异种肝前体细胞移植治疗急性肝损伤大鼠

中国组织工程研究笫仃眷第５３期２０１３—１２—３１出版　～ｃ一。　Ｃｈｉｎｅｓｅ　ＪｏｕｒｎａｌｏｆＴｉｓｓｕｅ　Ｅｎｇ￣ｅｅｒｉｎｇ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｄｅｃｅｍｂｅｒ３１，２０１３　ＶｏＬ　７　７，Ｎｏ　５３　ｄｏｉ：ｌＯ．３９６ｅｌｉ．ｉｓｓｎ．２０９５—４３４４，２０１３．５３．００６　ｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｒｔｅｒ．ｏｒｇ］　力真．张晓嘲．郑幸龙．－５锋．马佳　向俊西．王浩华．昌毅　异种释前体细胞移植治疗急性爵损伤大鼠　中国组织Ｉ程研究，２ｏ１３，’７（５３）．＇９１３２—９１３８　异种肝前体细胞移植治疗急性肝损伤大鼠水术☆　万真’　，张晓刚’。～，郑幸龙’～，马锋’～，马佳’＇２向俊西　２　壬浩华“２　吕　毅　（’西安交通大学第一附属医院肝胆外科　７１００６１）　陕西省西安市７１００６１；　西安交通大学先进外科技术与工程研究所，陕西省西安市文章亮点：　１实验行异种肝前体细胞移植，就其治疗急性肝损伤的作用，及移植细胞在大鼠脾脏内的植入和肝细胞　万真☆，男，１９８５年生，　江西省南昌市人，汉族，　分化做一探索。　２发现异种肝前体细胞移植能改善肝功能，促进肝细胞修复，移植的异种肝前体细胞能有效植入脾脏实　质，并在脾脏微环境调控下向肝细胞分化。　关键词：　器官移植；细胞移植；肝移植；急性肝损伤；分化；植入；肝前体细胞；脾脏；ＡＩｂ；ＣＫ－１　９；异种；微环境；　国家自然科学基金　主题词：　西安交通大学医学部在读　博士，主要从事肝干细胞　和肝再生的研究。　细胞移植；脾；成体干细胞；细胞分化；细胞，培养的；四氯化碳　基金资助：　通讯作者：吕毅，博士，　教授，博士生导师，西安　交通大学第一附属医院肝　胆外科，陕西省西安市　７１００６１：西安交通大学先　进外科技术与工程研究　所，陕西省西安市　７１００６１　国家自然科学基金（３０６００５７５￣３０８３００９９）资助料　摘要　背景：成体肝前体细胞可在受体肝脏内定植并分化为肝细胞。不过，异种肝前体细胞移植能否促进急性肝损　ｌｕｙｉ１６９＠１２６．ｃｏｍ　中图分类号：Ｒ３１８　文献标识码：Ａ　文章编号：２０９５－４３４４　伤的恢复，脾脏微环境能否促进移植物的存活和向肝细胞分化，尚没有研究。　目的：评价异种肝前体细胞移植治疗急性肝损伤的作用：监测移植肝前体细胞在大鼠脾脏实质内的定植及向　肝细胞的分化。　方法：体外培养雄性小鼠来源的肝前体细胞系肝上皮样前体细胞。通过ＣＣＩ４腹腔注射联合２／３肝切除构建急　（２０１３）５３－０９１３２・０７　修回日期：２０１３－０９－２４　性肝损伤大鼠模型，进行肝上皮样前体细胞脾脏移植。在肝切除后１，５，１４和２１　ｄ，苏木精一伊红染色观察　肝脏病理改变，全自动生化分析仪监测血清转氨酶变化，ＰＣＲ反应检测脾脏组织Ｙ染色体特异性序列Ｓｒｙ，　脾脏ＣＫ．１９和ＡＩｂ免疫组织化学追踪移植肝上皮样前体细胞的植入和肝细胞分化。　结果与结论：肝上皮样前体细胞可在体外长期培养，保持增殖能力和双向分化潜能。肝上皮样前体细胞脾脏移植　后，肝损伤大鼠肝细胞肿胀明显减轻，丙氨酸转氨酶和天门冬氨酸转氨酶下降更明显。移植后１，５，１４和２１　ｄ，　脾脏ＤＮＡ中均能检测到Ｓｒｙ序列。在整个实验期间ＣＫ－１９阳性细胞在大鼠脾脏实质内始终存在。ＡＩｂ阳性细胞　在移植后５　ｄ在脾脏实质中出现，随后阳性细胞数逐渐增多。实验表明，移植肝前体细胞能在大鼠脾脏实质中植　入，并分化为肝细胞，能有效促进ＣＣＩ４腹腔注射联合２／３肝切除诱导的大鼠急性肝损伤的修复过程。　Ｉｎｔｒａｓｐｌｅｎｉｃ　ｄｅｌｉｖｅｒｙ　ｏｆ　ｘｅｎｏｇｅｎｅｉｃ　ｈｅｐａｔｉｃ　ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ　ｃｅｌｌｓ　ａｍｅｌｉｏｒａｔｅｓ　ａｃｕｔｅ　ｌｉｖｅｒ　（２０１　３０８０３２／ＭＷＪ’　Ｗａｎ　Ｚｈｅｎ☆，Ｓｔｕｄｙｉｎｇ　ｆｏｒ　ｄｏｃｔｏｒａｔｅ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｈｅｐａｔｏｂｉｌｉａｒｙ　Ｓｕｒｇｅｒｙ．Ｆｉｒｓｔ　Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ　ｏｆ　Ｘｉ’ａｎ　Ｊｉａｏｔｏｎｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｘｉ’ａｎ　７１００６１　Ｓｈａａｎｘｉ　Ｐｒｏｖｉｎｃｅ　Ｃｈｉｎａ；ｌｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｓｕｒｇｅｒｙ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　ｉｎｊｕｒｙ　ｉｎ　ｒａｔｓ　Ｗａｎ　Ｚｈｅｎ　２Ｚｈａｎｇ　Ｘｉａｏ．ｇａｎｇ　２Ｚｈｅｎｇ　Ｘｉｎｇ．１ｏｎｇ　２Ｍａ　Ｆｅｎｇ　２Ｍａ　Ｊｉａ　２Ｘｉａｎｇ　Ｊｕｎ－ｘｉ　２，Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｘｉ’ａｎ　Ｊｉａｏｔｏｎｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｘｉ’ａｎ　７１００６１，　Ｓｈａａｎｘｉ　Ｐｒｏｖｉｎｃｅ，Ｃｈｉｎａ　，，，，，　Ｗａｎｇ　Ｈａｏ．ｈｕａ　２ＬＱ　Ｙｉ’’　（’Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｈｅｐａｔｏｂｉｌｉａｒｙ　Ｓｕｒｇｅｒｙ，Ｆｉｒｓｔ　Ａｆｉｌｆｉａｔｅｄ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ　ｏｆ　Ｘｉ’ａｎ　Ｊｉａｏｔｏｎｇ　，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｘｉ’ａｎ　７１　００６１，Ｓｈａａｎｘｉ　Ｐｒｏｖｉｎｃｅ，Ｃｈｉｎａ；　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｓｕｒｇｅｒｙ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｘｉ’ａｎ　Ｊｉａｏｔｏｎｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｘｉ’ａｎ　７１　００６１，Ｓｈａａｎｘｉ　Ｐｒｏｖｉｎｃｅ，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ　ＢＡＣＫＧＲ０ＵＮＤ：Ａｄｕｌｔ　ｈｅｐａｔｉｃ　ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ　ｃｅｌｌｓ　ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ　ｉｎｔｏ　ｔｈｅ　Ｉｉｖｅｒ　ｃａｎ　ｅｎｇｒａｆｔ　ａｎｄ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｌａｔｅ　ｉｎｔｏ　ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ．