW，混匀，室温放置过夜，使其自溶，最后室温保存.(注：不需要定容,严格按步骤操作)。
6. Buffer P3 (500ml） ： 秤取147.21g乙酸钾，溶于300ml DDW中，置于搅拌器上搅拌溶解，用冰醋酸调节pH值为5.5，（约加80–100ml冰醋酸）， 定容至500ml，
4℃保存.
7. Buffer QBT（500ml）:分别称取NaCl 21。915g, MoPS 5。23g， 放于干净的500ml烧杯中，加入300ml DDW,置于搅拌器上搅拌溶解，用1M NaOH调节pH值为7。0(约加10–15ml NaOH),然后加入75ml 异丙醇,定容至500ml，4℃保存。
8. Buffer QC（500ml）：分别称取NaCl 29.22g, MoPS 5.23g，放于干净的500ml烧杯中，加入300ml DDW，置于搅拌器上搅拌溶解,用1M NaOH调节pH值为7.0（约加9ml NaOH,然后加入75ml 异丙醇,定容至500ml，4℃保存。
9。 Buffer QF(500ml）:称取NaCl 36.525g， 量取2M Tris-HCl 12.5ml，放于干净的500ml烧杯中,加入300ml DDW，置于搅拌器上搅拌溶解,用1M NaOH调节pH值为8。5 (约加0。1ml NaOH），然后加入75ml异丙醇，定容至500ml ，4℃保存。
10. 配制RNase:
（1) 将RNase粉末溶于10mM的乙酸钾（即Buffer P3），配制成浓度为10mg/ml的溶液。
（2) 将配好的RNase溶液100℃加热10min, 随后冷却至室温。
（3） 用1M 的Tris—HCl调节pH值至7。4，大约需要0。1体积的Tris-HCl。
(4) 分装RNase溶液于1。5ml EP管中,-20℃保存.
试剂配制（大量)
1. 1M NaOH (400ml )： 分子量为40，秤取16g NaOH， 溶于400ml DDW中。
2。 2M Tris—HCl （500ml): 分子量为121。14， 秤取121.14g Tris，溶于400 ml DDW中，用HCl调节pH值为8.0， 定容至500ml。
3。 Buffer P2（1000ml)： 称取10g SDS, 放入1000ml的玻璃瓶中,然后加入750ml DDW，最后加入200 ml 1M的NaOH，混匀，室温放置过夜，使其自溶.(注：不需要定容,严格按步骤操作。)
4. Buffer P1 （1000ml）： 用50ml离心管量取20ml 0.5M的EDTA，然后量取25ml 2M 的Tris—HCl，加入700ml DDW， 用HCl调节pH值为8。0，定容至1000ml。
5. Buffer P3 (1000ml） ： 秤取294。42g乙酸钾，溶于800ml DDW中，用冰醋酸调节pH值为5。5，定容至1000ml。
6。 Buffer QBT(1000ml）：分别称取NaCl 43。83g， MoPS 10.46g, 加入600ml DDW, 用NaOH调节pH值为7.0，然后加入150ml 异丙醇，定容至1000ml。
7。 Buffer QC（1000ml)：分别称取NaCl 58.44g， MoPS 10。46g， 加入600ml DDW, 用NaOH调节pH值为7。0，然后加入150ml 异丙醇,定容至1000ml。
8。 Buffer QF（1000ml)：称取NaCl 73。05g， 量取2M Tris—HCl 25ml， 加入800ml DDW,用NaOH调节pH值为8。5，然后加入150ml 异丙醇,定容至1000ml。
9。 配制RNase:
（1) 将RNase粉末溶于10mM的乙酸钾（即Buffer P3)，配制成浓度为10mg/ml的溶液。
（2) 将配好的RNase溶液100℃加热10min， 随后冷却至室温。
（3） 用1M 的Tris—HCl调节pH值至7。4，大约需要0。1体积的Tris—HCl.