Ｈｏｗｅｖｅｒ，Ｉｉｔｔｌｅ　ｅｖｉｄｅｎｃｅ　ｗａｓ　ａｖａｉｌａｂｌｅ　ｃｏｎｃｅｒｎｉｎｇ　ｗｈｅｔｈｅｒ　ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｃ　ｈｅｐａｔｉｃ　ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ　ｃｅｌｌｓ　ｃａｎ　ｐｒｏｍｏｔｅ　ｔｈｅ　ｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｃｕｔｅ　Ｉｉｖｅｒ　ｄａｍａｇｅ，ａｎｄ　ｗｈｅｔｈｅｒ　ｔｈｅ　ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ　ｏｆ　ｓｐｌｅｅｎ　ｃａｎ　ｐｒｏｍｏｔｅ　ｔｈｅ　Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ　ａｕｔｈｏｒ：Ｌ０　Ｐｈ　Ｄ，Ｐｒｏｆｅｓｓｏｒ，Ｄｏｃｔｏｒａｌ　ｓｕｐｅｒｖｉｓｏｒ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｈｅｐａｔｏｂｉｌｉａｒｙ　Ｓｕｒｇｅｒｙ，Ｆｉｒｓｔ　Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ　ｏｆ　Ｘｉ’ａｎ　Ｊｉａｏｔｏｎｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ．Ｘｉ。ａｎ　７１００６１，Ｓｈａａｎｘｉ　Ｐｒｏｖｉｎｃｅ，　ｇｒａｆｔ　ｓｕｒｖｉｖａＩ　ａｎｄ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｉｎｔｏ　ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ．　Ｃｈｉｎａ：Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｓｕｒｇｅｒｙ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｘｉ’ａｎ　Ｊｉａｏｔｏｎｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｘｉ’ａｎ　７１００６１，　Ｓｈａａｎｘｉ　Ｐｒｏｖｉｎｃｅ，Ｃｈｉｎａ　０ＢＪＥＣＴＩＶＥ：Ｔｏ　ｅｖａｌｕａｔｅ　ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｈｅｐａｔｉｃ　ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ　ｃｅｌＩ　ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ　ｏｎ　ａｃｕｔｅ　Ｉｉｖｅｒ　ｉｎｊｕｒｙ　ａｎｄ　ｍｏｎｉｔｏｒ　ｔｈｅ　ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ　ａｎｄ　ｈｅｐａｔｏｃｙｔｉｃ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ　ｈｅｐａｔｉｃ　ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｓｐｌｅｎｉｃ　ｐａｒｅｎｃｈｙｍａ．　ＭＥＴＨＯＤＳ：Ａｄｕｌｔ　ｍｏｕｓｅ　ｄｅｒｉｖｅｄ　ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅ　ｌｉｖｅｒ　ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ　ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ　ｃｅｌｌｓ　ｗｅｒｅ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　Ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｆｏｒ　ｌｏｎｇ　ｔｅｒｍ．Ｔｈｅ　ａｃｕｔｅ　Ｉｉｖｅｒ　ｕｒｙ　ｍｏｄｅ１　ｗａｓ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ　ｂｙ　ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ　ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ＣＣＩ４　ｉｎ　ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　２／３　ｐａｒｔｉａｌ　ｈｅｐａｔｅｃｔｏｍｙ，ｆｏｒ　ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｌｉｖｅｒ　ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ　ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ　ｃｅｌｌｓ．Ｔｈｅ　ｌｉｖｅｒ　ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ　ｃｈａｎｇｅｓ　ｗｅｒｅ　ｏｂｓｅｒｖｅｄ　ｂｙ　ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ．ｅｏｓｉｎ　ｓｔａｉｎｉｎｇ　ａｔ　１．５．１４　ａｎｄ　２１　ｄａｙｓ　ａｆｔｅｒ　ｈｅｐａｔｅｃｔｏｍｙ．Ｓｅｒｕｍ　ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ　Ｉｅｖｅｌｓ　ｌｕｙｉ１６９＠１２６　ｃｏｍ　Ａｃｃｅｐｔｅｄ：２０１３－０９－２４　ｗｅｒｅ　ｍｏｎｉｔｏｒｅｄ　ｕｓｉｎｇ　ａｕｔｏｍａｔｉｃ　ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎａｌｙｚｅｒ．Ｔｈｅ　Ｓｒｙ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｓｐｌｅｅｎｓ　ｗａｓ　ｔｅｓｔｅｄ　ｂｙ　ＰＣＲ．　９１３２　户Ｏ　Ｂｏｘ　１２００，Ｓｈｅｎｙａｎｇ　１１０００４　ｗｗｗ，ＣＲＴＥＲ．ｏｒｇ　万真．等　异种醉裁傅细匏移植治疗急性醉损伤天鼠　ＷＶＶ￣／．ＣＲＴＥＲ．ｏｒｇ　Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｌｒｖ　ｓｔａｉｎｉｎｇ　ａｇａｉｎｓｔ　ＣＫ．１　９　ａｎｄ　ＡＩｂ　ｗａｓ　ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ　ｔｏ　ａｎａｌｙｚｅ　ｔｈｅ　ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ　ａｎｄ　ｈｅｐａｔｏｃｙｔｉｃ　ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ　ｈｅｐａｔｉｃ　ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ　ｃｅｌｌｓ　ｊｎ　ｔｈｅ　ｓｐｌｅｎｉｃ　ｐａｒｅｎｃｈｙｍａ．　ＲＥＳＵＬＴＳ　ＡＮＤ　Ｃ０ＮＣＬＵＳ１０Ｎ：Ｌｉｖｅｒ　ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ　ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ　ｃｅｌｌｓ　ｍａｉｎｔａｉｎｅｄ　ｎｏｒｍａｌ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｂｉｐｏｔｅｎｔｉａＩ　ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｃａｐ￣ｃｉｔｙ　ａｆｔｅｒ　ｌｏｎｇ—ｔｅｒｍ　ｃｕｌｔｕｒｅ／ｎ　ｖｉｔｒｏ．Ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｍｏｄｅＩ　ｇｒｏｕｐ．ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ　ｅｄｅｍａ　ｗａｓ　ａｌｌｅｖｉａｔｅｄ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ．ａｎｄ　ｓｅｒｕｍ　ａｌａｎｉｎｅ　ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ　ａｎｄ　ａｓｐａｒｔｉｃ　ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ　ｌｅｖｅｌｓ　ｗｅｒｅ　ｄｅｃｒｅａｓｅｄ　ｒｅｍａｒｋａｂｌｙ　ａｆｔｅｒ　ｃｅｌＩ　ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ　ｇｒｏｕｐ．Ｔｈｅ　Ｓｒｙ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｗａｓ　ｔｅｓｔｅｄ　ｉｎ　ｓｐｌｅｅｎ　ＤＮＡｓ　ａｔ　１．５．１　４　ａｎｄ　２１　ｄａｙｓ　ｐｏｓｔ．ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．　ＣＫ－１　９　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｃｅｌｌｓ　ｅｘｉｓｔｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｓｐｌｅｎｉｃ　ｐａｒｅｎｃｈｙｍａ　ｔｈｒｏｕｇｈｏｕｔ　ｔｈｅ　ｓｔｕｄｙ　ｐｅｒｉｏｄ．ＡＩｂ．ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｃｅｌｌｓ　ｅｍｅｒｇｅｄ　ａｔ　５　ｄａｙｓ　ｐＯｓｔ－ｔｒａｎｓｐＩａｎｔａｔｉＯｎ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｎｕｍｂｅｒ　ｏｆ　ＡＩｂ—ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｃｅｌｌｓ　ｗａｓ　ｇｒａｄｕａｌｌｙ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ｏｖｅｒ　ｔｉｍｅ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗ　ｔｈａｔ　ｈｅｐａｔｉｃ　ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ　ｅｃｌｌｓ　ｅｎｇｒａｆｔ　ａｎｄ　ｄｉｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ　ｉｎｔｏ　ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ　ｉｎ　ｒａｔ　ｓｐｌｅｎｉｃ　ｐａｒｅｎｃｈｙｍａ　ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ。ａｎｄ　ｔｈｅ　ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉＯｎ　ｃａｎ　ｐｒｏｍｏｔｅ　ｔｈｅ　ｒｅｃｏｖｅｒｙ　ｐｒｏｃｅｓｓ　ｆｒｏｍ　ＣＣＩｄｐａｒｔｉａＩ　ｈｅｐａｔｅｃｔｏｍｙ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ａｃｕｔｅ　ｌｉｖｅｒ　ｉｎｊｕｒｙ．　Ｓｕｂｊｅｃｔ　ｈｅａｄｉｎｇｓ：ｃｅｌｌ　ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ；ｓｐｌｅｅｎ；ａｄｕｌｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ；ｃｅｌｌ　ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ；ｃｅｌｌｓ，ｃｕｌｔｕｒｅｄ；ｃａｒｂｏｎ　ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｉｄｅ　Ｆｕｎｄｉｎｇ：Ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｎａｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃｈｉｎａ，Ｎｏ．３０６００５７５　，３０８３００９９　Ｗａｎ　Ｚ，Ｚｈａｎｇ　ＸＧ，Ｚｈｅｎｇ　ＸＬ，Ｍａ　Ｆ，Ｍａ　Ｊ，Ｘｉａｎｇ　ＪＸ，Ｗａｎｇ　ＨＨ，Ｌ０　Ｙ．Ｉｎｔｒａｓｐｌｅｎｉｃ　ｄｅｌｉｖｅｒｙ　ｏｆ　ｘｅｎｏｇｅｎｅｉｃ　ｈｅｐａｔｉｃ　ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ　ｃｅｌｌｓ　ａｍｅｌｉｏｒａｔｅｓ　ａｃｕｔｅ　ｌｉｖｅｒ　ｉｎｊｕｒｙ　ｉｎ　ｒａｔｓ．Ｚｈｏｎｇｇｕｏ　Ｚｕｚｈｉ　Ｇｏｎｇｃｈｅｎｇ　Ｙａｎｊｉｕ．２０１３；１７（５３）：９１３２－９１３８　时间及地点：实验于２０１２年７至１２月在西安交通大　０　引言Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　学医学部实验动物中心完成。　材料：　急性肝功能损伤多由乙肝病毒感　Ｊ、酒精或药物　实验动物：健康清洁级８－１０周雌性ＳＤ大鼠，体质量　中毒等引起【ｚ＿Ｊ＿Ｊ，是临床常见的问题。肝功能在短期内急　２００—３００　ｇ，由西安交通大学医学部实验动物中心提供，　剧恶化，肝脏再生受抑制，可进展至急性肝衰竭，并伴　实验动物生产许可证号：ＳＣＸＫ（陕）２００７．００１。在１２　ｈ　发脑水肿、败血症而导致死亡【４Ｊ。当肝细胞增殖受抑制　白天／１　２　ｈ晚上更替的清洁环境下饲养，自由进食水、饲　时，肝前体细胞活化增殖，并进一步分化为肝细胞和胆　料，环境温度维持在２５℃左右。　管上皮细胞修复受损肝脏Ｉ。Ｊ，提示可移植肝前体细胞治　细胞：肝前体细胞株肝上皮样前体细胞，从倒千里光　疗急性肝损伤。移植的肝前体细胞能在受体内定植并　碱腹腔注射联合２／３肝切除处理的小鼠肝脏中分离得到，　分化为肝细胞　Ｊ，这可能改善肝功能，缓解急性肝功　能在体外培养条件下诱导分化为肝细胞和胆管上皮细　能损伤　Ｊ。肝前体细胞增殖能力较强，呈现双向分化　胞，由解放军第二军医大学细胞生物学教研室提供【．　。　潜能，而且直径较小，仅是成熟肝细胞的１／３－１／２，能　肝前体细胞异种移植治疗大鼠急性肝损伤研究的主要试　促进植入过程　ⅢＪ。此外，近年来肝前体细胞的分离　剂及仪器：　纯化，表型鉴定方面的研究进展迅速，为移植应用奠　定了基础　。　。。　’引。肝前体细胞移植治疗急性肝功能损伤应　试剂及仪器　来源　用前景广阔，值得广泛研究。　胎牛血清　美国Ｈｙｃｌｏｎｅ公司　脾脏是理想的细胞移植部位。经脾内注射的移植细　组织基因组ＤＮＡ提取试剂盒　北京天根生化科技有限公司　胞滞留于血窦腔内，进一步穿越血窦内皮细胞定植于脾　Ｓｒｙ引物设计与合成　大连宝生物工程有限公司　实质内ｌ　训。移植的肝细胞在脾实质内长期存活，发挥代　山羊抗小鼠ＡＩｂ多克隆抗体，　美国Ａｂｃａｍ公司　兔抗小鼠ＣＫ一１９多克隆抗体　谢、合成等功能，并大量增殖ｒ　一。。引。此外，肝细胞经脾　ＳＰ免疫组化试剂盒及ＤＡＢ显色剂　北京中杉金桥公司生物技术有限公司　移植后表达外源基因的能力也远远高于经腹腔或皮下　ＣＯ２培养箱　美国Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ公司　ＰＣＲ仪，凝胶成像分析系统　德国Ｅｐｐｅｎｄｏｆｆ公司　移植途径　。　光学显微镜　德国徕卡公司　从倒千里光碱腹腔注射联合２／３肝切除处理的小鼠　全自动生化分析仪　美国贝克曼库尔特公司　肝脏中可分离获得肝上皮样前体细胞系，在体外培养条　件下可被诱导分化为肝细胞和胆管上皮细　引。实验建　实验方法：　立ＣＣＩ　腹腔注射联合２／３肝切除诱导的大鼠急性肝损伤　细胞培养：肝上皮样前体细胞用含体积分数１　０％胎牛　模型，评价小鼠肝上皮样前体细胞经脾移植改善肝功能　血清的ＤＭＥＭ培养基置于３７℃，体积分数５％ＣＯ２培养　的作用，监测移植细胞在大鼠脾脏实质内的定植及分化　箱内培养。当细胞汇合度增大至８０％时胰蛋白酶消化、　成肝细胞的情况。　传代。用于移植的单细胞悬液行锥虫蓝染色后倒置光镜　下检查，保证细胞活力大于９０％。　１材料和方法Ｍａｔｅｒｉａｌｓ　ａｎｄ　ｍｅｔｈｏｄｓ　大鼠急性肝损伤模型的建立：６０只大鼠随机分为假手　术组，肝损伤组和细胞移植组，每组２０只。肝损伤组和　设计：随机对照动物实验。　细胞移植组大鼠接受一次腹腔注射ＣＣＩ４（１：１溶于玉米　｜ＳＳＮ　２０９５—４３４４　ｃＮ　２１．１　５８１，Ｒ　ｃｏＤＥＮ：ｚＬＫＨ，ａ　Ｈ　９１３３　乃真，等　异种爵裁体细匏移植滚疗急性盱损伤大鼠　油中），剂量是１　ｍＬ／ｋｇ。３　ｄ后，大鼠禁食１２　ｈ，４０　ｇ／Ｌ　水合氯醛腹腔注射麻醉后固定于鼠板。取腹部正中切　Ｅｌ，游离肝脏周围的韧带，显露大鼠肝脏，参照Ｈｉｇｇｉｎｓ　方法行２／３肝切除ｌ１　Ｊ，包括肝左外叶，左中叶，右中叶。　切除肝中叶时，应注意距离下腔静脉３．０－４．０　ｍｍ，避免　下腔静脉扭曲、狭窄；结扎左外叶应远离第二肝门，以　免影响其他肝叶静脉回流；切除肝叶应彻底，避免残留　肝组织缺血坏死影响肝再生。３组大鼠均于肝切除前１　ｄ　给予他克莫司灌胃，１　ｍｇ／ｋｇ，１次，ｄ，连续３周，以抑　制免疫排斥反应。　细胞移植：肝切除后，细胞移植组大鼠在无菌条件下　接受肝前体细胞移植。清晰暴露脾脏下级及脾门区，用　１　ｍＬ注射器经脾脏匀速、缓慢地注射０．５　ｍＬ　ＤＭＥＭ培　养液，内含５￣１０６肝前体细胞。注射时用棉签暂时性按　压脾门区，使移植细胞更多的保留在脾脏内，同时避免　门脉压力过高及血管栓塞的发生。肝损伤组大鼠注射　０．５　ｍＬ不含肝前体细胞的ＤＭＥＭ培养液。假手术组打开　腹腔后仅分离肝叶和脾脏，不行切除或移植。　免疫组织化学检测肝上皮样前体细胞ＣＫ．１　９／ＡＩｂ表达：取　对数生长期肝上皮样前体细胞以每孔１ｘｌ０５细胞数种植　于六孔板内。培养３６　ｈ后，细胞爬片从培养孔中取出，　ＰＢＳ冲洗后用体积分数１　Ｏ％中性甲醛固定，行免疫组化　分析。免疫组化染色采用链霉菌抗生物素蛋白一过氧化　物酶连结（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ・ｐｅｒｏｓｉｄａｓｅ，ＳＰ）法，一抗为兔抗　小鼠ＣＫ一１９多克隆抗体（工作浓度１：５０）和山羊抗小鼠　ＡＩｂ多克隆抗体（工作浓度１：５Ｏ），均４　ｏＣ孵育过夜。ＰＢＳ　冲洗后，加相应生物素标记的二抗，室温孵育１　ｈ，后　滴加辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素工作液，ＤＡＢ　显色。具体步骤参考试剂盒说明进行。免疫组织化学染　色之细胞爬片采图应用德国徕卡ＤＭ４０００Ｂ采图系统进　行采集，每张爬片随机采集５个视野。　标本留取：在肝切除后１，５，１４和２１　ｄ，处死实验　大鼠，每个时间点５只。经肝上下腔静脉取全血２－４　ｍＬ，　用回转半径１　５　ｃｍ的离心机１　５００　ｒ／ｍｉｎ离心２０　ｍｉｎ，取　上层澄清血清，置于一８Ｏ℃冰箱保存备用。同时取肝脏　标本用体积分数１　０％中性甲醛固定，２４　ｈ后石蜡包埋。　另外，取脾脏组织分成２份：一份用体积分数１０％中性　甲醛固定后石蜡包埋，用于免疫组织化学分析；另一份　用于提取脾脏基因组ＤＮＡ，行Ｓｒｙ序列的ＰＣＲ反应。　苏木精一伊红染色、血清转氨酶检测观察肝细胞损伤情况：　行肝脏组织苏木精一伊红染色评估病理学改变。由２位病　理医生双盲读片，重点观察肝切除后不同时间点肝细胞　损伤及炎症细胞浸润程度，光学显微镜２００ｘ镜下采集代　表性苏木精一伊红染色图像。一８０℃冻存血清采用全自　动生化分析仪测定血清丙氨酸转氨酶、天门冬氨酸转氨　酶　，比较各时间点转氨酶变化。　免疫组织化学法检测大鼠脾脏组织ＣＫ一１　９￣ｌ：ＩＡＩｂ表达：取　９１３４　～。一。　脾脏标本用体积分数１０％中性甲醛固定，石蜡包埋，　３　ｌＪｍ切片，分别以抗ＣＫ－１９抗体（工作浓度为１：１００）和　抗ＡＩｂ抗体（工作浓度为１：２００）４℃过夜孵育，后以ＳＰ　法按试剂盒说明染色。选取每个脾脏标本中段切片３张，　每张切片随机选择３个视野采集图像。　ＰＣＲ￣Ｚ－－扩增Ｓｒｙ序列：切取小块的新鲜脾脏组织，提　取基因组ＤＮＡ，－２０℃冻存备用。针对Ｙ染色体特异性　Ｓｒｙ序列行ＰＣＲ反应，以证实雄性小鼠来源的肝上皮样　前体细胞在雌性大鼠脾脏实质内存活、定植。以肝上皮　样前体细胞的基因组ＤＮＡ为阳性对照。上游引物是：５’．　ＴＧＧ　ＧＡＣ　ＴＧＧ　ＴＧＡ　ＣＡＡ　ＴＴＧ　ＴＣ．３’，下游引物是：　５’一ＧＡＧ　ＴＡＣ　ＡＧＧ　ＴＧＴ　ＧＣＡ　ＧＣＴ　ＣＴ－３’　”。２５　ＵＬ的　ＰＣＲ反应体系中含１２．５　ｐＬ　ＰＣＲ　ｍｉｘｔｕｒｅ，上下游引物各　１　ｌＪＬ（１　０　ｍｍｏｌ／Ｌ），：￣５００　ｎｇ基因组ＤＮＡ。反应条件是　９４℃３　ｍｉｎ，９４℃３０　Ｓ，５４℃３０　Ｓ，７２℃３０　Ｓ，３５　个循环，最后７２℃延长５　ｍｉｎ。ＰＣＲ反应产物在含溴化　乙锭的２％琼脂糖凝胶上电泳，预计可见４０２　ｂｐ大小的　反应产物。　主要观察指标：①各组大鼠肝脏病理表现。②各组　大鼠血清转氨酶变化。￣ｓｒｙ序列的ＰＣＲ扩增。④移植　前后ＡＩｂ、ＣＫ．１　９在肝上皮样前体细胞中的表达。　统计学分析：全部数据采用ＳＰＳＳ　１３．０进行分析，　结果以　ｓ表示，采用单因素方差分析。Ｐ＜０．０５认为差　异有显著性意义。　２结果Ｒｅｓｕｌｔｓ　２＿１　实验动物数量分析　６０只大鼠全部进入结果分　析，无脱失。　２．２肝上皮样前体细胞形态肝上皮样前体细胞呈上　皮样细胞形态，细胞核大而明显。肝上皮样前体细胞生　长旺盛，倍增时间平均为２４　ｈ，多在贴壁后两三天达　到约８Ｏ％的汇合度，胰酶消化传代。可在体外培养＞６　个月时间，传代５０次以上。连续传代对肝上皮样前体　细胞细胞形态和增殖能力无明显影响。取对数生长期　肝上皮样前体细胞消化重悬得到单细胞悬液，锥虫蓝　染色示大于９０％细胞拒染呈无色透明状，用于下一步　移植实验。　２．３肝脏病理学表现在肝切除后１，５，１４３１１２１　ｄ取　肝脏组织行苏木精一伊红染色检查。假手术组无明显肝　组织学异常。ＣＣＩ　腹腔注射联合２／３肝切除处理诱导的　急性肝损伤表现为肝细胞广泛水肿，体积明显增大，肝　血窦腔受压变窄，肝细胞胞浆疏松化，可见散在的嗜酸　性变性，并有点状坏死伴炎症细胞浸润。细胞移植组大　鼠肝细胞水肿较肝损伤组显著改善。在细胞移植后　２１　ｄ，肝细胞肿胀消失，大部分肝细胞结构正常，无炎　症细胞浸润，见图１。　Ｐ０，Ｂｏｘ　１２００，Ｓｈｅｎｙａｎｇ　１１０００４　ｗｗｗ．ＣＲＴＥＲ．ｏｒｇ　乃真。等　异种翳前体细匏移植治疗急性盱损伤大鼠　命名为肝上皮样前体细胞。大鼠脾脏微环境与肝脏类似，　不仅能保证移植细胞的植入、存活及增殖，还能调节、　促进基因表达。定植于脾脏的肝细胞具有代谢、合成功　能，而且定植位置不同能诱导基因差异表达ｌ　。　３３－３５］。脾　脏植入的肝细胞表达外源基因的能力也远远高于经腹　腔或皮下移植途径Ｉ］　。另外，经脾移植简便易行，有容　纳移植细胞的空间而不易导致门脉压力过高或血管栓　塞，安全性高。实验监测了移植后３周内肝前体细胞在　脾脏内的植入及向肝细胞方向分化的情况。针对Ｙ染色　体特异性Ｓｎ／序列的ＰＣＲ反应证实了雄性小鼠来源的肝　上皮样前体细胞在雌性大鼠脾脏内的存在。ＣＫ．１　９免疫　组化更直观地显示了移植肝上皮样前体细胞在大鼠脾　脏实质内大量定植。