(4) 分装RNase溶液于1.5ml EP管中，—20℃保存。
操作步骤
准备工作：
• 大提质粒的前两天用50ml离心管摇菌，在5-7ml加有氨苄抗生素AMP的LB液体培养基中挑菌，37℃下摇菌12—16h。
• 大提质粒前一天将50ml离心管摇好的菌液500ml大三角瓶中加入含有氨苄抗生素AMP的LB液体培养基200ml，37℃下摇菌12—16h。
1。 沉淀菌液：向离心机配套的50 ml离心管中，加入30 ml菌液，6000 g离心10min, 大约沉淀菌液200 ml。(注意：配平离心管，离心时要在离心管壁和盖上都做好标记，且离心时写字的管壁侧朝向外,以便容易找到沉淀物)。离好一管，取回弃去上液保留沉淀物，再反复离心直到所有200ml菌液全部离完),打开盖倒置吸水纸上控干。
2。 溶解沉淀： 量取10 ml Buffer P1， 加入100μl RNase A, 混匀后,加入到离心沉淀的菌中，用振荡器充分溶解菌液沉淀（可用15ml离心管量取, Buffer P1 加入沉
淀离心管是管口不要接触，以防互相污染).
3. 加入10 ml Buffer P2，液体呈现蓝色，轻轻混匀,使其充分反应，冰上放置2-3min即可。（此步主要是碱裂解细菌，使其中的蛋白质和DNA变性，反应时间不能太长,否则容易使大肠杆菌的基因组DNA断裂成小片段，污染质粒DNA)
4。 加入10 ml 预冷的Buffer P3,轻轻颠倒混匀，直到蓝色全部消失，出现白色蛋白沉淀,冰上放置20min。（此步发生酸碱中和反应，pH值降低，使变性的DNA双链结构恢复，其中的SDS可以充分与蛋白质结合，使其析出）
5. 20 min后，6000 g 4℃离心25min。同时,向柱子中加入5ml Buffer QBT，使其全部流过柱子，平衡柱子。如果是重复使用的柱子，先使其中的HCl全部流尽，然后加满DDW清洗2遍柱子，最后再加入Buffer QBT平衡柱子。
6。 剪一小块纱布，折叠4层，放于柱子上部。将离心后的液体缓慢倒入纱布中，最后挤压纱布使其中的液体全部直接过滤到柱子中，使其充分流过柱子。(如果此步不只1个质粒时，挤压不同质粒的纱布时，一定要换手套，避免污染质粒）
7. 清洗柱子: 液体全部流过柱子后，向柱子中直接加满Buffer QC，使其全部流过柱子，清洗2遍，弃去废液。
8. 洗脱质粒: 向柱子中加15ml Buffer QF，靠重力作用使其全部通过柱子，收集洗脱液。（注：要收集到一个新的管中）
9。 沉淀质粒：向收集的液体中，加入0。7倍体积（即10。5 ml)异丙醇，轻轻混
匀,6000 g 4℃离心25 min。(异丙醇可以充分沉淀质粒，但同时会沉淀很多盐分）
10。 清洗质粒:离心后，注意质粒贴壁的方向,应从其侧面倒掉废液。然后加入10 ml 70％的乙醇，轻轻晃动（不能用枪吹散，否则会损失很多质粒).
11. 沉淀质粒：6000 g 4℃离心10min,轻轻吸弃废液，将质粒开盖晾置，使乙醇充分会发.（质粒中的乙醇会影响后续反应中的酶活性）
12. 溶解质粒：用300ulDDW或TE溶解步骤11中的质粒，转移到新的1.5mlEP管中,做好标记,检测浓度。
13。 柱子回收：
（1) 先用自来水冲洗柱子内外；
(2) 再用蒸馏水和DDW冲洗柱子内外，最后加满DDW，使其全部通过柱子，清洗2次。
（3) 向柱子中加满1 M HCl，柱子底部盖上盖子，顶部用封口膜封上，室温放置过夜。（HCl可充分降解DNA）
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