肝上皮样前体细胞在体外培养条件　下不表达肝细胞特异性分子标志物ＡＩｂ，不过在植入脾　脏５　ｄ后有部分细胞显著表达，而且Ａｌｂ阳性细胞数逐渐　增多，提示脾脏微环境能诱导肝上皮样前体细胞向肝细　胞方向分化。不过，其确切的分子机制还不明确，需要　进一步深入研究。　实验所用的肝上皮样前体细胞是利用胶原酶消化　法和胰蛋白酶选择性消化法从倒千里光碱腹腔注射联　合２／３肝切除小鼠肝脏中分离、纯化得到的肝上皮细胞　系。在单层贴壁培养条件下，而无需额外添加特异性生　长因子，肝上皮样前体细胞即可长期、稳定的扩增，同　时仍保留双向分化潜能。较成熟肝细胞体外培养多需要　３Ｄ培养技术及添加特殊的生长因子　，培养１周内其　功能、表型逐步丧失，肝前体细胞的培养无疑更简便易　行，经济实用。此外，肝上皮样前体细胞从致癌剂倒千　里光碱处理的肝脏中分离得到，表达肝癌标志物ＡＦＰ　等，表现出未分化的细胞形态，提示有可能恶性转化生　成肝细胞癌　圳。肝上皮样前体细胞ＬＥＰＣｓ可在体外培养　长达１８个月，传代超过７０次，发现仍保持正常核型　３８＋ＸＹ，种植入裸鼠皮下未见肿瘤形成。Ｗａｎｇ－￣ｐ　从　接受胆碱缺乏乙硫氨基酪酸补充饮食的大鼠分离出肝　前体细胞，在体外培养时间超过２年，传代高达１００次，　不会抑制肝前体细胞的增殖、双向分化潜能，也不会诱　导恶性转化。Ｐｉｓｃａｇｌｉａ－￣［４￣］研究发现口服２一氨基乙酰芴　联合２／３肝切除激活的肝前体细胞在暴露于黄曲霉毒素　ｂ１的环境下可发生恶性转变，生成肝细胞癌和胆管细胞　癌。这些结果提示肝前体细胞不会自发形成肿瘤起始细　胞，不过对致癌因素易感，在肝前体细胞移植实验中需　要充分考虑到这一点。　总之，在ＣＣＩ　腹腔注射联合２／３肝切除诱导的大鼠　急性肝损伤模型中，肝前体细胞经脾脏移植后能在脾脏　实质内存活、植入并进一步分化为有功能的肝细胞。在　这一过程中，移植的肝前体细胞能改善肝功能，促进损　伤肝细胞的修复。肝前体细胞移植治疗急性肝衰竭处在　研究的早期阶段，是很有前景的新疗法。　｜ＳＳＮ　２０９５－４３４４　ｃＮ　２１－１　５８１，Ｒ　ｃｏＤＥＮ：ｚＬＫＨＡＨ　ｗ　ｃ一。　考贡旃　万真负责整个课题的实施、实验资料的整理及　文稿的撰写，郑幸龙、马佳和向俊西帮忙完成大鼠急性肝损伤　模型的制备及细胞移植，马锋和王浩华负责实验资料的分析，　吕毅和张晓刚是课题的设计者并对课题负责。　益矽　芑课题未涉及任何厂家及相关雇主或其他经济组　织直接或间接地经济或利益的帮助。　伦璎要费实验过程中对动物的处置完全符合２００９年　Ｅｔｈｉｃａｌ　ｉｓｓｕｅｓ　ｉｎ　ａｎｉｍａｌ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ））相关动物伦理学　标准的条例。　学　成体肝脏前体细胞一因细胞核呈卵圆形，又称　之为卵圆细胞。其位于门管区，在肝严重受损同时成熟肝细胞　增殖受抑制时大量活化、增殖，并沿肝小叶延伸，进一步分化　生成肝细胞完成受损肝脏的修复。　者翩文章为原创作品，数据准确，内容不涉及泄密，　无一稿两投，无抄袭，无内容剽窃，无作者署名争议，无与他　人课题以及专利技术的争执，内容真实，文责自负。　４参考文献Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ　…　Ｊｉｎｄａｌ　Ａ，Ｋｕｍａｒ　Ｍ，Ｓａｒｉｎ　ＳＫ．Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ　ｏｆ　ａｃｕｔｅ　ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　Ｂ　ａｎｄ　ｒｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　Ｂ．Ｌｉｖｅｒ　Ｉｎｔ．２０１　３；３３　Ｓｕｐｐｌ　１：　１６４—１７５．　［２　２】Ｋａｒｓａｎ　ＨＡ，Ｐａｒｅｋｈ　Ｓ．Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ　ｏｆ　ａｌｃｏｈｏｌｉｃ　ｈｅｐａｔｉｔｉｓ：　Ｃｕｒｒｅｎｔ　ｃｏｎｃｅｐｔｓ．Ｗｏｄｄ　Ｊ　Ｈｅｐａｔｏ１．２０１　３；４（１２）：３３５－３４１．　【３】　Ｓｕｋ　ＫＴ，Ｋｉｍ　ＤＪ．Ｄｒｕｇ—ｉｎｄｕｃｅｄ　ｌｉｖｅｒ　ｉｎｊｕｒｙ：ｐｒｅｓｅｎｔ　ａｎｄ　ｆｕｔｕｒｅ．　Ｃｌｉｎ　Ｍｏｌ　Ｈｅｐａｔｏ１．２０１２；１８（３）：２４９—２５７．　【４】　Ｂｅｒｎａｌ　Ｗ，Ｈｙｙｒｙｌａｉｎｅｎ　Ａ，Ｇｅｒａ　Ａ，ｅｔ　ａ１．Ｌｅｓｓｏｎｓ　ｆｒ０ｍ　ｌｏｏｋ－ｂａｃｋ　ｉｎ　ａｃｕｔｅ　ｌｉｖｅｒ　ｆａｉｌｕｒｅ？Ａ　ｓｉｎｇｌｅ　ｃｅｎｔｒｅ　ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅ　ｏｆ　３３００　ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｊ　Ｈｅｐａｔｏ１．２０１　３；５９（１）：７４－８０．　【５】　Ｊｅｌｎｅｓ　Ｐ，Ｓａｎｔｏｎｉ—Ｒｕｇｉｕ　Ｅ，Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ　Ｍ，ｅｔ　ａ１．Ｒｅｍａｒｋａｂｌｅ　ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ　ｄｉｓｐｌａｙｅｄ　ｂｙ　ｏｖａｌ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　ｒａｔ　ａｎｄ　ｍｏｕｓｅ　ｍｏｄｅｌｓ　ｏｆ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ—ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｌｉｖｅｒ　ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ．　２００７：４５（６）：１４６２—１４７０．　【６】　Ｗａｎｇ　Ｘ，Ｆｏｓｔｅｒ　Ｍ，ＡＩ－Ｄｈａｌｉｍｙ　Ｍ，ｅｔ　ａ１．Ｔｈｅ　ｏｒｉｇｉｎ　ａｎｄ　ｌｉｖｅｒ　ｒｅｐｏｐｕｌａｔｉｎｇ　ｃａｐａｃｉｔｙ　ｏｆ　ｍｕｒｉｎｅ　ｏｖａｌ　ｃｅｌｌｓ．Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　Ｕ　ＳＡ．２００３；１００　ｓｕｐｐｌ　１：１１８８１—１１８８８．　【７】Ｄｕｎｃａｎ　ＡＷ，Ｄｏｒｒｅｌｌ　Ｃ，Ｇｒｏｍｐｅ　Ｍ．Ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ　ａｎｄ　ｌｉｖｅｒ　ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ．２００９；１３７（２）：４６６－４８１．　【８】　Ｚｈａｎｇ　Ｗ，Ｔｕｃｋｅｒ－Ｋｅｌｌｏｇｇ　Ｌ，Ｎａｒｍａｄａ　ＢＣ，ｅｔ　ａ１．Ｃｅｌｌ－ｄｅｌｉｖｅｒｙ　ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ　ｆｏｒ　ｌｉｖｅｒ　ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ａｄｖ　Ｄｒｕｇ　Ｄｅｌｉｖ　Ｒｅｖ．２０１　０；　６２（７—８）：８１４—８２６．　【９】　Ｇｕｐｔａ　Ｓ，Ｒａｊｖａｎｓｈｉ　Ｐ，Ｓｏｋｈｉ　Ｒ，ｅｔ　ａ１．Ｅｎｔｙｒ　ａｎｄ　ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ　ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ　ｉｎ　ｒａｔ　ｌｉｖｅｒ　ｐｌａｔｅｓ　ｏｃｃｕｒ　ｂｙ　ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｅｐａｔｉｃ　ｓｉｎｕｓｏｉｄａｌ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ．１　９９９；２９（２）：　５０９．５１　９．　【１０】Ｒａｊｖａｎｓｈｉ　ＫｅｒｒＡ，Ｂｈａｒｇａｖａ　ＫＫ，ｅｔ　ａ１．Ｓｔｕｄｉｅｓ　ｏｆ　ｌｉｖｅｒ　ｒｅｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ　ｕｓｉｎｇ　ｔｈｅ　ｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌ　ｐｅｐｔｉｄａｓｅ　ＩＶ－ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ　ｒａｔ　ａｎｄ　ｏｔｈｅｒ　ｒｏｄｅｎｔ　ｒｅｃｉｐｉｅｎｔｓ：ｃｅｌｌ　ｓｉｚｅ　ａｎｄ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ　ｒｅｇｕｌａｔｅ　ｃａｐａｃｉｔｙ　ｆｏｒ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ　ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ　ｍａｓｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｌｉｖｅｒ　Ｉｏｂｕｌｅ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ．１　９９６；２３（３）：　４８２－４９６．　【１１】Ｔｉｒｎｉｔｚ－Ｐａｒｋｅｒ　ＪＥ，Ｔｏｎｋｉｎ　ＪＮ，Ｋｎｉｇｈｔ　Ｂ，ｅｔ　ａ１．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，ｃｕｌｔｕｒｅ　ａｎｄ　ｉｍｍｏｒｔａｌｉｓａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｅｐａｔｉｃ　ｏｖａｌ　ｃｅｌｌｓ　ｆｒ０ｍ　ａｄｕｌｔ　ｍｉｃｅ　ｆｅｄ　ａ　ｃｈｏｌｉｎｅ－ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ，ｅｔｈｉｏｎｉｎｅ—ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ　ｄｉｅｔ．Ｉｎｔ　Ｊ　Ｂｉｏｃｈｅｍ　ＣｅｌＩ　Ｂｉｏ１．２００７；３９（１　２）：２２２６—２２３９．　９１３７　乃真．等　异种盱蘸体细匏移植治疗急性肝损｛兔犬鼠　【１２】Ｔａｎａｋａ　Ｍ，Ｍｉｙａｊｉｍａ　Ａ．Ｉｄｅｎｔｉｉｆｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｄｕｆｆ　Ｉｉｖｅｒ　ｓｔｅｍ／ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ　ｃｅｌｌｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　ＭｏＩ　Ｂｉｏ１．２０１　１；８２６：２５．３２．　【１　３】Ｄｏｌｌｅ　Ｌ，Ｂｅｓｔ　Ｊ，Ｅｍｐｓｅｎ　Ｃ，ｅｔ　ａ１．Ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ　ｉｏｓｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｌｉｖｅｒ　ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ　ｃｅｉｌｓ　ｂｙ　ａｌｄｅｈｙｄｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｉｎ　ｎａｉｖｅ　ｍｉｃｅ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ．２０１１；５５（２）：５４０—５５２．　【１　４】Ｃｈｅｎｇ　Ｋ，Ｂｅｎｔｅｎ　Ｄ，Ｂｈａｒｇａｖａ　Ｋ，ｅｔ　ａ１．Ｈｅｐａｔｉｃ　ｔａｒｇｅｔｉｎｇ　ａｎｄ　ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｆｅｔａＩ　Ｉｉｖｅｒ　ｓｔｅｍ／ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ　ｃｅｌｌｓ　ａｎｄ　ａｄｕｌｔ　ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ　ｉｎ　ｍｉｃｅ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ．２００９；５０（４）：　１１９４．１２０３．　［１　５】Ｍａｇａｎｔｏ　Ｐ　Ｃｉｅｎｆｕｅｇｏｓ　ＪＡ，Ｓａｎｔａｍａｒｉａ　Ｌ，ｅｔ　ａ１．Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｃｉｃｌｏｓｐｏｒｉｎ　ｏｎ　ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ　ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ　ｔｒａｎｓＤｌａｎｔａｔｉＯｎ：ａ　ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ　ｓｔｕｄｙ．Ｅｕｒ　Ｓｕｒｇ　Ｒｅｓ．１　９８８；２０（４）：２４８－２５３．　【１６】Ｃｈｅｎ　Ｌ，Ｄａｖｉｓ　ＧＪ，Ｃｒａｂｂ　ＤＷ，ｅｔ　ａ１．Ｉｎｔｒａｓｐｌｅｎｉｃ　ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｐｅｒｉｐｏｒｔａｌ　ａｎｄ　ｐｅｒｉｖｅｎｏｕｓ　ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ　ａｓ　ａ　ｌｏｎｇ—ｔｅｒｍ　ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　ｓｔｕｄｙ　ｏｆ　ｌｉｖｅｒ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ．１９９４；１９ｆ４）：９８９－９９８．　【１７】　Ｇｕｐｔａ　Ｓ，Ｖｅｍｕｒｕ　ＲＰ　Ｌｅｅ　ＣＤ，ｅｔ　ａ１．Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ　ｅｘｈｉｂｉｔ　ｓｕｐｅｒｉｏｒ　ｔｒａｎｓｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｆｔｅｒ　ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ　ｉｎｔｏ　Ｉｉｖｅｒ　ａｎｄ　ｓｐｌｅｅｎ　ｃｅｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ　ｃａｖｉｔｙ　ｏｒ　ｄｏｒｓａｌ　ｆａｔ　ｐａｄ：　ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｆｏｒ　ｈｅｐａｔｉｃ　ｇｅｎｅ　ｔｈｅｒａｐｙ．Ｈｕｍ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒ．１　９９４：　５（８）：９５９－９６７．　【１８】Ｌｉ　ＷＬ，Ｓｕ　Ｊ，Ｙａｏ　ＹＣ．ｅｌ　ａ１．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｂｉｐｏｔｅｎｔ　ｌｉｖｅｒ　ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ　ｅｃｌｌｓ　ｆｒ０ｍ　ａｄｕｌｔ　ｍｏｕｓｅ．Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ．　２００６：２４（２）：３２２—３３２．　【１　９】　Ｍａｒｔｉｎｓ　ＰＮＡ，Ｔｈｅｒｕｖａｔｈ　Ｔ　Ｎｅｕｈａｕｓ　Ｐ　Ｒｏｄｅｎｔ　ｍｏｄｅｌｓ　ｏｆ　ｐａｒｔｉａｌ　ｈｅｐａｔｅｃｔｏｍｉｅｓ．Ｌｉｖｅｒ　Ｉｎｔ．２００８；２８（１、：３－１　１．　【２０】Ｌａｍｂｅｒｔ　ＪＦ，Ｂｅｎｏｉｔ　ＢＯ，Ｃｏｌｖｉｎ　ＧＡ，ｅｔ　ａｌ＿Ｑｕｉｃｋ　ｅｓｘ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｏｕｓｅ　ｆｅｔｕｓｅｓ．Ｊ　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ　Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０００；　９５（２）：１　２７—１　３２．　【２１　１　Ｓｅｎｉｏｒ　ＪＲ．Ａｌａｎｉｎｅ　ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ：ａ　ｃｌｉｎｉｃａｌ　ａｎｄ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　ｔｏｏｌ　ｆｏｒ　ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ　ｌｉｖｅｒ　ｉｎｊｕｒｙ－ｐａｓｔ．ｐｒｅｓｅｎｔ，ａｎｄ　ｆｕｔｕｒｅ．Ｃｌｉｎ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ　Ｔｈｅｎ　９２（３）：３３２—３３９．　【２２】Ｌｅｅ　ＷＭ，Ｓｑｕｉｅｒｓ　ＲＨ　Ｊｒ，Ｎｙｂｅｒｇ　ＳＬ，ｅｔ　ａ１．Ａｃｕｔｅ　ｌｉｖｅｒ　ｆａｉｌｕｒｅ：　Ｓｕｍｍａｒｙ　ｏｆ　ａ　ｗｏｒｋｓｈｏｐ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ．２００８：４７（４）：１４Ｏ１—１４１５．　【２３】Ｚａｒｒｉｎｐａｒ　Ａ，Ｂｕｓｕｆｉｆｌ　ＲＷ．Ｌｉｖｅｒ　ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ：ｐａｓｔ，ｐｒｅｓｅｎｔ　ａｎｄ　ｆｕｔｕｒｅ．Ｎａｔ　Ｒｅｖ　ＧａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏＩ　Ｈｅｐａｔｏ１．２０１３：１０（７）：　４３４－４４０．　［２４】Ｍｉｃｈａｌｏｐｏｕｌｏｓ　ＧＫ．Ｌｉｖｅｒ　ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ａｆｔｅｒ　ｐａｒｔｉａｌ　ｈｅｐａｔｅｃｔｏｍｙ：ｃｒｉｔｉｃａｌ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｍｅｃｈａｎｉｓｔｉｃ　ｄｉｌｅｍｍａｓ．Ａｍ　Ｊ　Ｐａｔｈｏ１．２０１　０；１　７６（１、：２－１　３．　［２５】Ｚｈａｎｇ　Ｈ，Ｌｉｕ　Ｚ，Ｌｉ　Ｒ，ｅｔ　ａ１．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｓｍａｌｌ　ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ　ｉｎｄｕｃｅｓ　ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｉｎｊｕｒｅｄ　ｌｉｖｅｒ　ｉｎ　ａｄｕｌｔ　ｒａｔ．　Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ　Ｐｒｏｃ．２００９；４１（９）：３８８７．３８９２．　【２６】Ｍｏｃｈｉｚｕｋｉ　Ｓ，Ｋａｗａｓｈｉａｔ　Ｙ　Ｅｇｕｃｈｉ　Ｓ，ｅｔ　ａ１．Ｌｉｖｅｒ　ｒｅｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ　ｂｙ　ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ　ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ　ｉｎ　ａ　ｒａｔ　ｍｏｄｅＩ　ｏｆ　ａｃｕｔｅ　ｌｉｖｅｒ　ｆａｉｌｕｒｅ｛ｎｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ｃａｒｂｏｎ　ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｉｄｅ　ａｎｄ　ａ　ｐａｒｔｉａｌ　ｈｅｐａｔｅｃｔｏｍｙ．Ａｎｎ　Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．２０１０；１５（４）：４９－５５．　９１３８　ＷＷＷ．ＣＲＴＥＲ．ｏｒｇ　【２７】Ｆａｒｂｅｒ　Ｅ．Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ｅａｒｌｙ　ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ　ｃｈａｎｇｅｓ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｌｉｖｅｒ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｒａｔ　ｂｙ　ｅｔｈｉｏｎｉｎｅ，　２－ａｃｅｔｙｌａｍｉｎｏ－ｌｆｕｏｒｅｎｅ，ａｎｄ　３＇－ｍｅｔｈｙｌ－４－ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏａｚｏｂｅｎｚｅｎｅ．Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．１　９５６；　１６（２）：１４２・１４８．　［２８】Ｙａｓｕｉ　Ｏ，Ｍ　Ｊｕｒａ　Ｎ，Ｔｅｒａｄａ　Ｋ，ｅｔ　ａ１．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｏｖａｌ　ｃｅｌｌｓ　ｆｒｏｍ　Ｌｏｎｇ—Ｅｖａｎｓ　Ｃｉｎｎａｍｏｎ　ｒａｔｓ　ａｎｄ　ｔｈｅｉｒ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｉｎｔｏ　ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ　ｉｎ　ｖｉｖｏ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｒａｔ　ｌｉｖｅｒ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ．１　９９７；２５（２）：　３２９．３３４．　【２９】Ｓｏｎｇ　Ｓ，Ｗｉｔｅｋ　Ｒ　Ｌｕ　ｅｔ　ａ１．Ｅｘ　ｖｉｖｏ　ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ　ｌｉｖｅｒ　ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ　ｅｃｌｌｓ　ａｓ　ａ　ｐｌａｔｆｏｒｍ　ｆｏｒ　ｇｅｎｅ　ｔｈｅｒａｐｙ　ｉｎ　ｍｉｃｅ．　Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ．２００４；４０（４）：９１　８　９２４．　【３０］Ｏｅｒｔｅｌ　Ｍ，Ｓｈａｆｒｉｔｚ　ＤＡ．Ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ，ｃｅｌｌ　ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｌｉｖｅｒ　ｒｅｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ．Ｂｉｏｃｈｉｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ａｃｔａ．２００８；１　７８２（２）：　６１－７４．　【３１１　Ｒｏｓｋａｍｓ　ＴＡ．Ｔｈｅｉｓｅ　ＮＤ，Ｂａｌａｂａｕｄ　Ｃ，ｅｔ　ａ１．Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｆｉｎｅｒ　ｂｒａｎｃｈｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｂｉｌｉａｒｙ　ｔｒｅｅ：ｃａｎａｌｓ，ｄｕｃｔｕｌｅｓ，ａｎｄ　ｄｕｃｔｕｌａｒ　ｒｅａｃｔｉｏｎｓ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ｌｉｖｅｒｓ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ．２００４；３９（６）：　１７３９－１７４５．　【３２】Ｌｉｂｂｒｅｃｈｔ　Ｌ，Ｒｏｓｋａｍｓ　Ｈｅｐａｔｉｃ　ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ　ｅｃｌｌｓ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　Ｉｉｖｅｒ　ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｓｅｍｉｎ　ＣｅｌＩ　Ｄｅｖ　Ｂｉｏ１．２００２；１　３（６）：３８９．３９６．　【３３】Ａｈｍａｄ　ＴＡ．Ｓｔｕｄｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｓｕｒｖｉｖａｌ　ｏｆ，ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ　ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｓｐｌｅｅｎ　ｉｎ　ｒａｔｓ．Ｈｅｐａｔｏｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ．２０１　１；５８　（１０７—１０８）：８９２・８９５．　【３４】Ｆｕｋｕｄａ　Ｋ，Ｓｕｇｉｈａｒａ　Ａ，Ｎａｋａｓｈｏ　Ｋ，ｅｔ　ａ１．Ｔｈｅ　ｏｒｉｇｉｎ　ｏｆ　ｂｉｌｉａｒｙ　ｄｕｃｔｕｌａｒ　ｃｅｌｌｓ　ｔｈａｔ　ａｐｐｅａｒ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｓｐｌｅｅｎ　ａｆｔｅｒ　ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ．Ｃｅｌｌ　Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．２００４；１３（１１：２７－３３．　【３５】Ｎａｇａｔａ　Ｈ，Ｉｔｏ　Ｍ，Ｃａｉ　Ｊ，ｅｔ　ａ１．Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｏｆ　ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ　ａｎｄ　ｌｉｖｅｒ　ｆａｉｌｕｒｅ　ｉｎ　ｒａｔｓ　ｂｙ　ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ　ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．　Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ．２００３；１　２４（２）：４２２－４３１．　【３６】ｌｌｏ　Ｈ，Ｋａｍｉｙａ　Ａ，Ｉｔｏ　Ｋ，ｅｔ　ａ１．Ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｅｘｐａｎｓｉｏｎ　ａｎｄ　ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｒｅｃｏｖｅｒｙ　ｏｆ　ｍａｔｕｒｅ　ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ　ｆｒ０ｍ　ｍｏｕｓｅ　ａｄｕｌｔ　ｌｉｖｅｒ．Ｌｉｖｅｒ　ｌｎ１．２Ｏ１　２；３２（４）：５９２－６０１．　【３７】Ｔａｋａｙａｍａ　Ｋ，Ｋａｗａｂａｔａ　Ｋ，Ｎａｇａｍｏｔｏ　ｅｔ　ａ１．３Ｄ　ｓｐｈｅｒｏｉｄ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｏｆ　ｈＥＳＣ，ｈｉＰＳＣ－ｄｅｒｉＶｅｄ　ｈｅｐａｔｏｃ￣ｅ—ｌｉｋｅ　ｃｅｌｌｓ　ｆｏｒ　ｄｒｕｇ　ｔｏｘｉｃｉｔｙ　ｔｅｓｔｉｎｇ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．２０１　２；３４（７）：１　７８１－１　７８９．　［３８】Ｗｕ　Ｋ，Ｄｉｎｇ　Ｊ，Ｃｈｅｎ　Ｃ，ｅｔ　ａ１．Ｈｅｐａｔｉｃ　ｔａｒｎｓｆｏｒｍｉｎｇ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　ｂｅｔａ　ｇｉｖｅｓ　ｒｉｅｓ　ｔｏ　ｔｕｍｏｒ－ｉｎｉｔｉａｔｉｎｇ　ｃｅｌｌｓ　ａｎｄ　ｐｒｏｍｏｔｅｓ　ｌｉｖｅｒ　ｃａｎｃｅｒ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ．２０１２；５６（６）：　２２５５．２２６７．　【３９】　Ｗａｎｇ　Ｐ’Ｃｏｎｇ　Ｍ，Ｌｉｕ　ＴＨ，ｅｌ　ａ１．Ｐｒｉｍａｒｙ　ｉｏｓｌａｔｅｄ　ｈｅｐａｔｉｃ　ｏｖａｌ　ｃｅｉｌｓ　ｍａｉｎｔａｉｎ　ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ　ｃｅｌｌ　ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ　ａｆｔｅｒ　ｔｗｏ－ｙｅａｒ　ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ　ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｊ　Ｈｅｐａｔｏ１．２０１０；５３（５）：８６３－８７１．　【４０】Ｐｉｓｃａｇｌｉａ　ＡＣ．Ｓｈｕｐｅ　ＴＤ，Ｐａｎｉ　Ｇ　ｅｌ　ａ１．Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ　ｏｆ　ｃａｎｃｅｒ　ｅｃｌｌ　ｌｉｎｅｓ　ｆｒ０ｍ　ｒａｔ　ｈｅｐａｔｏｃｈｏｌａｎｇｉｏｃａｒｃｉｎｏｍａ　ａｎｄ　ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｒｏｌｅ　ｏｆ　ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ－ｃｏｌｏｎｙ　ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ　ｆａｃｔｏｒ　ａｎｄ　ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　ｉｎ　ｔｈｅｉｒ　ｇｒｏｗｔｈ，ｍｏｔｉｌｉｔｙ　ａｎｄ　ｓｕｒｖｉｖａ１．Ｊ　Ｈｅｐａｔｏ１．２００９；５１（１）：７７－９２．　ＰＯ．Ｂｏｘ　１２００，Ｓｈｅｎｙａｎｇ　１１０００４　ｗｗｌ＆ＬＣＲＴＥＲ　ｏｒｇ